JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

واستهدفت epigenome الحمض النووي يمثل تحرير نهج علاجية قوية. يصف هذا البروتوكول إنتاج وتنقية، وتركيز ناقلات لينتيفيرال الكل في واحد إيواء التحوير كريسبر-dCas9-DNMT3A لتطبيقات تحرير ابيجينومي في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك)-المستمدة من الخلايا العصبية.

Abstract

ويمثل استخدام الخلايا المشتقة من هيبسك نهجاً قيماً لدراسة أمراض الأعصاب البشرية. وهنا، يمكننا وصف بروتوكولا أمثل للتفريق بين هيبسكس المستمدة من مريض مع تريبليكاتيون موضع الجينات (سنكا) ألفا سينوكلين في مرض باركنسون (PD)-السكان العصبية تتميز ذات الصلة. تتراكم الأدلة أظهرت أن مستويات عالية من سنكا المسببة لتطوير النادي واعترافاً بالحاجة غير المستوفاة إنشاء نهج علاجية جديدة لشعبة المشتريات، وبخاصة تلك التي تستهدف تنظيم التعبير سنكا ، ونحن وضعت مؤخرا كريسبر/dCas9 الحمض النووي-مثلايشن-نظام يستند ابيجينيتيكالي تعدل النسخ سنكا بإثراء مستويات مثلايشن في المنطقة التنظيمية إنترون 1 سنكا . لتسليم النظام، تتألف من القتلى الإصدار (المعطلة) من Cas9 (dCas9) تنصهر مع المجال الحفاز من 3A الإنزيم ميثيلترانسفيراسي الحمض النووي (DNMT3A)، يستخدم ناقل لينتيفيرال. هذا النظام يطبق على الخلايا التي تحتوي تريبليكيشن محور سنكا ويقلل من سنكا-مرناً ومستويات البروتين بحوالي 30% من خلال مثلايشن الحمض النووي المستهدف من سنكا إنترون 1. Downregulation صقل مستويات سنكا تنقذ تعمل الخلوية المتعلقة بالمرض. في البروتوكول الحالي، ونحن نهدف إلى وصف إجراء خطوة بخطوة للتفرقة بين هيبسكس في الخلايا العصبية السلف (الشخصيات)، وإنشاء والتحقق من صحة من فحوصات بيروسيكوينسينج لتقييم الشخصية مثلايشن في سنكا إنترون 1. لإنشاء مخطط تفصيلي بمزيد من التفصيل في منظومة lentivirus-كريسبر/dCas9 المستخدمة في هذه التجارب، يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج وتنقية وتركيز ناقلات لينتيفيرال وتسليط الضوء على ملاءمتها لاستخدام تطبيقات تحرير ابيجينومي والجينوم هيبسكس والشخصيات. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة ويمكن استخدامها لإنتاج لينتيفيروسيس عيار عالية لتطبيقات في المختبر والمجراه.

Introduction

تم وضع منصات متعددة تحرير epigenome مؤخرا لاستهداف أي تسلسل الحمض النووي في المناطق التي تتحكم في الجينات التعبير1،2. صممت أدوات تحرير epigenome الذي تم إنشاؤه ل (ط) تنظيم النسخ و (ثانيا) تغيير التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال، (ثالثا) تعديل مثلايشن الحمض النووي و (رابعا) تعدل التفاعلات العنصر التنظيمي. النهج لربط معدلات النسخ/الكروماتين إلى Cas9 (ميتا) المعطلة (dCas9) التي أثيرت من قبل منصات التحرير epigenome المتقدمة، مثل الزنك الإصبع البروتينات (زفبس) والنسخ الشبيهة بالمنشط المستجيبة (حكايات)، إيواء مجال المستجيب النسخي قوية تنصهر (ED) إلى مجال الحمض النووي ملزم المصممة (DBD)3. ويعرف نتائج النمط الظاهري المطلوب مثل التنشيط أو القمع الجزيء المستجيب ترتكز المكاني الذاتية (الشكل 1). لإنشاء وسائل تفعيل الترانسكربتي القابلة للبرمجة، ترتبط وحدات dCas9/جرنا VP164،،من56 (الشكل 1A)، مجال تنشيط فيروسية المجندين "بول الثاني" وآلات النسخ العام. وشمل تعديل هذا النظام VP64، تيترامير VP16 المجالات، توفير إطار حتى أكثر قوة تفعيل5،معدل6. وقد استخدمت بنجاح النظام لتنشيط مناطق الترميز وفضله باستهداف العناصر التنظيمية والمروجين. الأهم من ذلك، على الرغم من أن الجزيئات VP64 مباشرة لا تقم بتعديل هيكل الكروماتين في المنطقة المستهدفة، من المجندين المعدلات الكروماتين الذي ربط النتائج في ترسب علامات النشطة (يوتشروماتين)، بما في ذلك ك acetylation H3/H4 و H3-K4 دي/ مثلايشن ثلاثي5،6. بالإضافة إلى VP64، وقد تم المربوطة الوحيدات p65 المجمع NF-κB البشرية إلى الوحدة النمطية dCas9/جرنة7. من المثير للاهتمام، يؤدي الربط هذه المستجيبة لمناطق المنبع لمواقع بدء النسخ (تحديد) وداخلها المروجين تحريض جينات قوية. ومع ذلك، يمكن أيضا ممارسة المستجيبة VP64 و p65 آثار أكتيفاتوري حين ارتباطها بالمناطق الواقعة أسفل النهر لتحديد وفي معززات القاصي7،8. للحصول على رد النسخي أكثر قوة، اندماج dCas9-VP64 أو dCas9-p65 متعددة بحاجة إلى تجنيد لهدف واحد موضع9،10. على هذا النحو، أدت التطورات الأخيرة في تفعيل الجيل القادم، التي تقوم بتجنيد العديد من المجالات المستجيب بمجمع جرنة dCas9 واحد، مثل سونتاج، أقوى تنشيط القدرة مقارنة ب نظرائهم الانصهار dCas9-VP6411 , 12-تم الحصول على تنشيط النسخي محسنة من خلال الدمج بين VP64، p65، و "هيئة الطرق والمواصلات" (VPR)، مجال transactivation من أشعة غاما-هيربيسفيروسيس، إلى ج-المحطة dCas913 (الشكل 1A). وقد وضعت نظم كريسبر/dCas9 مماثلة للقمع محددة الهدف (الشكل 1B).

يمكن تحقيق القمع الجينات الذاتية مع اندماج قامع هندسيا من خلال مجموعة متنوعة من الآليات (الشكل 1B). وقد ثبت أن نظم كريسبر/dCas9، مرتبطة قامع دبد (حتى بدون مجال المستجيب/s)، يمكن إسكات كفاءة التعبير الجيني في حين المربوطة إلى مروج أو المنبع/المتلقين للمعلومات-خدمات الدعم التقني مناطق3،6 ،14. آثار على النسخ بسبب تدخل الفراغية النسخ عامل ربط وتجهيز بوليميريز الحمض النووي الريبي. على الرغم من ذلك، يلزم اتباع نهج أكثر شمولاً، كما القمع الجينات بعائق الفراغية وحدها في كثير من الأحيان لا تكفي لإسكات صوت قوي. تطوير الجيل القادم من كواتم الصوت الأخيرة استناداً إلى نظم كريسبر/dCas9 تقل معدلات هيستون قامع النسخي المجالات (تردس)، (دي H3-K9-/مثلايشن ثلاثي، H3-K27 دي--/ثلاثي-مثلايشن؛ H3-K36 دي--/ثلاثي-مثلايشن، ديسيتيلاتيون H3/H4)، والحمض النووي (البد) مثلايشن أدت إلى بناء أدوات جينية السماح أكثر قوة إسكات آثار4،5،،من1516، 17،18،،من1920. وقد ثبت أن توظيف هذه المعدلات جينية للحمض النووي قد يؤدي إلى تشكيل أكثر الكروماتين المغلقة والمكثفة، التي عادة ما تولد من أقوى إسكات نتائج21،22. هو المجال الأكثر شيوعاً إسكات المستخدمة مع دبدس4،مربع المرتبطة كربل (KRAB)5. وقد ثبت توظيف عامل لتتوافق مع التغييرات الكروماتين؛ ومع ذلك، آليات هذه التعديلات بعد أن أوضحت16،،من1718. في الآونة الأخيرة، فقد ثبت أن إضفاء الطابع المحلي على KRAB للحمض النووي يمكن أن تعزز الجمعية methyltransferase هيستون SETDB1 والمجمعات نورد هيستون ديسيتيليشن (هداك)، مما يوحي بإمكانية أن هذه التفاعلات التوسط من أجل تشكيل التكثيف الكروماتين وإسكات النسخي3،13. كنهج بديل، يمكن أن تنصهر فيها المجالات المستجيب دبدس لخلق بروتين إسكات جينية مخصصة. مباشرة يحفز هذا النظام القمعي علامات الحمض النووي أو تعديلات هيستون.

في الآونة الأخيرة، قد تم أغراض أخرى استخدام نظم كريسبر/dCas9 الاصطناعية المربوطة للانزيم DNMT3A للتعطيل النسخي. DNMT3A يحفز مثلايشن الحمض النووي التي تمارس القمع النسخي في جميع أرجاء تشكيل heterochromatin على مروجي الجينات الذاتية والأخرى18،المناطق التنظيمية (الشكل 1B)20. وكانت ماكدونالد et al.18 وفويتا et al.20 الكتاب الأول التقرير أن مثلايشن الحمض النووي يمكن أن تستخدم لإسكات الجينات epigenome أو القمع، مما يدل على أن النظام الانصهار تسليم بلازميد dCas9-DNMT3A يمكن أن يعزز حقاً مثلايشن السيتوزين حول خدمات الدعم التقني من18،20. ماكدونالد وزملاء العمل أظهرت أن توظيف الاستراتيجية قد يؤدي انخفاض كبير (حوالي 40%) في جين ورم القامع، مستويات مرناً CDKN2A 18. وبالمثل، يظهر استهداف منطقة المروج أونميثيلاتيد الجينات باخ أو IL6ST مثلايشن البد المتزايدة التي قد تم يرتبط بانخفاض مزدوج في التعبير الجيني20. لدينا مختبر قد مؤخرا إعادة توجيه الغرض منه استخدام مثلايشن الحمض النووي لتخفيف النتائج المرضية من سنكا أوفيريكسبريشن (الشكل 2)23. ترتكز الاستراتيجية على تعزيز انتقائية في مثلايشن الحمض النووي داخل منطقة إنترون 1 سنكا ، كما أفيد سابقا أن يكون هيبوميثيلاتيد في شعبة المشتريات والخرف مع ليفي الهيئات (دلب) العقول24،25، 26. ارتبط هذا هيبوميثيليشن overexpression سنكا ، وهكذا تقدم هدفا جذاباً للتدخل العلاجي24،،من2728. نحن مؤخرا قد أظهرت انخفاض مستوى الحمض النووي مثلايشن في إنترون سنكا 1 المنطقة في الشخصيات تتميز المستمدة من هيبسك التي تم الحصول عليها من مريض PD مع تريبليكيشن سنكا 23. وميزة هذا النموذج التجريبي هو أن الشخصيات يمكن نشر قوة في الثقافة أو زيادة متباينة في الخلايا العصبية الناضجة، مما يتيح فحص كفاءة تحديد العوامل الوراثية التي تتوسط تعمل الخلوية، بما في ذلك عنصر مؤكسد الإجهاد والمبرمج29. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا النظام النموذجي العلماء تلخيص الأحداث التنموية التي حدثت قبل ظهور الأعراض في المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل الشخصيات المستمدة من هيبسك أداة عظيمة لاختبار مسارات الخلوية والجزيئية المرتبطة بالتعبير الجيني. الأهم من ذلك، الشخصيات المستمدة من هيبسك جنبا إلى جنب مع الدولة من أحدث التكنولوجيا كريسبر/Cas9-ابيجينومي يمكن أن يسهل وضع "المخدرات الجيل القادم" للعديد من أمراض الأعصاب.

لتقليل مستويات مرضية للتعبير سنكا، وضعنا مؤخرا نظام قائم على لينتيفيروس تحمل البروتين الانصهار dCas9-DNMT3A، وجرنة بالتحديد الهدف البد مثلايشن داخل إنترون سنكا 1 (الشكل 2A)23. وسيصف هذا البروتوكول متجه لينتيفيرال (LV) التصميم والإنتاج بالتفصيل. LVs تمثل وسيلة فعالة لتوصيل المكونات كريسبر/dCas9 لعدة أسباب، إلا وهي إدراج (ط) قدرتها على تحمل الحمض النووي الضخمة، (الثاني) كفاءة عالية لمجموعة واسعة نطاق من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الفاصل سواء نونديفيدينج30 ترانسدوسينج ، (ثالثا) وقدرتها على حمل ردود السامة للخلايا ومكسبه الحد الأدنى. في الآونة الأخيرة، ونحن تطبيق النظام LV تتميز هيبسك المستمدة من الخلايا العصبية من مريض مع تريبليكيشن محور سنكا وأظهر إمكانات LVs العلاجية لتقديم ابيجينومي--تحرير أدوات مثلايشن23 ( الشكل 2B). في الواقع، يؤدي نظام LV-جرنة/dCas9-DNMT3A زيادة كبيرة في مثلايشن الحمض النووي في منطقة إنترون 1 سنكا . يقابل هذه الزيادة مع انخفاض مستويات سنكا مرناً والبروتين23. وعلاوة على ذلك، تنقذ downregulation سنكا المتعلقة بالمشتريات تعمل في سنكا تريبليكيشن/هيبسك-مشتقة تتميز الخلايا العصبية (مثل المتقدرية روس إنتاج الخلية من الناحيتين)23. الأهم من ذلك، أثبتنا أن التخفيض في التعبير سنكا بالنظام LV-جرنة-dCas9-DMNT3A قادر على عكس تعمل التي هي سمة مميزة للخلايا العصبية تتميز هيبسك المستمدة من مريض PD قاموا سنكا تريبليكيشن، مثل روس المتقدرية الإنتاج وخلية بقاء23. والهدف من هذا البروتوكول هو 1) لتحديد البروتوكول للإنتاج وتركيز منصة LV الأمثل لتوليد الأعمال التحضيرية الفيروسية تيتيريد عالية و 2) لوصف التفريق بين هيبسكس إلى الشخصيات منقوشة لتصبح ناضجة تتميز 31،الخلايا العصبية32 وتوصيف مستويات مثلايشن المنطقة المستهدفة داخل سنكا إنترون 1.

منصات لينتيفيرال لها ميزة كبيرة على منصة ناقلات الأكثر شعبية، إلا وهي المرتبطة بالغدد ناقلات (آفس)، الذي هو في السابق القدرة على استيعاب أكبر إدراج الوراثية33،34. آفس يمكن أن تتولد في غلات أعلى بكثير ولكن تملك قدرة تغليف منخفضة (< 4.8 كيلو بايت)، المساس باستخدامها لإيصال نظم كريسبر/Cas9 الكل في واحد. وهكذا، يبدو أن LVs المنصة الاختيار في التطبيقات المشتركة في تقديم أدوات كريسبر/dCas9. ولذلك، سوف يكون البروتوكول الواردة هنا أداة قيمة للباحثين ورغبة منها في فعالية تسليم المكونات ابيجينومي--تحرير الخلايا والأجهزة. ويحدد البروتوكول كذلك الاستراتيجية الرامية إلى زيادة قدرات الإنتاج والتعبير لناقلات المرض عن طريق تعديل في رابطة الدول المستقلة من العناصر داخل ناقلات التعبير كاسيت30،35. وتقوم الاستراتيجية على الرواية النظام المتقدمة ودراستها في المختبر لدينا ويسلط الضوء على قدرته على إنتاج الجزيئات الفيروسية في نطاق/mL الوحدات الفيروسية (فو)10 1030،35.

Protocol

1-نظام تصميم وإنتاج فيروس

  1. بلازميد التصميم والبناء
    ملاحظة: يتم تنفيذ بناء متجه LV-جرنة-dCas9-DNMT3A-الكل في واحد باستخدام إنتاج-والتعبير التعبير الأمثل كاسيت نشرتها أورتينسكي et al.30. كاسيت ناقلات تحمل تكرار الموقع التعرف على عامل النسخ حزمة الخدمة Sp1 وحذف الدولة من الفن داخل غير مترجمة (U3 ') المنطقة من طرفية 3' دام تكرار (لاتينية) (الشكل 2A)30،36. ناقلات العمود الفقري قد وجد أن تكون فعالة في إيصال والإعراب عن30،Cas9 كريسبر/35.
    1. الحصول على إصدار التنشيط (الميت) SpCas9 (dCas9) عن طريق موقع الموجه الطفرات (البيانات لا تظهر). يستعاض عن استنساخ إيواء الطفرات D10A و H840A في مجالات الحفاز HNH وروفك إنزيم، على التوالي، مع Cas9 النشطة في pBK30129 من تبادل بين الأجزاء يجئ-بامهي (الشكل 3).
    2. تستمد المجال الحفاز DNMT3A pdCas9-DNMT3A-اجفب (انظر الجدول للمواد) بتضخيم DNMT3A في الجزء 5 بامهي-429/R '-جاجكجاتكككككتكككج-3' 5 بامهي-429/L '-كتكتككاكتجككجاتككج-3' (الشكل 3). لتوسيع المنطقة التي تحتوي على DNMT3A، استخدام الشروط التالية: (1) 95 درجة مئوية مقابل 60 s، (2) 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، (3) 60 درجة مئوية 20 s، (4) 68 درجة مئوية ل 60 س. كرر الشروط 2 إلى 4 30 x. للتمديد النهائي، استخدام 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وعقد 4 درجات مئوية.
    3. استنساخ جزء DNMT3A، يهضم إنزيم تقييد بامهي، في موقع بامهي pBK301 تعديل مكافحة ناقلات تحمل dCas9. التحقق من الاستنساخ قبل مباشرة سانغر التسلسل. علما أن بلازميد وادي إلى المرافئ التحوير dCas9-DNMT3A-p2a-بوروميسين. بلازميد تعرب عن سقالة جرنا من مروج U6 البشري (الشكل 3).
    4. استبدال الجينات مراسل بوروميسين بالبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) لإنشاء dCas9-DNMT3A-p2a-التجارة والنقل. هضم dCas9-DNMT3A-p2a-بورو بلازميد مع فسيي. تنقية جزء متجه على استخدام أسلوب تنقية هلام. إعداد الإدراج بهضم pBK201a (بلينتي-التجارة والنقل) مع فسيي. استنساخ جزء فسيي داخل المتجهة. PBK539 بلازميد وادي إلى المرافئ التحوير dCas9-DNMT3A-p2a-التجارة والنقل (الشكل 3).
  2. استزراع خلايا HEK-293T وطلاء الخلايا تعداء
    ملاحظة: الكلي الجنينية البشرية 293T تستزرع خلايا (HEK-293T) في الجلوكوز عالية كاملة تعديل دولبيكو المتوسطة النسر (دميم؛ 10% مصل العجل البقري، 1 x مضاد حيوي فطري، بيروفات صوديوم x 1، 1 x غير الأساسية من الأحماض الأمينية، 2 مم L-الجلوتامين) عند 37 درجة مئوية مع 5% أول أكسيد الكربون 2. من المستحسن لإمكانية تكرار نتائج البروتوكول، لاختبار مصل العجل عند التبديل إلى الكثير/مجموعة مختلفة. ما يصل إلى ستة 15 سم تحتاج لوحات لإنتاج لينتيفيرال.
    1. استخدام خلايا المرور منخفضة لبدء ثقافة جديدة (أقل من مرور 20). حالما تصل الخلايا إلى التقاء 90%-95%، نضح وسائط الإعلام وغسله برفق مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
    2. إضافة 2 مل التربسين-يدتا (0.05%) واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. لإلغاء تنشيط الكاشف الانفصال، إضافة 8 مل كاملة عالية-الجلوكوز دميم، وماصة 10 x x-15 مع ماصة 10 مل مصلية لإنشاء تعليق خلية واحدة من 4 × 106 خلايا/مل.
    3. ترانسفيكشنز، معطف لوحات 15 سم مع الجيلاتين 0.2%. إضافة 22.5 مل من الجلوكوز عالية متوسطة والبذور الخلايا عن طريق إضافة 2.5 مل تعليق خلية (مجموع ~ 1 × 107 خلايا/اللوحة). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 حتى يتم التوصل إلى التقاء 70% – 80%.
  3. تعداء الخلايا HEK-293T
    1. إعداد 2 × الحل مخزنة بس بب س و كاكل 1 م2، وفقا فيجايراغافان وكانتور35. تصفية الحلول بتمريرها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية. مزيج تعداء يجب أن تكون واضحة قبل به، بالإضافة إلى الخلايا. إذا كان هذا المزيج يصبح غائم أثناء الحضانة، إعداد x BBS 2 جديدة (الرقم الهيدروجيني = 6.95).
    2. لإعداد مزيج بلازميد، استخدم والبلازميدات أربعة كما هو موضح (المزيج التالي غير كافية للوح واحد 15 سم): 37.5 ميكروغرام ناقل كريسبر/dCas9-نقل (pBK492 [DNMT3A-بورو-لا-جرنة] أو pBK539 [DNMT3A-التجارة والنقل-لا-جرنة])؛ 25 ميكروغرام من pBK240 (psPAX2)؛ 12.5 ميكروغرام من pMD2.G؛ 6.25 ميكروغرام من برسف-رؤيا (الشكل 4 أ). حساب حجم والبلازميدات استناداً إلى التركيزات وإضافة الكميات المطلوبة في أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة ميليلتر 312.5 م 1 كاكل2 وإحضار وحدة التخزين النهائي إلى 1.25 مل، عقيمة ح دد2"سين بلطف" باستخدام إضافة 1.25 مل 2 حل x BBS حين فورتيكسينج هذا المزيج. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أصبحت جاهزة تعداء الخلايا مرة واحدة هم روافد 70% – 80%.
    3. نضح وسائط الإعلام واستبدله 22.5 مل دميم عالية-الجلوكوز الطازجة دون المصل. إضافة 2.5 مل المخلوط تعداء dropwise لكل لوحة 15 سم. دوامة اللوحات واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 2 – 3.
    4. بعد ح 3، إضافة 2.5 مل (10%) من المصل للوحة الواحدة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    5. في اليوم الأول بعد تعداء، مراقبة الخلايا للتأكد من أنه لا يوجد أي أو موت الخلية الحد الأدنى وأن الخلايا تشكل ثقافة المتلاقية (100%).
      1. تغيير وسائط الإعلام عن طريق إضافة 25 مل من الطازجة عالية-الجلوكوز دميم و 10% مصل لكل لوحة.
    6. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 48.
  4. حصاد الفيروس
    1. جمع المادة طافية من كافة الخلايا ترانسفيكتيد وتجمع لهم في أنابيب مخروطية 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400-450 x ز للحد الأدنى 10 تصفية المادة طافية من خلال وحدة تصفية فراغ 0.45 ميكرومتر. وبعد الترشيح، ويمكن الاحتفاظ بالمادة طافية في 4 درجات مئوية للتخزين القصير الأجل (تصل إلى 4 أيام). للتخزين على المدى الطويل، إعداد مختبرين وتخزينها في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الاستعدادات الفيروسي نونكونسينتراتيد من المتوقع أن تكون ~ 2 × 107 إلى 3 × 107 فو/مليلتر (راجع المقطع 1.5 لتحديد عيار). ينصح بتحضير مختبرين تستخدم مرة واحدة، منذ عدة دورات تجميد أذاب سوف يؤدي إلى فقدان 10% – 20% في التتر الوظيفية.
  5. تركيز الجزيئات الفيروسية
    ملاحظة: للتنقية، يقوم الأسلوب المزدوج-السكروز خطوتين تشمل سكروز تدرج خطوة وخطوة وسادة سكروز (الشكل 4 باء).
    1. لإنشاء تدرج سكروز، تعد هذه الأنابيب المخروطية تنبيذ فائق بالترتيب التالي: 0.5 مل من محلول السكروز 70% في برنامج تلفزيوني 1 x، 0.5 مل من محلول السكروز 60% في 1 مل من محلول السكروز 30% في دميم دميم و 2 مل من محلول السكروز 20% في برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. إضافة المادة طافية، التي تم جمعها ووفقا للفرع 1-4، بعناية، للتدرج. نظراً لحجم إجمالي التي تم جمعها من أربع لوحات 15 سم 100 مل، استخدم ستة تنبيذ فائق أنابيب لمعالجة المادة طافية الفيروسية.
    3. توزيع متساو المادة طافية الفيروسية بين كل أنبوبة تنبيذ فائق. لتجنب الكسر الأنبوبة أثناء الطرد المركزي، ملء أنابيب تنبيذ فائق إلى مالا يقل عن ثلاثة-الرابعة وقدرتها في الحجم الإجمالي. تحقيق التوازن بين الأنابيب مع برنامج تلفزيوني 1 x. الطرد المركزي هذه العينات في 70,000 س ز 2 ح في 17 درجة مئوية.
      ملاحظة: للحفاظ على طبقة السكروز أثناء خطوات التسارع والتباطؤ، تسمح ultracentrifuge التعجيل ببطء ويتباطأ الدوار من 0 إلى 200 × ز ومن 200 إلى 0 x ز خلال أول وآخر 3 دقائق من الدوران، على التوالي.
    4. بلطف بجمع الكسور السكروز 30%-60% في أنابيب نظيفة (الشكل 4 باء). إضافة 1 × برنامج تلفزيوني (الباردة) يصل إلى 100 مل حجم الإجمالي. مزيج من بيبيتينج عدة مرات.
    5. بعناية، التجهيزة إعداد الفيروسية على وسادة سكروز بإضافة 4 مل من محلول السكروز 20% (في 1 x PBS) إلى الأنبوبة. مواصلة طريق بيبيتينج ~ 20 – 25 مل من محلول الفيروسية لكل أنبوبة. ملء الأنابيب مع برنامج تلفزيوني 1 x إذا كان حجم محتوياتها أقل من الرابعة وثلاثة كل أنبوب. موازنة الأنابيب بعناية. أجهزة الطرد المركزي في 70,000 س ز ح 2 في 17 درجة مئوية. إفراغ المادة طافية وعكس الأنابيب على مناشف ورقية للسماح بباقي السائل إلى استنزاف.
    6. إزالة جميع السائل بحذر يسفط السائل المتبقية. لاحظ أنه، في هذه الخطوة، والكريات المحتوية على الفيروس مرئية بالكاد كبقع صغيرة شفافة. إضافة 70 ميليلتر من 1 x برنامج تلفزيوني للأنبوب الأول ريسوسبيند بيليه. دقة "الماصة؛" التعليق ونقله إلى الأنبوب القادم حتى يتم حراكه جميع الكريات.
    7. غسل الأنابيب مع ميليلتر 50 إضافية 1 × برنامج تلفزيوني ومزيج قبل. علما بأن حجم تعليق نهائي في هذه الخطوة، هو ميليلتر ~ 120 ويظهر قليلاً من درب التبانة. للحصول على تعليق واضح، المضي قدما في استخدام الطرد المركزي s 60 في 10,000 س ز. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وجعل 5 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الاستعدادات متجه لينتيفيرال حساسة بدورات متكررة للتجميد والذوبان. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترح أن الخطوات المتبقية يتم القيام به في احتواء زراعة الأنسجة أو في مكان مخصص للمناطق المؤهلة من حيث كونها في مستويات كافية من معايير السلامة البيولوجية (الشكل 4 باء).
  6. التحديد الكمي التتر الفيروسية
    ملاحظة: تقدير التتر الفيروسية تتم باستخدام الأسلوب الإنزيم (إليزا) المرتبط بالانزيم الممتز p24 (p24اسكت أليسا) ووفقا "برنامج لقاح الإيدز المعاهد الوطنية للصحة" (NIH) البروتوكول لفيروس نقص المناعة البشرية-1 p24 "مستضد التقاط المقايسة" مع تعديلات طفيفة.
    1. استخدم 200 ميليلتر من 0.05% توين 20 x 1 الباردة في برنامج تلفزيوني (برنامج تلفزيوني-T) لغسل آبار صفيحة 96-جيدا 3 x.
    2. لمعطف اللوحة، استخدم 100 ميليلتر من جسم [مونوكلونل] مكافحة-p24 المخفف في 1:1,500 في برنامج تلفزيوني 1 x. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد كاشف الحظر (1% البقري الزلال [جيش صرب البوسنة] في برنامج تلفزيوني 1 x) وإضافة 200 ميليلتر لكل بئر لتجنب الربط غير محدد. استخدم 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-T لغسل x 3 جيد لح 1 على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    4. المضي قدما في إعداد عينة. عند العمل مع ناقل تتركز الأعمال التحضيرية، تضعف الموجه في 1: 100 باستخدام 1 ميليلتر من العينة وميليلتر 89 ح دد20 10 ميليلتر من Triton X-100 (بتركيز نهائي 10%). للتحضير نونكونسينتراتيد، يؤدي إلى تمييع العينات في 01:10.
    5. الحصول على فيروس نقص المناعة البشرية-1 المعايير باستخدام إضعاف مسلسل ذات شقين (تركيز انطلاق 5 نانوغرام/مل).
    6. تمييع العينات مركزة (أعد الخطوة 1.6.4) في 1640 RPMI تستكمل مع 0.2% 20 توين و 1% جيش صرب البوسنة للحصول على 01:10، 000، 01:50، 000، وتخفيف 1:250,000. وبالمثل، تمييع العينات نونكونسينتراتيد (أعد الخطوة 1.6.4) في 1640 RPMI تستكمل مع 0.2% 20 توين و 1% جيش صرب البوسنة إقامة 1: 500، 1:2، 500، وتخفيف 1:12,500.
    7. إضافة إلى عينات والمعايير على اللوحة في تريبليكاتيس. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    8. وفي اليوم التالي يغسل الآبار 6 x.
    9. إضافة 100 ميليلتر من جسم p24 مكافحة أرنب [بولكلونل]، تضعف في 1:1,000 في RPMI 1640، 10% مصل بقرى الجنين (FBS) وجيش صرب البوسنة 0.25% والمصل الماوس العادية 2% (المتحف)، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 4.
    10. غسل الآبار 6 x. إضافة الماعز الأرنب المضادة الفجل البيروكسيديز مفتش المخفف في المضيفين في 1640 RPMI تستكمل مع مصل الماعز العادي 5% و 2% NMS، جيش صرب البوسنة 0.25% و 0.01 ٪ 20 توين. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
    11. غسل الآبار 6 x. إضافة الركازة البيروكسيديز TMB واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    12. للتوقف عن رد فعل، بإضافة 100 ميليلتر من 1 N HCl. في قارئ ميكروسكوبية، قياس امتصاص 450 نانومتر.
  7. قياس كثافة مراسل نيون
    1. استخدام تعليق الفيروسية للحصول على إضعاف مسلسل إذ (من 10-1 إلى 10-5) في برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. لوحة 5 × 105 HEK-293T الخلايا في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. تطبيق 10 ميليلتر من كل تمييع الفيروسي على الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 48.
    3. الانتقال إلى الخلية تفعيلها fluorescence الفرز التحليل (نظام مراقبة الأصول الميدانية) على النحو التالي: فصل الخلايا عن طريق إضافة 200 ميليلتر لحل يدتا التربسين 0.05%. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وريسوسبيند لهم في 2 مل متوسطة دميم (بالمصل). جمع العينات في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
    4. إصلاح الخلايا بإضافة 500 ميليلتر من 4% بارافورمالدهيد (PFA) واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. الطرد المركزي في 400 x ز عند 4 درجة مئوية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. تحليل التعبير التجارة والنقل باستخدام أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية، كما هو موضح في أورتينسكي et al.30. لتحديد عيار الوظيفية الفيروسات، استخدم الصيغة التالية.
      figure-protocol-12317
      هنا،
      تيراغرام = عدد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل؛
      Tn = العدد الكلي للخلايا؛
      N = عدد الخلايا ترانسدوسيد؛
      V = حجم المستخدمة لتوصيل (في ميكروليتيرس).
  8. عد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل
    ملاحظة: تحديد تعدد العدوى (وزارة الداخلية) التي يتم استخدامها لتوصيل. اختبار مجموعة واسعة من أشهر (من وزارة الداخلية = 1 إلى وزارة الداخلية = 10).
    1. البذور 3 × 105 إلى 4 × 105 HEK-293T الخلايا في كل من لوحة 6-جيدا جيدا.
    2. عندما تصل إلى الخلايا > التقاء 80%، ترانسدوسي لهم مع الموجه في وزارة الداخلية للفائدة.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2، ورصد إشارة بروتينات فلورية خضراء في الخلايا 1 – 7 أيام.
    4. حساب عدد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل. استخدام مجهر فلوري (الهدف 4 x الخطة، 0.1 N.A.، 40 x التكبير) باستخدام عامل تصفية بروتينات فلورية خضراء (الطول الموجي الإثارة = 470 شمال البحر الأبيض المتوسط، والطول الموجي الانبعاثات = 525 نانومتر). استخدام خلايا أونترانسدوسيد إلى مجموعة السكان مراقبة الخلايا السلبية التجارة والنقل.
    5. تستخدم الصيغة التالية لتحديد عيار الوظيفية للفيروس.
      figure-protocol-13527
      هنا،
      N = عدد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل؛
      D = عامل التخفيف؛
      M = عامل التكبير؛
      V = حجم الفيروس المستخدمة لتوصيل.
      ملاحظة: حساب النتائج بعد هذا المثال: لعد في إضعاف (د) 10-4 (01:10، 000) في 20 x التكبير (M) في عينة 10 ميليلتر (V) خلايا الحاملات للتجارة والنقل 10 (ن)، ستكون تو في المليلتر (10 × 104) × (20) س (10) × (100) = 2 × 108 فو/مل.

2-التفريق بين الخلايا العصبية السلف تتميز

  1. استزراع هيبسكس
    ملاحظة: هيبسكس من مريض مع تريبليكيشن محور سنكا، ND34391، تم الحصول عليها من "المعهد الوطني للاضطرابات العصبية" و "السكتة الدماغية" (NINDS) الكتالوج (انظر الجدول للمواد).
    1. الثقافة هيبسكس تحت ظروف مستقلة عن التغذية في مستنبت ESC-اللجنة التوجيهية خالية من علبة التغذية بالورق (انظر الجدول للمواد) على غشاء المصفوفة الأساسية مؤهل هيس (بم)-مغلفة بلوحات (انظر الجدول للمواد). أغسل المستعمرات المتلاقية مع 1 مل من DMEM/F12، إضافة 1 مل كاشف الانفصال (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. نضح الكاشف الانفصال وإضافة 1 مل مستنبت ESC-اللجنة التوجيهية خالية من علبة التغذية بالورق.
    3. كشط لوحة باستخدام رافعة خلايا وريسوسبيند المستعمرات في 11 مل مستنبت ESC-اللجنة التوجيهية خالية من علبة التغذية بواسطة بيبيتينج x-5 4 x باستخدام الماصات البورسليكات.
    4. لوحة 2 مل تعليق مستعمرة على لوحات بم المغلفة ووضع اللوحة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. قم بتغيير متوسط يومي وتقسيم الخلايا كل 5 – 7 أيام.
  2. التمايز في الخلايا العصبية السلف تتميز
    ملاحظة: التفريق بين هيبسكس داخل الخلايا العصبية السلف تتميز (MD الشخصيات) تتم باستخدام بروتوكول متوسطة التعريفي العصبية متاحة تجارياً كل تعليمات الشركات المصنعة، مع تعديلات طفيفة (32 31، انظر الجدول للمواد). ويعتبر اليوم الأول من التفريق بين اليوم 0. هيبسكس عالية الجودة مطلوبة من أجل كفاءة تمايز العصبية. تحريض من الشخصيات MD بيرفورميدوسينج هيئة امبريويد (المجلس التنفيذي)-على أساس البروتوكول.
    1. قبل البدء بالتفريق بين هيبسكس، إعداد لوحة ثقافة ميكروويل (انظر الجدول للمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لها.
    2. وبعد إعداد لوحة الثقافة ميكروويل، أضف 1 مل متوسطة التعريفي العصبية (نيم؛ انظر الجدول للمواد) تستكمل مع 10 ميكرون Y-27632.
    3. تعيين اللوحة جانبا حتى جاهزة للاستخدام.
    4. أغسل هيبسكس مع DMEM/F12، أضف 1 مل من محلول مفرزة الخلية (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    5. ريسوسبيند الخلايا المفردة في DMEM/F12 والطرد المركزي لهم في 300 x غ لمدة 5 دقائق.
    6. نضح المادة طافية بعناية وريسوسبيند الخلايا في نيم + 10 ميكرون Y-27632 للحصول على تركيز نهائي من 3 × 106 خلايا/مل.
    7. أضف 1 مل تعليق خلية واحدة إلى بئر واحدة للوحة الثقافة ميكروويل والطرد المركزي اللوحة في 100 x ز لمدة 3 دقائق.
    8. فحص لوحة تحت المجهر لضمان توزيع حتى الخلايا بين ميكروويل، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
    9. 1 – 4 أيام، إجراء تغيير جزئي متوسط يومي.
    10. استخدام 1 مل ميكروبيبيتي، إزالة 1.5 مل الوسط وتجاهل. ببطء، بإضافة 1.5 مل نيم جديدة دون Y-27632.
    11. كرر الخطوة 2.2.10 حتى يوم 4.
    12. وفي اليوم الخامس، معطف بئر واحدة من صفيحة 6-جيدا مع بم.
    13. ضع مصفاة عكسها 37 ميكرون (انظر الجدول للمواد) على رأس أنبوب مخروطي 50 مل (النفايات). نقطة السهم من مصفاة عكسها نحو الأعلى.
    14. إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة ميكروويل دون إزعاج الحديدية المشكلة.
    15. أضف 1 مل من DMEM/F12 وعلى الفور جمع الحديدية مع ماصة البورسليكات وتصفية لهم من خلال المصفاة.
    16. كرر الخطوة 2.2.15 حتى تتم إزالة جميع الحديدية من لوحة الثقافة ميكروويل.
    17. عكس في المصفاة عبر أنبوب مخروطي 50 مل جديدة وإضافة 2 مل نيم جمع جميع الحديدية.
    18. لوحة 2 مل تعليق اجتماع المجلس التنفيذي في بئر واحدة لصفيحة بم المغلفة باستخدام ماصة البورسليكات. احتضان الحديدية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    19. في يوم 6، إعداد 2 مل نيم + 200 نانوغرام/مليلتر SHH (انظر الجدول للمواد)، وإجراء تغيير متوسط يومي.
    20. وفي يوم 8النظر في النسبة المئوية لتحريض الخلايا العصبية.
    21. عد الحديدية المرفقة كلها، وعلى وجه التحديد، تحديد عدد كل EB الفردية مليء بمأخذ العصبية. التحديد الكمي لاستحثاث روزيت العصبية باستخدام الصيغة التالية.
      figure-protocol-18127
      ملاحظة: إذا كان الاستقراء العصبية < 75%، التحديد روزيت العصبية قد تكون غير فعالة.
    22. وفي يوم 12، إعداد 250 مل متوسطة N2B27 مع مل 119 المتوسطة نيوروباسال، ومل 119 من DMEM/F12 المتوسطة، 2.5 مل جلوتاماكس، 2.5 مل نيا، 2.5 مل ملحق N2، 5 مل B27 دون فيتامين (أ)، 250 ميكروليتر من الجنتاميسين (50 ملغم/مل) ، و 19. 66 ميكروليتر من جيش صرب البوسنة (7 مغ/مل).
    23. لإعداد 50 مل من إكمال N2B27 المتوسطة، إضافة 3 ميكرومتر 2 ميكرومتر، CHIR99021 SB431542، 20 نانوغرام/مل بفجف و 20 نانوغرام/مليلتر لو 200 نانوغرام/مليلتر SHH.
      ملاحظة: من المهم إعداد المكتملة متوسطة الحق قبل الاستخدام.
    24. نضح المتوسطة من الآبار التي تحتوي على مأخذ العصبية وتغسل مع 1 مل من DMEM/F12.
    25. الإعلانية 1 مل كاشف التحديد روزيت العصبية (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 1.
    26. إزالة التحديد الكاشف، واستخدام بيبيتور 1 مل، تهدف مباشرة إلى مجموعات روزيت.
    27. إضافة التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل وكرر الخطوات 2.2.25 و 2.2.26 حتى غالبية المجموعات روزيت العصبية التي تم جمعها.
      ملاحظة: لتجنب التلوث بأنواع الخلايا نونيورونال، لا أوفيرسيليكت.
    28. الطرد المركزي من تعليق روزيت في 350 x ز لأدنى 5 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند مأخذ العصبية في N2B27 + 200 نانوغرام/مليلتر SHH. إضافة تعليق روزيت العصبية إلى بئر بم المغلفة واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    29. أيام 13 – 17، إجراء تغيير متوسط يومي استخدام المكتملة N2B27 المتوسطة. مرور الخلايا عند الثقافات روافد 80%-90%.
    30. لتقسيم الخلايا، تعد لوحة بم المغلفة.
    31. تغسل الخلايا مع 1 مل من DMEM/F12 ونضح المتوسطة، وإضافة 1 مل كاشف الانفصال (انظر الجدول للمواد).
    32. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية وإضافة 1 مل من DMEM/F12، وإزاحة الخلايا المرفقة بها بيبيتينج صعودا وهبوطاً. جمع تعليق المجلس الوطني في أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    33. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل N2B27 كاملة + 200 نانوغرام/مليلتر SHH.
    34. عد الخلايا ولوحة لهم في كثافة 1.25 × 105 خلايا/سم2، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    35. تغيير من المتوسط كل يوم، باستخدام N2B27 كاملة + 200 نانوغرام/مليلتر SHH.
      ملاحظة: في هذا المقطع، والشخصيات تعتبر مرور (ف) 0. يمكن سحب SHH من متوسطة N2B27 في P2.
    36. مرور الخلايا بمجرد وصولها إلى التقاء 80%-90%.
    37. وفي هذه المرحلة، تؤكد أن الخلايا التعبير عن علامات نيستين و FoxA2 باستخدام إيمونوسيتوتشيميستري وقبكر. هذا البروتوكول يؤدي إلى توليد خلايا إيجابية مزدوجة 85% لعلامات نيستين و FoxA2.
    38. بالنسبة باساجينج الخلايا، كرر الخطوات 2.2.31–2.2.36.
    39. تجميد الخلايا، بدءاً من مرور P2. لتجميد الخلايا، كرر الخطوات 2.2.31–2.2.36 وريسوسبيند بيليه الخلية على 2 × 106 إلى 4 × 106 خلايا/مل باستخدام السلف العصبية الباردة تجميد المتوسطة (انظر الجدول للمواد).
    40. نقل 1 مل تعليق خلية في كل كريوفيال وتجميد الخلايا باستخدام نظام تبريد قياسية بطء معدل يسيطر عليها. للتخزين على المدى الطويل، إبقاء الخلايا في نيتروجين سائل.
  3. ذوبان الجليد الشخصيات MD
    1. إعداد لوحة بم المغلفة والحارة N2B27 كاملة. إضافة 10 مل من DMEM/F12 الحارة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. مكان كريوفيال في كتلة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
      1. نقل الخلايا من كريوفيال أن الأنبوب الذي يحتوي على DMEM/F12. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
      2. نضح المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا في 2 مل N2B27، وإضافة تعليق خلية إلى واحد من لوحة بم المغلفة جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.

3-توصيل MD الشخصيات وتحليل التغيرات مثلايشن

  1. توصيل الشخصيات MD
    1. ترانسدوسي "الشخصيات العضو المنتدب" في التقاء 70% مع ناقلات LV-جرنة/dCas9-DNMT3A في وزارة الداخلية = 2. استبدال بوستترانسدوكشن ح 16 متوسطة N2B27.
    2. إضافة N2B27 مع 5 ميكروغرام/مل بوروميسين، ح 48 بعد توصيل. ثقافة الخلايا لمدة 3 أسابيع في N2B27 بالإضافة إلى بوروميسين للحصول على خطوط "نواب العضو المنتدب" مستقرة. الخلايا على استعداد لتطبيقات المصب (الحمض النووي، الجيش الملكي النيبالي، ويحلل البروتين، توصيف المظهرية23، تجميد وباساجينج).
  2. وصف الشخصية مثلايشن من سنكا إنترون 1
    1. استخراج الحمض النووي من كل خلية ستابلي ترانسدوسيد كيت خط تستخدم استخراج الحمض النووي (انظر الجدول للمواد).
    2. استخدام 800 نانوغرام من الحمض النووي لإجراء تحويل بيكبريتيت، استخدام المتاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد). بعد التحويل، وبيكبريتيت الوت الحمض النووي بيكبريتيت تحويلها إلى 20 نانوغرام/ميليلتر.
  3. بكر لتحليل بيروسيكوينسينج
    1. إعداد مزيج PCR الرئيسي في أنبوب نوكلاس مجاناً. لكل رد فعل، استخدم ميليلتر 0.4 من عكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، 0.4 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 1.6 ميليلتر مجكل2 (25 مم)، 2 ميليلتر من 10 × "التركيز كورالواد"، 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي x PCR 2، 4 ميليلتر من 5 س س-الحل، 1 ميليلتر من الحمض النووي ، و 0.6 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
    2. نقل لوحة الرد على ثيرموسيكلير وإجراء PCR استخدام الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 50 دورة 94 درجة مئوية لمدة 30 ق، 56 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع خطوة تمديد نهائي 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. يتم سرد أجهزة الإشعال المستخدمة بيروسيكوينسينج من سنكا إنترون 1 في الجدول 1و الشكل 7 ألف التكميلي الرقم 1.
    3. وبعد التضخيم، تصور أمبليكونس استخدام 2 ميليلتر من منتج PCR مع اثيديوم بروميد تلطيخ، التالية [اغروس] هلام التفريد.
    4. فحوصات بيروسيكوينسينج يتم التحقق من صحة باستخدام خليط من أونميثيلاتيد (U) وميثليته (M) تحويل بيكبريتيت السلطات الوطنية المعينة في النسب التالية، إلا وهي 100U:0M، 75U:25M، 50U:50M، 25U:75M، و 0U:100M (انظر الجدول للمواد).
    5. إجراء بيروسيكوينسينج باستخدام الكواشف بيروسيكوينسينج (انظر الجدول للمواد)، وحساب القيم مثلايشن لكل موقع البد استخدام البرمجيات بيروسيكوينسينج. لبروتوكول بيروسيكوينسينج مفصلة، راجع اسيل et al.37.

النتائج

التحقق من صحة التتر الإنتاج موجهات LV-dCas9-DNMT3A-بروتينات فلورية خضراء/بورو مقارنة بنظيره بروتينات فلورية خضراء ساذجة

أجرينا p24اسكت أليسا لمقارنة بين التتر المادية من LV-dCas9-DNMT3A-بروتينات فلورية خضراء/بورو مع نظرائهم بروتينات فل...

Discussion

LVs قد بدأت في الظهور كالوسيلة للاختيار لتحرير ابيجينومي، لا سيما في سياق الأمراض الوراثية، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على (ط) استيعاب حمولات كبيرة من الحمض النووي و (ii) ترانسدوسي كفاءة مجموعة واسعة من تقسيم والخلايا نونديفيدينج. فعالية العبوة الكبيرة LVs مفيد بوجه خاص للتطبيقات التي تنطوي ع?...

Disclosures

جامعة ديوك قدم طلب براءة المؤقت ذات الصلة بهذه الدراسة.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل جزئيا بجائزة التنمية الأعصاب خان (لقائد) والوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) (NS085011 R01 إلى قائد).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Optima XPN-80 UltracentrifugeBeckman CoulterA99839
0.22 μM filter unit, 1 LCorning430513
0.45-μm filter unit, 500 mLCorning430773
100 mm TC-Treated Culture DishCorning430167
15 mL conical centrifuge tubesCorning430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm GridCorning353025
50 mL conical centrifuge tubesCorning430291
6-well platesCorning3516
Aggrewell 800StemCell Technologies34811
Allegra 25R tabletop centrifugeBeckman Coulter369434
BD FACSBecton Dickinson338960
Conical bottom ultracentrifugation tubesSeton Scientific5067
Conical tube adaptersSeton ScientificPN 4230
Eppendorf Cell Imaging SlidesEppendorf30742060
High-binding 96-well platesCorning3366
Inverted fluorescence microscopeLeicaDM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
Reversible StrainerStemCell Technologies27215
SW32Ti rotorBeckman Coulter369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, NonpyrogenicVWR93000-694
VWR® Vacuum Filtration SystemsVWR89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate readerBio-Rad1681150
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cellsATCCCRL-3216
AccutaseStemCell Technologies7920
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemCell Technologies7010
Anti-FOXA2 AntibodyAbcamAb60721
Anti-Nestin AntibodyAbcamAb18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100xSigma AldrichA5955-100ML
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AThermo Fisher Scientific12587010
BESSigma AldrichB9879 - BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)Thermo Fisher Scientific15260037
CHIR99021StemCell Technologies72052
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning08-774-552
Cosmic Calf SerumHycloneSH30087.04
DMEM-F12Lonza12-719
DMEM, high glucose mediaGibco11965
DNeasy Blood & Tissue KitQiagen69504
EpiTect PCR Control DNA SetQiagen596945
EZ DNA Methylation KitZymo ResearchD5001
GelatinSigma AldrichG1800-100G
GentamicinThermo Fisher Scientific15750078
Gentle Cell Dissociation ReagentstemCell Technologies7174
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Human Recombinant bFGFStemCell Technologies78003
Human Recombinant EGFStemCell Technologies78006
Human Recombinant Shh (C24II)StemCell Technologies78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
mTeSR1StemCell Technologies85850
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502001
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA)HycloneSH30087.04
PyroMark PCR KitQiagen978703
RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific11875-085
SB431542StemCell Technologies72232
Sodium pyruvateSigma AldrichS8636-100ML
STEMdiff Neural Induction MediumStemCell Technologies5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing MediumStemCell Technologies5838
TaqMan Assay FOXA2Thermo Fisher ScientificHs00232764
TaqMan Assay GAPDHThermo Fisher ScientificHs99999905
TaqMan Assay NestinThermo Fisher ScientificHs04187831
TaqMan Assay OCT4Thermo Fisher ScientificHs04260367
TaqMan Assay PPIAThermo Fisher ScientificHs99999904
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300054
Y27632StemCell Technologies72302
NameCompanyCatalog NumberComments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibodyNIH AIDS Research and Reference Reagent Program3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgGSigma Aldrich12-348Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10 mLSigmaG9023Working concentration 1:1000
HIV-1 standardsNIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500 mLEquitech-BioSM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibodyNIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP451T
TMB peroxidase substrateKPL5120-0076Working concentration 1:10,000
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmids
pMD2.GAddgene12253
pRSV-RevAddgene52961
psPAX2Addgene12259
NameCompanyCatalog NumberComments
Restriction enzymes
BsmBINew England BiolabsR0580S
BsrGINew England BiolabsR0575S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
KpnINew England BiolabsR0142S
PacINew England BiolabsR0547S
SphINew England BiolabsR0182S

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176 (2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease. PLOS One. 5 (11), e15522 (2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915 (2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 DNMT3A dCas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved