JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu hücrelerinin intra-vesically instilling veya intra-rektal enjekte kolorektal kanser hücreleri olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine tarafından hasta türeyen ortootopik xenograft modellerinin oluşturulması açıklanmaktadır immüneksikliği (NOD/SCıD) primer tümör büyümesi için fareler ve lenf nodu stromal hücrelerin etkisi altında spontan metastaz, hangi insan metastatik hastalıkların ilerlemesini taklit.

Özet

Kanser hastaları, mesane ve kolorektal kanseri (CRC) hem yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu (HG-UCC) içinde lenf nodu (LN) tutulumu olduğunda kötü prognostiklere sahiptir. Kas-invaziv UCC olan hastaların% 50 ' den fazla, klinik lokalize hastalık için küratif tedaviye rağmen, metastaz geliştirmek ve 5 yıl içinde ölmek, ve metastatik CRC ABD 'de kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Hastalarında sürekli olarak UCC ve CRC metasrik taklit eden xenograft modelleri gereklidir. Bu çalışmada primer tümör büyümesi için UCC ve CRC 'nin hasta türevi ortootopik xenograft (PDOX) modelleri ve LN stromal hücrelerinin etkisi altında spontan metastaz modeli, insan metastatik hastalıklarının ilaç taraması için ilerlemesini taklit etmeyi amaçlamaktadır. HG-UCC ve kolorektal adenokarsinoma için rezeksiyon yapılarak, sırasıyla taze UCC ve CRC tümörleri elde edildi. LN stromal Cell (LNSC) Analog HK hücreleri ile ortak inoküle, luciferase-etiketli UCC hücreleri intra-vesically vardı (ıB) kadın olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine immünyetmezlik (NOD/SCıD) fareler, ve CRC hücreleri intra-rektik edildi (IR) içine enjekte Erkek NOD/SCıD fareler. Tümör büyümesi ve metassel, Bioluminesans görüntüleme (BLı) kullanılarak haftalık olarak izleniyor. Kurban üzerine, primer tümörler ve fare organları hasat edildi, tartıldı, ve formalin-hematoxylin ve eozin ve immünhistokimya boyama için sabit. Benzersiz PDOX modellerinde, xenograft tümörleri hasta ön implantasyon tümörlerine benzerdir. HK hücrelerinin varlığında, her iki model de BLı ve tümör ağırlıkları ile ölçülen yüksek tümör implantasyon oranları, 83,3% UCC ve% 96,9 CRC için, ve yüksek uzak organ metastaz oranları (% 33,3 tespit karaciğer veya akciğer metastaz için UCC ve% 53,1 CRC için). Buna ek olarak, her iki model yordamdan sıfır mortalite vardır. İnsan HG-UCC ve CRC için benzersiz, tekrarlanabilir PDOX modelleri kurduk, bu da tümör oluşumuna, büyümesini ve metasük çalışmalarına izin verir. Bu modellerde, yeni terapötik ilaçların test edilmesi verimli ve klinik olarak mimetic bir şekilde yapılabilir.

Giriş

Lenf nodu (LN) metastazının, mesane ve kolorektal kanser (CRC)1,2' nin yüksek dereceli ürogariyal Hücre Karsinomu (UCC) dahil olmak üzere birçok katı organ malignitesinde kötü prognostik bir gösterge olduğunu göstermiştir. Kas-invaziv UCC (MıUCC) olan hastaların yarısından fazlası, klinikte lokalize hastalık için küratif tedaviye rağmen, 5 yıl içinde metastanca gelişecek ve ölür. Metastatik CRC ABD 'de kanser ile ilgili ölüm önde gelen nedenidir.

Tahmini 81.190 yeni hastalar ve 17.240 kanser spesifik ölümlerin, ABD 'de, mesane3,4UCC nedeniyle 2018 yılında gerçekleşmesi bekleniyor. Hastalar ağırlıklı olarak (% 70) Kas invazif olmayan hastalık ile mevcut,% 30 MıUCC5olacaktır. Klinikte lokalize hastalık için küratif tedaviye (radikal cystektomi [RC] veya sistemik kemoterapi olmadan) rağmen, mesane MIUCC olan hastaların yarısı hala metasürler geliştirecek ve 5 yıl içinde ölmek3. RC6,7,8' deki hastaların yaklaşık% 20 −% 25 ' inde lenf nodu tutulumu bulunmuştur. LN pozitif hastalarda beş yıllık hayatta kalma oranı, RC 'den sonra bile% 35 ' den az, UCC hastalarında prognoz için önemli bir negatif öngörü olarak LN tutulumu öneriyor.

Kolorektal kanser, Amerika Birleşik Devletleri 'nde hem erkek hem de kadınlarda teşhis edilen üçüncü en yaygın kanserdir. Hastanın sonuçları büyük ölçüde invazyonu, LN tutulumu ve uzak organ metastaz derinliği gibi tümör özelliklerine ve tümör mikroortamına bağlıdır. Tarama ve etkili ameliyatlar nedeniyle son on yılda CRC 'deki mortalite oranı azalsa da, CRC hastalarının yaklaşık% 50 ' si metasrat veya tekrarlayan hastalık9' da gelişecektir.

Küçük hayvan modelleri, tümör progresyonu ve farklı metastatik desenleri incelemek için hızlandırılabilen, tekrarlanabilir ve değiştirilebilir bir platform sağlar. Şu anda, hastalarda görülen CRC ve UCC metasrik olarak taklit edilen xenograft modelleri tanımlanmıştır. Kanser uzak metastaz primer rota lenfatik Spread yoluyla. Yeni araştırma LNs benzersiz bir mikroçevre ile tümörlerin sağlamak ve sadece sadece sabit hedefler nerede kanser hücrelerinin geçmeli geçiş olduğunu göstermektedir, aynı zamanda metastatik süreçte kanser hücreleri ile etkileşim tarafından ayrılmaz bir rol oynar. Gerçekten de, çalışmalarımız, tümör progresyonu ve metastacıları eğitmek ve teşvik etmek yanı sıra, ın stromal mikroçevre da CRC10,11ilaç direnci sorumlu olduğunu keşfetti. Laboratuvarımız son zamanlarda, in stromal hücrelerinin (lnscs) CRC ve uccs üzerinde hasta tarafından türetilen ortootopik xenograft (PDOX) fare modellerini kullanarak tümör etkilerini doğruladı12,13.

PDOX modellerini geliştirmek translasyonel kanser araştırması için önemli bir platform sağlar14,15. PDOX modelleri, donör tümörlerinin temel histolojik ve genetik özelliklerini koruyarak, pasajlar arasında kararlı kalır ve translasyonel kanser araştırması için iyi platformlar yapar12,15. PDOX modelleri preklinik ilaç değerlendirmesi, biyomarker tanımlaması ve klinik sonuçların öngörülerine izin veren kişiselleştirilmiş tıp stratejilerinin preklinik değerlendirilmesi için kullanılmaktadır. Şu anda, LN tutulumunun önemini dikkate alan ve CRC ve UCC 'de primer tümör ve uzak organ metastaz sürekli olarak yeniden üretebilmiyor, açıklanan xenograft modelleri yoktur. Bu çalışmada, ıNSC tutulumu ile metastatik CRC ve UCC hastalıklarının çoğaltılması ile NOD/SCıD farelerinde PDOX modellerinin gelişimini tarif ediyoruz.

Protokol

Bu hayvan çalışmalarında açıklanan tüm yöntemler, Ochsner sağlık sistemi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi onaylı yönergeler altında ve hayvan araştırma kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Bu çalışmanın tüm hasta tümörleri, Ochsner Health System araştırma Inceleme kurulu ve ınsan üzerindeki kurumsal komite 'nin etik standartlarına uygun olarak kanser rezeksiyon ameliyatı geçiren hastalarından toplanmıştır. Deneme. Ochsner Health System 'de kurulu sertifikalı patologlar, tümör hücrelerinin mikroskobik özelliklerine, histolojik tipine ve sınıf düzeyine dayalı olarak hasta örneklerinin patolojik tanılarını belirledi.

Not: aşağıdaki protokol iki ayrı xenograft modelleri için adımları açıklar, bir UCC modeli bir CRC modelinde çalışma için UCC hücreleri ve CRC hücrelerinin İntrarektal enjeksiyon aşılamak için mesane duvarının electrocoterization üzerinden. Denemeler için hazırlık ve izleme tüm adımlar her iki model için aynıdır, Bölüm 7 ve 8 özellikle UCC instilasyon ve CRC enjeksiyonu için yordamı tarif ederken, sırasıyla.

1. kültür hücresi hatları

  1. Komple rpmi-1640 orta HK hücreleri Grow 10% fetal sığır serumu ile tamamlayıcı, 2 Nm glutamin, 100 U/ml penisilin G, ve 100 mg/ml streptomisin içinde 37 °c içinde 5% Co2 nemlendirici kuluçk.
    Not: HK hücreleri normal insan foliküler dendritik hücreler ve yetiştirilen ve ≤ 15 pasajlar in vitro16için genişletilebilir.
  2. Bir deney hazırlamak için, hücreleri tripsinize.
    1. Medya kaldırın ve Hank 'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hücrelere 2 mL 1% tripsin ekleyin. 4 dakika boyunca 37 °C ' de% 5 CO2 nemlendirici kuluçte hücreleri geri yerleştirin.
    2. 10 mL serolojik pipet bağlı bir el pipet yardım kullanarak 15 mL tüp içine çanak hücreleri toplayın. Tam RPMI-1640 orta 8 mL ekleyin.
    3. 40 μL hücre ve 40 μL tripan mavi bir tek iyi bir 96 kuyu plaka birleştirin. Hemokytometreye 10 μL karışım ekleyin ve canlı hücreleri Sayın. 1.000.000 hücre ekleme 25 mL tam RPMI-1640 orta bir 150 mm Steril doku kültürü-tedavi çanak hücreleri büyümeye devam etmek.
      Not: Bu adımda hazırlanan HK hücre süspansiyon enjeksiyon için tümör hücreleri ile karıştırmak için bir saat içinde kullanılmalıdır.

2. hasta numune toplama

  1. Rezeksiyon ameliyatında 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) ve 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) hastadan UCC tümörlerinin toplanması.
  2. Rezeksiyon ameliyatında (CoCaPt155, T1 N0 M0) ve 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) tarafından onaylı hasta 155 CRC tümörlerinin toplanması.

3. hasta tümörünün genişlemesi

  1. Penikilin G (500 U/mL) ve streptomisin (500 mg/mL) içeren soğuk steril McCoy 'un ortamında cerrahide tümör toplayın.
  2. Implant tümörleri 6 − 8 haftalık kadın NOD/SCıD farelerinin sol ve sağ kanadına doğrudan girer.
    1. Küçük cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde mekanik olarak kıyma dokular (~ 1 mm3).
    2. 13 G kemik iliği aspirasyon biyopsi iğneleri kullanarak sol ve sağ kanatta subkutan Implant dokusu.
      Not: 8 mm3 toplam hacmi, kanat her iki tarafına eşit bölünmüştür.

4. etiketleme ve Lusiferaz etiketli tümörlerin zenginleştirme

  1. Ölçüm tümör büyüme iki haftalık bir dijital Kaliper kullanarak.
  2. Çapı 1 cm, tümör transduce. Doğrudan tek doz Luc/kırmızı floresan protein (RFP)-Lentivirus (50 μL/tümör, 1:30 seyreltme konsantre yüksek titresi Lentivirus stokta) ile tümör içine enjekte 1 cc şırınga ile 27 G iğne.
    Not: hasta tümörü genellikle 1 − 2 ayda 1 cm çapına ulaşır. Ancak, büyüme oranı son derece değişken ve tümör derecesi ve türü dahil olmak üzere bir dizi faktörlere dayanmaktadır.
  3. Canlı hayvanlarda Bioluminesans görüntüleme (BLı) ile haftalık tümör izleyin.
    1. Fareleri tartın. 150 mg/kg lusiferin intraperitoneal ile bilinçli fare enjekte ve fare vücudunda dolaşmak için substrat için 5 dakika bekleyin.
    2. % 100 oksijen, 1 L/min bir indüksiyon odasında 2,5% izofluran ile fareyi anestezize.
    3. Isoflurane akan ve görüntü ile BLı görüntüleme makinesinde mide üzerine fare yerleştirin. Luc/RFP pozitif tümör bölgelerinin (sahte renk biyo-Işıksaçan görüntü) varlığını onaylamak için sıralı görüntüler alın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra kafes geri fare.

5. enzimatik sindirim için tümör uygun bölümünü seçin

  1. UCC veya CRC prosedürün gününde, Lusiferaz etiketli tümör ile görüntü faresi 4.3.1 − 4.3.3 adımlarla.
    Not: subkutan tümör büyümeye zaman uzunluğu tümör büyüme hızına ve deney enjekte edilecek hayvanların planlanan sayısı bağlıdır.
  2. Fare kanadı ve görüntüden hasat tümörü.
    1. Görüntüleme sonrası CO2 inhalasyon tarafından euthanize fare. CO2 odasına fare yerleştirin, solunum tutuklamaya kadar 1,4 L/dak gaz açın ve 3 dakika boyunca bırakın. Servikal dislocation Ile bu izleyin.
    2. 70% etanol ile temiz cilt. Doğrudan tümör üzerinde çadır cilt. Cerrahi makas ile cilt küçük bir kesi yapmak. Deri tümörün makası ile ayrı.
    3. Tümör ve yer steril Petri-çanak çıkarın. Bir görüntüleme makinesinde tüm çanak görüntü.
  3. Tümör ve yeniden görüntü Lusiferaz pozitif bölümlerde Lusiferaz-negatif bölümler ayırmak için steril makas veya neşter kullanın.
  4. Sadece en yüksek pozitif tümör parçaları kalana kadar tekrarlayın.

6. tümör enzimatik sindirim

  1. Laminar akış kaput altında, kıyma Lusiferaz pozitif tümör parçaları (adım 5,4) Steril Cerrahi makas kullanarak olası en küçük parçalara içine ve steril 50 ml konik tüp içine koydu.
    Not: en küçük olası parçalara tümör Mincing daha fazla bireysel hücreler verecektir.
  2. 10 ml kolajenaz IV (1,5 mg/ml), 80 μL hyalüronidaz (20 mg/ml) ve 160 μL ile deoksiribonükleaz ı (0,1 mg/ml) için 40 ml HBSS ekleyerek Digest çözümünü hazırlayın. Ters çevirme ile mix çözüm.
  3. Kıyılmış tümör için 35 − 40 ml Özet çözeltisi ekleyin. 2 saat boyunca sürekli rotasyona sahip 37 °C ' de Inküye.
    Not: güçlü bir şekilde inkübasyon boyunca periyodik olarak boru sıkışması tümör doku önlemek için.
  4. Steril 100 μm hücre süzgeci ile tüm sindirimi filtreleyerek enkaz kaldırmak için bir 40 μm hücre süzgeci takip eder. Akışını kaydedin ve enkaz atın.
  5. 5 dk için 329 x g 'de 20 ml HBSS ve Santrifüjü ekleyerek ücretsiz hücreleri yıkayın 30 ml HBSS 'de süpernatant ve pelletini Pelet aspirate.
  6. 10 μL hücre çözümünü ve 96 iyi bir plakanın tek bir kuyunda tripan Mavi 90 μL 'i birleştirin. Bir hemacytometer kullanarak canlı hücreleri saymak.
  7. Transfer 1 x 104 için 1 x 106 tümör hücreleri her fare Için steril bir 15 ml konik tüp. Ekle 3 x 105 HK hücreleri adım 1.2.3 fare başına, tümör hücreleri ile aynı tüp.
    Not: toplam hacim 15 mL 'yi aşarsa, steril 50 mL konik tüp kullanın. Her zaman şırınga kullanımı sırasında sıvı kaybı için hesaba çalışma grubu başına ek hayvanlar için daha fazla doz hesaplayın. Örneğin, bir grup 5 fare içeriyorsa, 6 veya 7 fare için yeterli hücre yapın.
  8. 329 x g 'de santrifüjün 5 dakika boyunca santrifüj edilmesi ya da pipetleme ile süpernatant atmak.
  9. Tam RPMI medyadaki CRC modeli için UCC modeli veya fare başına 10 μL için 50 μL cinsinden hücreleri resuspend. Hücre süspansiyonunu kullanıma hazır olana kadar buzda tutun.

7. UCC fare modeli

  1. Prosedür için fareler hazırlanması
    1. Altı-sekiz hafta eski kadın NOD/SCıD fare elde. Saç temizleme kremi kullanarak fareyi alt sırt tıraş. Isoflurane ile bir indüksiyon odasında fare anestezize (% 2,5% 100 oksijen, 1 L/dak).
    2. Bir kez yatıştırıcı, bir izofluran burun koni ve çıplak arka sıkıca bir Dispersif Elektrot üzerinde topraklı onun burnu ile fitil pozisyonda fare yer.
      Not: fare tamamen sakinleştirici Eğer ayak çimdik yanıt vermeyen.
  2. Adım 6,9, anjeoateter (Şekil 1Aa, AB) kullanarak mesane için hazırlanmış UCC hücreleri.
    1. Monopolar elektrokoter makine kurmak ve 4 W. bir güç ayarlamak, yağlama jöle ile 24 G steril angiokateter yağlayın ve dişi fare üretra yoluyla yerleştirin.
      Not: hafif direnç hissedilebilir. Yavaşça ileri itin veya anjokateter kaldırın ve tekrarlayın. Zorlamayın. Kateter giriş üzerinde bükümler, stabilite sağlamak için kateter içine steril bir kılavuz tel (bkz 7.2.2) yerleştirin.
    2. Tam olarak 0,025 "sabit çekirdek düz kılavuz tel 1 mm angiokateter sonundan geçmiş yerleştirin.
      Not: Tel, 1 mm durdurma noktasını belirtmek ve tutarlılık sağlamak için prosedürden önce bantla işaretlenir.
    3. 1 s mesane mukoza elektrik tahrişi için izin için kılavuz tel Monopolar pin tutun.
    4. 1 cc Luer-Lok şırıngaya taze steril angiokateter takın ve 6,9 adımda toplanan hücrelerin 200 μL 'yi çizin.
      Not: en az 100 μL anjeoateter 'dan şırıngaya kaybolur. Gerekli hücre süspansiyonunun hacmini hesaplarken kayıp hacmini telafi etme.
    5. Kılavuz tel ve anjokateter fare üretradan çıkarın. Üretra bağlı hücrelerin şırınga ile anjeoateter ekleyin.
      Not: Ilerleme daha önce daha kolay olmalıdır.
    6. 50 μL hücreleri fare mesane için instill. Hücrelerin mesane duvara uymasını sağlamak için angiocatheter çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin.
      Not: hücreler mesane içinde kalır ve primer bir tümör içine gelişir.
  3. Isoflurane burun koni ve topraklama pad fare çıkarın. 1 saat aşağıdaki prosedür için fareyi gözlemleyin. Sıkıntılar, yani, geri hunched, nefes, vb stres belirtileri arayın.

8. CRC fare modeli

  1. Isoflurane ile altı-sekiz haftalık erkek NOD/SCID fare anestezize (2,5% 100 oksijen, 1 L/dak) indüksiyon odasında. Bir ayak tutam ile sedasyon onaylayın.
  2. Bir izofluran burun konisi için onların burnu güvenli ve istikrar için teyp ile ön ekstremite güvenliğini sağlamak için emin olmak, bir diseksiyon mikroskop altında sırtüstü pozisyonda anestezize fare yerleştirin.
    Not: Diseksiyon mikroskobu yerine Loupes kullanılabilir. Küçük bir nesne, kuyruk tabanına yerleştirildiğinde, anüs yükseltmek görünürlük ve açı geliştirmek için kullanılabilir. Tipik olarak, gazlı bez küçük bölümler 1 inç çapı bir silindir şekli içine haddelenmiş.
  3. Distal anal ve rektal mukoza ortaya çıkarmak için kavisli yağlanmış künt uçlu forseps ile anal kanal dilate. Dışkı çıkarın.
  4. 50 μL cam şırıngada steril 30 G çıkarılabilir iğne kullanarak 10 μL tümör ve HK hücrelerinin (adım 6,9) distal posterior rektal submukoza 1 ile 2 mm arasında anal kanalın üzerine enjekte edilmesi gerekir. İğne eğim mukoza ile kaplanmıştır. Pelvik boşluğa geçmemeye dikkat edin.
  5. Isoflurane burun koni fare çıkarın. 1 saat aşağıdaki prosedür için fareyi gözlemleyin. Sıkıntılar, yani, geri hunched, nefes, vb stres belirtileri arayın.

9. Bioluminesans görüntüleme

  1. Lusiferaz aktivitesi için bir Bioluminesans görüntüleme sistemi kullanarak primer tümör, karaciğer ve akciğer metastatik yükünü haftalık olarak izleyin.
    1. UCC veya CRC deneyinden bir fare alın ve tartın. Enjekte 150 mg/kg lusiferin intraperitoneal ve fare vücudunda dolaşmak için substrat için 5 dakika bekleyin.
    2. Anestezize fare ile 2,5% Isoflurane içinde 100% oksijen, 1 L/min indüksiyon odasında.
    3. Nosecone sabit burun ile BLı görüntüleme makinesinde fare yerleştirin. Görüntü için açığa çıktığında, ilgi alanı kamera karşı karşıya olduğundan emin olun. UCC ve CRC enjeksiyon için, ventral tarafı her görüntü için kamera karşı karşıya olmalıdır. Görüntü fareyi sırtüstü pozisyonda.

10. organ ve tümör toplama

  1. Primer tümör Luminesans parlaklık ulaştığında 1 x 1011 fotonlar ya da fareler sıkıntı belirtileri Sergi (yani, kilo kaybı, geri hunched, sert/ağır nefes, vb), Co tarafından ötenize fareler2 inhalasyon (olarak adım 5.2.1) sonra lusiferin Enjeksiyon ve tüm vücut görüntüleme.
  2. Karaciğer ve akciğer çıkarın, bir petri tabak ve görüntü herhangi bir metasatik belirlemek için yer. Tümör, tartım ve görüntü çıkarın. Ortam sıcaklığında 48 h için% 10 nötr tamponlu formalin içinde organ ve tümör düzeltin.
    Not: doku transferini önlemek için her organ arasında makas ve forseps temizleyin/silin.

11. histolojik değerlendirme

  1. Parafin içinde formalin sabit dokulara katıştırın ve hematoksinlin ve eozin (H & E) ve immünhistokimyasal (ıHC) boyama için bir mikrotome 5 μm kalınlıkta dokularda dilim.
    Not: parafin slaytlarının tüm H & E boyama Ochsner sağlık sistemi patoloji laboratuarında yapıldı, ve bu yazıda tüm ıHC boyama, Ki67 kullanarak yüksek sıcaklık antijen alımı sonra Ochsner sağlık sistemi araştırma laboratuarında yapıldı ve Sit, 20 antikorlar, biyotinlenmiş ikincil antikor izledi, ve avidin-biotin-peroksidaz kompleksleri üretici talimatlarına göre13,17.

Sonuçlar

UCC PDOX modelinde, UCC hastaları ' BlCaPt15 veya BlCaPt37 hücreleri intra-vesically (ıB), HK hücrelerinin varlığını kadın NOD/SCıD fare mesane (Şekil 1a) içine aşıldı. Yirmi beş dışarı otuz (83,3%) hayvanlar primer tümörlerin oluşturduğu ve haftalık BLI (Şekil 1B, C ve Tablo 1) dayalı zaman bağımlı primer tümör büyümesi gösterilir. Benzer şekilde, CRC PDOX mode...

Tartışmalar

Metastatik hastalık çoğu kanser hastası mortaliteleri için sorumludur. Klinik öncesi terapötik testlerde, insan tümörü büyümesini spontan uzak organ metastazı ile en yakından taklit eden fare modelleri kurmak çok önemlidir. İmplante edilen hasta tümörü ile duvar modellerini kullanarak kanser hücreleri türetilmiştir (xenografts) tümör biyoloji ve öngörü biyolojik daha iyi bir anlayış yanı sıra test ve yeni tedaviler Antineoplastik etkileri tahmin sağlar18. Bir çok ...

Açıklamalar

Bu çalışmada, Ochsner translasyonel Tıp araştırma girişimi Grant 2014 tarafından kısmen desteklenmektedir. Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Teşekkürler

Yazarlar Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, ve Shannon McChesney onların mükemmel teknik destek için bu çalışmaları başlatmak için yardımcı teşekkür ederiz. Yazarlar da Heather yeşil Matrana, Margaret Variano, Sunil taşa, ve Maria Latsis yardım için hasta ve tümör numuneleri sağlamak için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Avidin-biotin-peroxidaseVector Labs IncPK-6100
Biotinylated secondary antibodyVector Labs IncBA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL)Worthington Biochemical CorporationLS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)SigmaD4263
D-Luciferin (150 mg/kg)Perkin Elmer122796
Formalin (10% neutral buffered)Leica46129
glutamine (2 nM)Fisher Scientific35050061
Hair Removal CreamChurch & Dwight Co., Inc1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher ScientificSH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL)SigmaH3884
IsofluraneHenry Schein Animal Health108333
Luc/RFP-lentivirusFrom our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s mediumLife Technologies110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL)Fisher Scientific15140-122
RPMI-1640 MediumAmerican Type Culture Collection110636
Trypan BlueSigmaT6146
Trypsin/EDTALife Technologies15400-054
NameCompanyCatalog NumberComments
Gas
100% OxygenAirgas IncOX USP200
100% CO2Airgas IncCD USPE
NameCompanyCatalog NumberComments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male)Jackson Lab001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female)Jackson Lab001303
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunohistochemistry
HematoxylinSigmaGHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal AntibodyThermo ScientificRM-9106-S
NameCompanyCatalog NumberComments
Tools
40 µm cell strainerFisher Scientific08-771-1
100 µm cell strainerFisher Scientific08-771-19
15 mL Conical TubeSarstedt11799
50 mL Conical tubeSarstedt15762
150 mm Tissue Culture DishUSA Scientific IncCC7682-3614
96 Well plateUSA Scientific IncCC7682-7596
ForcepsSymmetry Surgical Inc06-0011
Surgical scissorsSymmetry Surgical Inc02-2011
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
5% CO2 humidified incubatorThermo Scientific3110
Bioluminescent (BLI) Imaging MachinePerkin ElmerCLS136334
BLI Imaging Machine SoftwarePerkin ElmerCLS136334
CentrifugeBeckman366830
Deconvoluting MicroscopeIntelligent Imaging InnovationsMarianas
Deconvoluting Microscope Imaging SoftwareIntelligent Imaging Innovations+1 (303) 607-9429 x1
Digital caliperFowler Tools and Instruments54-115-330
Dissecting microscopePrecision Instruments LLC(504) 228-0076
Electrosurgical generatorValleyLabFORCE1C20
Isoflurane Induction ChamberPerkin Elmer119038
MicrotomeAmerican Optical Corporation829
Pipet AidFisher Healthcare13-681-15E
Serological pipet (10 mL)Sarstedt86.1254.001

Referanslar

  1. Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
  2. Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
  4. Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
  5. Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
  6. Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
  7. Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
  8. Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
  9. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
  10. Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
  11. Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
  12. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  13. Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
  14. Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
  15. Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
  16. Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
  17. Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
  18. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
  19. Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
  20. Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
  21. Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
  22. Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 147hasta t revi ortootopik xenografty ksek dereceli rosityal H cre Karsinomukolorektal kanserlenf nodu stromal h crelermetasrikfare modelit m r mikro evre

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır