Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von orthotopischen Xenograft-Modellen durch intravesische Instillation hochwertiger urotheliaaler Zellkarzinomzellen oder intrarekt injizierende Darmkrebszellen in nicht-fettleibige diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID) Mäuse für primäres Tumorwachstum und spontane Metastasen unter dem Einfluss von Lymphknoten-Stromalzellen, die das Fortschreiten menschlicher metastasierender Erkrankungen imitieren.

Zusammenfassung

Krebspatienten haben schlechte Prognosen, wenn Lymphknoten (LN) Beteiligung sowohl in hochgradigen urotheliale Zellkarzinom (HG-UCC) der Blase und Dickdarmkrebs (CRC) vorhanden ist. Mehr als 50% der Patienten mit muskelinvasivem UCC werden trotz kurativer Therapie für klinisch lokalisierte Krankheiten metastasen und innerhalb von 5 Jahren sterben, und metastasierendes CRC ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle in den USA. Xenograft-Modelle, die UCC- und CRC-Metastasen bei Patienten konsequent imitieren, werden benötigt. Diese Studie zielt darauf ab, patientenabgeleitete orthotopische Xenograft (PDOX)-Modelle von UCC und CRC für primäres Tumorwachstum und spontane Metastasen unter dem Einfluss von LN-Stromalzellen zu generieren, die das Fortschreiten menschlicher metastasierender Erkrankungen für das Arzneimittelscreening imitieren. Frische UCC- und CRC-Tumoren wurden von einvernehmlichen Patienten gewonnen, die sich einer Resektion für HG-UCC bzw. kolorektales Adenokarzinom unterziehen. Ko-inokuliert mit LN-Stromalzellen (LNSC) analogen HK-Zellen wurden luziferase-markierte UCC-Zellen intravesisch (IB) in weibliche nicht-fettleibige diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID)-Mäuse eingeflößt, und CRC-Zellen wurden intrarektifal (IR) in nod/SCID-Mäusen. Tumorwachstum und Metastasen wurden wöchentlich mit Hilfe der Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) überwacht. Nach dem Opfer wurden Primärtumoren und Mausorgane geerntet, gewogen und formal für Hämatoxylin und Eosin und Immunhistochemie Färbung fixiert. In unseren einzigartigen PDOX-Modellen ähneln Xenograft-Tumoren Patienten-Präimplantationstumoren. In Gegenwart von HK-Zellen weisen beide Modelle hohe Tumorimplantationsraten auf, die mit BLI und Tumorgewichten gemessen werden, 83,3 % für UCC und 96,9 % für CRC und hohe Metastasenraten des entfernten Organs (33,3 % nachgewiesene Leber- oder Lungenmetastasierung für UCC und 53,1 % für CRC). Darüber hinaus haben beide Modelle null Sterblichkeit aus dem Verfahren. Wir haben einzigartige, reproduzierbare PDOX-Modelle für menschliche sHG-UCC und CRC etabliert, die Tumorbildung, Wachstum und Metastasierungsstudien ermöglichen. Mit diesen Modellen können Tests neuartiger therapeutischer Medikamente effizient und klinisch mimetisch durchgeführt werden.

Einleitung

Es hat sich gezeigt, dass Lymphknoten (LN) Metastasierung ein schlechter prognostischer Indikator in vielen soliden Organ-Malignitäten ist, einschließlich hochgradiges urothelialer Zellkarzinom (UCC) der Blase und Dickdarmkrebs (CRC)^1,2. Mehr als die Hälfte der Patienten mit muskelinvasivem UCC (MIUCC) wird trotz kurativer Therapie bei klinisch lokalisierten Erkrankungen Metastasen entwickeln und innerhalb von 5 Jahren sterben. Metastasierende CRC ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle in den USA.

Schätzungsweise 81.190 neue Patienten und 17.240 krebsspezifische Todesfälle werden 2018 in den Vereinigten Staaten aufgrund von UCC der Blase^3,4erwartet. Während die Patienten überwiegend (70%) bei nicht-muskelinvasiven Erkrankungen vorhanden sind, haben 30% MIUCC⁵. Trotz der kurativen Therapie (radikale Zystektomie [RC] mit oder ohne systemische Chemotherapie) bei klinisch lokalisierten Erkrankungen wird die Hälfte der Patienten mit MIUCC der Blase noch Metastasen entwickeln und innerhalb von 5 Jahren sterben³. Die Beteiligung von Lymphknoten findet sich bei ca. 20% bis 25% der Patienten, die RC^6,7,8. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei LN-positiven Patienten liegt selbst nach RC unter 35 %, was auf eine Beteiligung der LN als entscheidenden negativen Prädiktor für die Prognose bei UCC-Patienten hindeutet.

Darmkrebs ist die dritthäufigste Krebserkrankung bei Männern und Frauen in den Vereinigten Staaten. Die Patientenergebnisse hängen weitgehend von Tumoreigenschaften und Tumormikroumgebung ab, wie z. B. Invasionstiefe, LN-Beteiligung und entfernte Organmetastasen. Obwohl die Sterblichkeitsrate in CRC in den letzten zehn Jahren aufgrund von Screening und effektiven Operationen gesunken ist, wird geschätzt, dass fast 50% der CRC-Patienten Metastasen oder wiederkehrende Krankheiten entwickeln werden⁹.

Kleine Tiermodelle bieten eine schnelle, reproduzierbare und veränderbare Plattform, um die Tumorprogression und verschiedene metastasierende Muster zu untersuchen. Es gibt derzeit keine beschriebenen Xenograft-Modelle, die CRC- und UCC-Metastasen bei Patienten konsequent imitieren. Der primäre Weg der krebsfernen Metastasierung ist über lymphatische Ausbreitung. Neue Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die LNs Tumoren eine einzigartige Mikroumgebung bieten und nicht nur nur stationäre Ziele sind, bei denen Krebszellen vorübergehend passieren, sondern auch eine integrale Rolle spielen, indem sie mit Krebszellen im metastasierenden Prozess interagieren. Tatsächlich haben unsere Studien herausgefunden, dass neben der Aufklärung und Förderung der Tumorprogression und Metastasen auch die stromale Mikroumgebung von LN für die Arzneimittelresistenz in SCR^10,11verantwortlich ist. Unser Labor hat vor kurzem die tumorgene Wirkung von LN-Stromalzellen (LNSCs) auf CRC und UCCs mit patientenabgeleiteten orthotopischen Xenograft (PDOX) Mausmodellen^12,13bestätigt.

Die Entwicklung von PDOX-Modellen bietet eine wichtige Plattform für die translationale Krebsforschung^14,15. Durch die Aufrechterhaltung der wichtigsten histologischen und genetischen Eigenschaften ihres Spendertumors bleiben PDOX-Modelle über Passagen hinweg stabil und bilden gute Plattformen für die translationale Krebsforschung^12,15. PDOX-Modelle werden für die präklinische Arzneimittelbewertung, Biomarker-Identifikation und präklinische Bewertung personalisierter Arzneimittelstrategien verwendet, die eine Vorhersage klinischer Ergebnisse ermöglichen. Derzeit gibt es keine beschriebenen Xenograft-Modelle, die die Bedeutung der LN-Beteiligung berücksichtigen und in der Lage sind, primärtumor und entfernte Organmetastasen in CRC und UCC konsequent zu reproduzieren. In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung von PDOX-Modellen bei NOD/SCID-Mäusen mit Reproduktion von metastasierenden CRC- und UCC-Erkrankungen unter Beteiligung von LNSC.

Protokoll

Alle in diesen Tierstudien beschriebenen Methoden wurden nach den genehmigten Richtlinien des Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschusses des Ochsner Gesundheitssystems und in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Tierforschung durchgeführt. Alle Patiententumoren für diese Studie wurden von eingewilligten Patienten gesammelt, die sich in Übereinstimmung mit dem Ochsner Health System Investigative Review Board und den ethischen Standards des Institutionellen Ausschusses für Mensch und Gesundheitsschutz einer Krebsresektion unterziehen. experimentieren. Board-zertifizierte Pathologen am Ochsner Health System ermittelten die pathologischen Diagnosen von Patientenproben basierend auf den mikroskopischen Merkmalen von Tumorzellen, ihrem histologischen Typ und dem Grad.

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Schritte für zwei separate Xenograft-Modelle, ein UCC-Modell über die Elektrokauterisierung der Blasenwand zur Instillierung von UCC-Zellen und eine intrarektale Injektion von CRC-Zellen zur Untersuchung in einem CRC-Modell. Alle Schritte zur Vorbereitung und Überwachung der Experimente sind für beide Modelle identisch, während die Abschnitte 7 und 8 das Verfahren für die UCC-Instillation bzw. CRC-Injektion spezifisch beschreiben.

1. Kultivieren von Zelllinien

1. Wachsen Sie HK-Zellen in komplettem RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 2 nM Glutamin, 100 U/ml Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin bei 37 °C in einem 5%_CO2 befeuchteten Inkubator.
   ANMERKUNG: HK-Zellen sind normale menschliche follikuläre dendritische Zellen und können für 15 Passagen in vitro¹⁶angebaut und erweitert werden.
2. Um sich auf ein Experiment vorzubereiten, versuchen Sie die Zellen.
   1. Entfernen Sie die Medien und fügen Sie den Zellen 2 ml 1% Trypsin in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) hinzu. Legen Sie die Zellen 4 min lang wieder in den 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C.
   2. Sammeln Sie Zellen aus der Schale in ein 15 ml Rohr mit einer Handpipettenhilfe mit einer 10 ml serologischen Pipette befestigt. Fügen Sie 8 ml komplettes RPMI-1640 medium hinzu.
   3. Kombinieren Sie 40 l Zellen und 40 l Trypanblau in einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie einem Hämozytometer 10 L Mischung hinzu und zählen Sie lebende Zellen. Fügen Sie 1 Million Zellen in 25 ml komplettes RPMI-1640 Medium zu einer 150 mm sterilen Gewebekultur behandeltschale hinzu, um die Zellen weiter zu wachsen.
      HINWEIS: Die in diesem Schritt hergestellte HK-Zellsuspension muss innerhalb einer Stunde verwendet werden, um sich mit Tumorzellen zur Injektion zu mischen.

2. Patientenprobensammlung

1. Sammeln Sie die UCC-Tumoren von den eingewilligten Patienten 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) und 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) bei der Resektionschirurgie.
2. Sammeln Sie CRC-Tumoren von den eingewilligten Patienten 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) und 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) bei der Resektionschirurgie.

3. Erweiterung des Patiententumors

1. Sammeln Sie Tumore bei der Operation in kaltem sterilem McCoy-Medium, das Penicillin G (500 U/ml) und Streptomycin (500 mg/ml) enthält.
2. Implantattumoren direkt in die linke und rechte Flanke von 6-8 Wochen alten weiblichen NOD/SCID-Mäusen.
   1. Mit einer kleinen chirurgischen Schere zerkleinern Sie Gewebe mechanisch in kleine Stücke (ca. 1 mm³).
   2. Implantatgewebe subkutan auf der linken und rechten Flanke mit 13 G Knochenmark Aspiration Biopsie Nadeln.
      HINWEIS: Implantat ein Gesamtvolumen von 8 mm³ gleichmäßig auf beide Seiten der Flanke geteilt.

4. Tagging und Anreicherung von luziferase markierten Tumoren

1. Messen Sie das Tumorwachstum zweiwöchentlich mit einem digitalen Bremssattel.
2. Mit einem Durchmesser von 1 cm den Tumor abbilden. Direkte Injektion in den Tumor mit Einzeldosis Luc/red fluorescent protein (RFP)-lentivirus (50 l/Tumor, 1:30 Verdünnung aus konzentriertem High Titer Lentivirus-Bestand) mit einer 1-ccm-Spritze mit einer 27 G-Nadel.
   HINWEIS: Der Patiententumor erreicht in der Regel 1 cm Durchmesser in 1 bis 2 Monaten. Jedoch, die Wachstumsrate ist extrem variabel und basiert auf einer Reihe von Faktoren einschließlich Tumor-Grad und Typ.
3. Überwachen Sie den Tumor wöchentlich durch biolumineszierende Bildgebung (BLI) bei lebenden Tieren.
   1. Wiegen Sie die Mäuse. Injizieren Bewusste Maus mit 150 mg/kg Luziferin intraperitoneally und warten Sie 5 min, bis das Substrat im Körper der Maus zirkulieren.
   2. Anästhesisieren Sie die Maus mit 2,5% Isofluran in 100% Sauerstoff, 1 L/min in einer Induktionskammer.
   3. Legen Sie die Maus auf den Magen in eine BLI-Bildgebungsmaschine mit Isofluranfließen und Bild. Nehmen Sie sequenzielle Bilder auf, um das Vorhandensein von Luc/RFP-positiven Tumorregionen zu bestätigen (falsch-farbiges biolumineszierendes Bild). Zurück zur Maus in den Käfig, nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist.

5. Wählen Sie einen geeigneten Tumoranteil für die enzymatische Verdauung

1. Am Tag der UCC- oder CRC-Prozedur, Bildmaus mit Luziferase markiert Tumor wie in den Schritten 4.3.1-4.3.3.
   HINWEIS: Die Zeitspanne für das Wachstum des subkutanen Tumors hängt von der Geschwindigkeit des Tumorwachstums und der geplanten Anzahl der Tiere ab, die im Experiment injiziert werden sollen.
2. Ernte Tumor von Mausflanke und Bild.
   1. Euthanisieren Sie die Maus durch CO2-Inhalation nach der Bildgebung. Die Maus in die CO2-Kammer geben, Gas bei 1,4 l/min bis zum Atemstillstand einschalten und 3 min weitermachen. Folgen Sie dieser mit Zervixdislokation.
   2. Saubere Haut mit 70% Ethanol. Zelthaut direkt über Tumor. Mit chirurgischer Schere machen einen kleinen Schnitt in der Haut. Trennen Sie die Haut vom Tumor mit einer Schere.
   3. Tumor entfernen und in eine sterile Petrischale geben. Bild gesamte Schale in einer Bildgebungsmaschine.
3. Verwenden Sie sterile Schere oder Skalpell, um luziferase-negative Abschnitte von Luziferase-positiven Abschnitten im Tumor zu trennen und neu zu bilden.
4. Wiederholen Sie dies, bis nur noch die meisten hochpositiven Tumorstücke übrig sind.

6. Enzymatische Verdauung des Tumors

1. Unter laminarer Strömungshaube, mince luciferase positive Tumorstücke (Schritt 5.4) in die kleinstmöglichen Stücke mit sterilen chirurgischen Scheren und legen Sie sie in ein steriles 50 ml konisches Rohr.
   HINWEIS: Das Einschneiden des Tumors in die kleinstmöglichen Stücke ergibt mehr einzelliche Zellen.
2. Bereiten Sie die Verdauungslösung vor, indem Sie 10 ml Kollagennase IV (1,5 mg/ml), 80 l Hyaluronidase (20 mg/ml) und 160 l Desoxyribonuklease I (0,1 mg/ml) bis 40 ml HBSS hinzufügen. Mischen Sie die Lösung durch Invertieren.
3. Fügen Sie 35-40 ml der Verdauungslösung zu gehackten Tumor. Bei 37 °C mit kontinuierlicher Drehung für 2 h inkubieren.
   HINWEIS: Kräftig schütteln Rohr periodisch während der Inkubation, um zu verhindern, dass Tumorgewebe verklumpt.
4. Filtern Sie die gesamte Verdauung durch steriles 100-m-Zellsieb, gefolgt von einem 40-m-Zellsieb, um Schmutz zu entfernen. Speichern Sie den Durchfluss und entsorgen Sie Schutt.
5. Waschen Sie freie Zellen, indem Sie 20 ml HBSS und Zentrifuge bei 329 x g für 5 min hinzufügen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Pellet in 30 ml HBSS.
6. Kombinieren Sie 10 l Zelllösung und 90 l Trypan-Blau in einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte. Zählen Sie lebende Zellen mit einem Hemacytometer.
7. Übertragen Sie 1 x 10⁴ bis 1 x 10⁶ Tumorzellen pro Maus in ein steriles 15 ml konisches Rohr. Fügen Sie 3 x 10⁵ HK-Zellen ab Schritt 1.2.3 pro Maus in dieselbe Röhre mit Tumorzellen ein.
   HINWEIS: Verwenden Sie steriles 50 ml konisches Rohr, wenn das Gesamtvolumen 15 ml überschreitet. Berechnen Sie immer mehr Dosen für zusätzliche Tiere pro Studiengruppe, um den Flüssigkeitsverlust während des Spritzenkonsums zu berücksichtigen. Wenn eine Gruppe beispielsweise 5 Mäuse enthält, erstellen Sie genügend Zellen für 6 oder 7 Mäuse.
8. Zentrifuge bei 329 x g für 5 min. Verwerfen Überstand entweder durch Ansaug- oder Pipetten.
9. Resuspend-Zellen in 50 l pro Maus für UCC-Modell oder 10 l pro Maus für CRC-Modell in kompletten RPMI-Medien. Bewahren Sie die Zellsuspension auf Eis auf, bis sie einsatzbereit ist.

7. UCC-Mausmodell

1. Vorbereitung von Mäusen für den Eingriff
   1. Erhalten Sie sechs- bis acht Wochen alte weibliche NOD/SCID-Maus. Rasieren Sie die unteren Rückseiten der Maus mit Haarentfernung Creme. Anästhetisieren Sie die Maus in einer Induktionskammer mit Isofluran (2,5% in 100% Sauerstoff, 1 L/min).
   2. Einmal sediert, legen Sie die Maus in supine Position mit ihrer Schnarbe in einem Isofluran-Nasenkegel und nackten Rücken fest geerdet auf einer dispersiven Elektrode.
      HINWEIS: Die Maus ist vollständig sediert, wenn sie nicht auf Zehenkneifen reagiert.
2. Instillieren Von UCC-Zellen, die in Schritt 6.9 mit einem Angiokatheter in die Blase gebracht werden (Abbildung 1Aa,Ab).
   1. Richten Sie eine monopolare Elektrokautery-Maschine ein und stellen Sie eine Leistung von 4 W ein. Schmieren Sie einen 24 G sterilen Angiokatheter mit Schmiergelee und legen Sie durch Harnröhre der weiblichen Maus.
      HINWEIS: Leichter Widerstand kann zu spüren sein. Drücken Sie vorsichtig nach vorne oder entfernen Sie Angiocatheter und wiederholen. Nicht erzwingen. Wenn sich der Katheter beim Eintritt biegt, legen Sie einen sterilen Führungsdraht (siehe 7.2.2) auf halbem Weg in den Katheter ein, um Stabilität zu gewährleisten.
   2. Legen Sie den 0,025" festen Kern-Geradendraht 1 mm hinter dem Ende des Angiokatheters vollständig ein.
      HINWEIS: Der Draht ist vor dem Verfahren mit Klebeband markiert, um den 1 mm Haltepunkt anzuzeigen und die Konsistenz zu gewährleisten.
   3. Halten Sie den Monopolstift für 1 s an den Führungsdraht, was eine elektrische Reizung der Blasenschleimhaut ermöglicht.
   4. Befestigen Sie einen frischen sterilen Angiokatheter an einer 1 ccm luer-lok Spritze und erstellen Sie 200 l gesammelte Zellen aus Schritt 6.9.
      ANMERKUNG: Mindestens 100 l gehen vom Angiokatheter an die Spritze verloren. Kompensieren Sie das Verlustvolumen bei der Berechnung des Volumens der erforderlichen Zellsuspension.
   5. Entfernen Sie Führungsdraht und Angiocatheter von der Maus Harnröhre. Einfügen von Angiokatheter mit einer Spritze von Zellen, die in die Harnröhre eingebunden sind.
      HINWEIS: Die Weiterentwicklung sollte einfacher sein als zuvor.
   6. Instillieren Sie 50 L Zellen in die Mausblase. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie den Angiokatheter entfernen, damit die Zellen an der Blasenwand haften.
      HINWEIS: Zellen bleiben in der Blase und entwickeln sich zu einem Primärtumor.
3. Entfernen Sie die Maus von isoflurane Nasenkegel und Erdungspad. Beobachten Sie die Maus für 1 h nach dem Verfahren. Achten Sie auf Anzeichen von Bedrängnis, d.h. zurückgebeugt, mühsame Atmung, etc.

8. CRC-Mausmodell

1. Anästhetisieren Sie sechs bis acht Wochen alte männliche NOD/SCID-Maus mit Isofluran (2,5% in 100% Sauerstoff, 1 L/min) in der Induktionskammer. Bestätigen Sie die Sedierung mit einer Zehenprise.
2. Setzen Sie die anästhesierte Maus in Supine-Position unter einem Sezieren des Mikroskops, um sicherzustellen, dass ihre Schnis an einem Isofluran-Nosecon zu befestist und ihre vorderen Gliedmaßen mit Klebeband für Stabilität gesichert werden.
   HINWEIS: Loupes können anstelle eines Sezierensmikroskops verwendet werden. Ein kleines Objekt kann verwendet werden, um die Sichtbarkeit und den Winkel zu verbessern, wenn es unter der Basis des Schwanzes platziert wird, wodurch der Anus erhöht wird. Typischerweise werden kleine Abschnitte von Gaze in eine Zylinderform mit einem Durchmesser von 1 Zoll gerollt.
3. Defiletieren Sie den Analkanal mit gebogenen geschmierten stumpfgekippten Zangen, um die distale anale und rektale Schleimhaut freizulegen. Entfernen Sie den Kot.
4. Verwenden Sie eine sterile 30 G abnehmbare Nadel auf einer 50-L-Glasspritze, um 10 l Tumor- und HK-Zellen (ab Schritt 6.9) in die distale posterior rektale Submucosa 1 bis 2 mm über dem Analkanal zu injizieren. Die Nadelnadelsollte mit Schleimhaut bedeckt sein. Achten Sie darauf, nicht in die Beckenhöhle zu gelangen.
5. Entfernen Sie die Maus aus dem Isofluran-Nasenkegel. Beobachten Sie die Maus für 1 h nach dem Verfahren. Achten Sie auf Anzeichen von Bedrängnis, d.h. zurückgebeugt, mühsame Atmung, etc.

9. Biolumineszierende Bildgebung

1. Überwachen Sie die primäre Tumor-, Leber- und Lungenmetastasenbelastung wöchentlich mit einem biolumineszierenden Bildgebungssystem für die Luziferase-Aktivität.
   1. Besorgen Sie sich eine Maus aus dem UCC- oder CRC-Experiment und wiegen Sie. Injizieren Sie 150 mg/kg Luziferin intraperitoneally und warten Sie 5 min, bis das Substrat im Körper der Maus zirkuliert.
   2. Anästhesisieren Sie Maus mit 2,5% Isofluran in 100% Sauerstoff, 1 L/min in der Induktionskammer.
   3. Platzieren Sie die Maus in der BLI Imaging Maschine mit in Nosecone fixierter Nase. Stellen Sie beim Aussetzen für das Bild sicher, dass der Interessenbereich der Kamera zugewandt ist. Bei UCC- und CRC-Injektion sollte die ventrale Seite für jedes Bild der Kamera gegenüberstehen. Bildmaus in Supine-Position.

10. Ernteorgane und Tumor

1. Wenn die primäre Tumorlumineszenzstrahlung 1 x 10¹¹ Photonen erreicht oder wenn Mäuse Anzeichen von Bedrängnis aufweisen (d.h. Gewichtsverlust, zurückgeknickt, harte/mühsame Atmung usw.), einschläfern Mäuse durch CO2-Inhalation (wie in Schritt 5.2.1) nach Luziferin Injektion und Ganzkörperbildgebung.
2. Entfernen Sie Leber und Lunge, legen Sie in eine Petrischale und Bild, um alle Metastasen zu identifizieren. Entfernen Sie Tumor, Wiegen und Bild. Fix Organe und Tumor in 10% neutral gepuffertem Formalin für 48 h bei Umgebungstemperatur.
   HINWEIS: Scheren und Zangen zwischen jedem Organ reinigen/wischen, um gewebeübertragungzuvermeiden.

11. Histologische Bewertung

1. Einbetten von Formalin-Festgeweben in Paraffin und schneiden Sie das Gewebe mit einer Dicke von 5 m auf ein Mikrotom für Hämatoxylin und Eosin (H&E) und immunhistochemische (IHC) Färbung.
   ANMERKUNG: Alle H&E-Färbungen von Paraffindias wurden im Pathologielabor des Ochsner Gesundheitssystems durchgeführt, und alle IHC-Färbungen in diesem Papier wurden in einem Forschungslabor des Ochsner Gesundheitssystems nach Hochtemperatur-Antigenabruf mit Ki67 und Cytokeratin 20 Antikörper, gefolgt von biotinylierten Sekundärantikörpern und Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexen nach Herstelleranleitung^13,17.

Ergebnisse

Im UCC PDOX-Modell wurden die BlCaPt15- oder BlCaPt37-Zellen von UCC-Patienten intravesisch (IB) in Gegenwart von HK-Zellen in die weibliche NOD/SCID-Mausblase eingeflößt (Abbildung 1A). 25 von 30 (83,3%) Tiere erzeugten primäre Tumoren und zeigten zeitabhängiges primäres Tumorwachstum basierend auf wöchentlichem BLI (Abbildung 1B, C und Tabelle 1). Ebenso sind im CRC PDOX-Modell 31 von 32 ...

Diskussion

Metastasierende Erkrankungen sind für die meisten Krebspatientensterblichkeit verantwortlich. In präklinischen therapeutischen Tests ist es entscheidend, Mausmodelle zu etablieren, die das menschliche Tumorwachstum mit spontanen entfernten Organmetastasen am ehesten emulieren. Die Verwendung von murinen Modellen mit implantierten Patiententumor abgeleiteten Krebszellen (Xenografts) ermöglicht ein besseres Verständnis der Tumorbiologie und prädiktiver Biomarker sowie Tests und Vorhersagen antineoplastischer Wirkungen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avidin-biotin-peroxidase	Vector Labs Inc	PK-6100
Biotinylated secondary antibody	Vector Labs Inc	BA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL)	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)	Sigma	D4263
D-Luciferin (150 mg/kg)	Perkin Elmer	122796
Formalin (10% neutral buffered)	Leica	46129
glutamine (2 nM)	Fisher Scientific	35050061
Hair Removal Cream	Church & Dwight Co., Inc	1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	SH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL)	Sigma	H3884
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	108333
Luc/RFP-lentivirus	From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s medium	Life Technologies	110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL)	Fisher Scientific	15140-122
RPMI-1640 Medium	American Type Culture Collection	110636
Trypan Blue	Sigma	T6146
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas
100% Oxygen	Airgas Inc	OX USP200
100% CO2	Airgas Inc	CD USPE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male)	Jackson Lab	001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female)	Jackson Lab	001303
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemistry
Hematoxylin	Sigma	GHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody	Thermo Scientific	RM-9106-S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-1
100 µm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-19
15 mL Conical Tube	Sarstedt	11799
50 mL Conical tube	Sarstedt	15762
150 mm Tissue Culture Dish	USA Scientific Inc	CC7682-3614
96 Well plate	USA Scientific Inc	CC7682-7596
Forceps	Symmetry Surgical Inc	06-0011
Surgical scissors	Symmetry Surgical Inc	02-2011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5% CO2 humidified incubator	Thermo Scientific	3110
Bioluminescent (BLI) Imaging Machine	Perkin Elmer	CLS136334
BLI Imaging Machine Software	Perkin Elmer	CLS136334
Centrifuge	Beckman	366830
Deconvoluting Microscope	Intelligent Imaging Innovations	Marianas
Deconvoluting Microscope Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations	+1 (303) 607-9429 x1
Digital caliper	Fowler Tools and Instruments	54-115-330
Dissecting microscope	Precision Instruments LLC	(504) 228-0076
Electrosurgical generator	ValleyLab	FORCE1C20
Isoflurane Induction Chamber	Perkin Elmer	119038
Microtome	American Optical Corporation	829
Pipet Aid	Fisher Healthcare	13-681-15E
Serological pipet (10 mL)	Sarstedt	86.1254.001