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摘要

靶向 DNA 表观基因组编辑是一种强有力的治疗方法。该协议描述了一种一体式慢病毒载体的生产、纯化和浓度, 这些载体窝藏 CRISPR9-DNMT3A 转导基因, 用于人类诱导的多能干细胞 (hiPSC) 衍生神经元的表观基因编辑应用。

摘要

hipscs 衍生细胞的使用是研究人类神经退行性疾病的一种有价值的方法。在这里, 我们描述了一个优化的方案, 用于区分从患者的α-syecrin 基因 (Snca) 位点的α-syecin 基因 (Snca) 到帕金森病 (pd) 相关的多巴胺能神经元群的 hpsc。越来越多的证据表明,高 Snca水平是导致 pd 发展的原因. 认识到建立新的 pd 治疗方法的需求未得到满足, 特别是针对snca表达调控的方法, 我们最近开发了一个基于 Crisprce/dna 甲基的系统, 通过丰富Snca内带1调控区域的甲基化水平, 对 snca 转录进行表观调节.为了提供该系统, 包括一个死 (失活) 版本的 Cas9 (dCas9) 融合了 Dna 甲基转移酶 3 a (DMT3A) 的催化域, 使用了慢病毒载体。该系统应用于具有 Snca位点的神经, 通过snca内含子1的靶向 dna 甲基化, 可将 snca-mrna 和蛋白质水平降低约 30%. 对 SNCA 水平的微调下调, 可以拯救与疾病相关的细胞表型。在目前的协议中, 我们的目标是描述一个逐步的过程, 区分高维动物分为神经祖细胞 (Npc), 并建立和验证热测序检测, 以评估在 Snca中的甲基化剖面内德龙 1.为了更详细地概述这些实验中使用的小病毒-Crispr/cas9 系统, 该协议描述了如何生产、纯化和浓缩慢病毒载体, 并强调了它们是否适合于使用Hpsc 和 Npc。该协议易于适应, 可用于生产高滴度慢病毒的体外和体内应用。

引言

最近开发了多个表观基因组编辑平台, 针对控制基因表达1,2的区域中的任何 dna 序列。创建的表观基因组编辑工具旨在 (i) 调节转录, (ii) 改变翻译后组蛋白修饰, (iii) 修改 DNA 甲基化, (四) 调节调控元素相互作用。将转录-染色质改性剂固定到从以前开发的表观基因编辑平台 (如锌指蛋白 (Zfp) 和转录激活剂 (Tals) 中提出的失活 (死) Cas9 (Dcas9) 的方法,具有强大的转录效应域 (ED) 融合到设计的 dna 结合域 (DBD)3。所需表型 (如激活或抑制) 的结果由锚定在内源位点上的效应分子定义 (图 1)。为了创建可编程转录激活剂, dcas9/grna 模块与 vp164、5、6 (图 1a) 相连, 这是一个病毒激活域, 它招募了 pol ii 和一般转录机制。该系统的修改包括 vp64, vp16 域的四聚体, 提供了更强大的激活率5,6。该系统已成功地用于通过定位促进者和调控元素激活编码和非编码区域。重要的是, 尽管 VP64 分子不会直接改变目标区域中的染色质结构, 但它会招募染色质改性剂, 从而结合活性 (染色质) 标记的沉积, 包括 hh/H4 乙酰化和 H3-k4 二/三甲基化5,6。除 VP64 外, 人类 nf-b 复合体的 p65 亚基还与 dCas9/gRNA 模块7相连。有趣的是, 这些效应因子与转录起始位点 (Tss) 上游区域和启动子内的连接会导致强基因诱导。然而, vp64 和 p65 效应器也可以发挥激活作用, 同时与位于 tss 下游和远端增强器7,8的区域相连。为了获得更有力的转录反应, 需要招募多个 dcas9-vp64 或 dcas9-p65 融合到一个单一的目标位点9,10。因此, 与 Dcas9-vp64 融合对应者相比, 最近开发的下一代激活器通过 suntag 等单个 Dcas9-grna 复合体招募多个效应域,从而提高了激活能力11,12. 通过将 vp64、P65 和 RTA (vpr)----从γ-疱疹病毒到 dcas9 13 c-末端的转激活域----融合在一起, 获得了更好的转录激活 (图 1 a)。为针对具体目标的镇压开发了类似的 Crispr/cas9 系统 (图 1b)。

内源基因抑制可以通过工程抑制融合通过各种机制实现 (图 1b)。已经证明, crispr/dcas9 系统与抑制 dbd 相连 (即使没有效应因子 domain s), 可以有效地沉默基因表达, 同时与启动子或上流-向下-tss 区域3,6 ,14。转录因子结合和 RNA 聚合酶处理对转录的影响是由类固醇干扰引起的。然而, 需要更全面的方法, 因为仅仅通过位块来抑制基因往往不足以进行强有力的沉默。基于 Crispr/cas9 系统的消音器的最新发展, 该系统具有转录抑制域 (Trd)、组蛋白修饰剂 (H3-k9-Di-t"甲基化、H3-k27----三甲基化;h3-k36-/三甲基化, h h4 去乙酰化) 和 dna (cpg) 甲基化导致表观遗传工具的构建, 允许更强大的沉默效果4,5,15,16, 17,18,19,20。已经证明, 这些表观遗传修饰剂的制备 dna 可能会导致形成更封闭和浓缩的染色质, 这通常会产生更有效的沉默结果21,22。dbd 最常用的静音域是与 Krüppel-associated 的盒子 (krab)4,5。该因子的招募已被证明与染色质的变化相对应;然而, 这些修改的机制还有待阐明 16、17、18。最近, 已经证明, KRAB 定位 DNA 可以促进组蛋白甲基转移酶 SETDB1 和组蛋白去乙酰化 (HDAC) NuRD 复合物的组装, 这表明这些相互作用介导形成的可能性。染色质凝结和转录沉默3,13。作为另一种方法, 效应域可以与 Dbd 融合, 以创建自定义表观遗传沉默蛋白。该系统直接催化抑制性 DNA 标记或组蛋白修饰。

最近, 使用与 DNMT3A 酶结合的合成 Crispr/cas9 系统已被重新用于转录失活。dnmt3a 催化 dna 甲基化, 在内源性基因启动子和其他调控区域异染色质形成过程中进行转录抑制 (图 1b)18、20。McDonald等人, 18岁和 vojta等人, 是第一个报告 dna 甲基化可用于表观基因沉默或抑制的作者, 这表明等离子体交付的 dcas9-dnmt3a 融合系统可以有效地增强胞嘧啶甲基化在 tss18,20附近。麦当劳和同事证明, 该战略的使用可能会导致大幅减少 (约 40%)在肿瘤抑制基因中, CDKN2A mrna 水平为 18。同样, 针对bach或il6st基因的非甲基化启动子区域显示 cpg 甲基化增加, 这与基因表达20的两倍减少有关.我们的实验室最近重新使用 DNA 甲基化来减轻Snca过度表达的病理结果 (图 2)23。该策略的基础是选择性增强snca内含子1区域内的 dna 甲基化, 因为它以前曾报道过在 pd 和痴呆与莱维体 (dlb) 大脑24,25的低甲基化, 26岁这种低甲基化与snca过度表达有关, 从而为治疗干预提供了一个有吸引力的目标 24,27,28。我们最近在 hpscc 衍生的多巴胺能 npc 中的 Snca 内含子1区域中显示了低 DNA 甲基化水平, 这些 Nbc 是从一个患有 snca三联23的 pd 患者获得的. 这种实验模型的优点是, Npc 可以在培养中有力地繁殖或进一步分化为成熟的神经元, 从而能够有效地筛选, 以识别调节细胞表型的遗传因素, 包括氧化压力和细胞凋亡29。此外, 该模型系统使科学家能够重述患者症状出现前发生的发育事件。此外, hpsc 衍生的 Npc 是测试与基因表达相关的细胞和分子途径的重要工具。重要的是, hepc 衍生的 Npc 与最先进的 Crisprus-epigenome 技术相结合, 可以极大地促进许多神经退行性疾病的 "下一代药物" 的开发。

为了降低 SNCA 表达的病理水平, 我们最近开发了一个基于慢病毒的系统, 该系统携带了 DCAS9-DNMT3A 融合蛋白和 gRNA, 专门针对Snca内含子 1 (图 2a)中的 cpg 甲基化。该协议将详细描述慢病毒载体 (LV) 的设计和生产。Lv 是提供 Crispr/cas9 成分的有效手段, 原因有几个, 即: (一) 它们携带笨重 DNA 插入物的能力, (ii) 高效地传输广泛的细胞, 包括分裂和不分割细胞30和 (iii) 它们诱导最小细胞毒性和免疫原性反应的能力。最近, 我们将 LV 系统应用于具有 Snca位点的复用的患者的 hepc 衍生多巴胺能神经元, 并演示了 lv 在提供表观基因组编辑甲基化工具方面的治疗潜力 23 (图 2 b)。事实上, Lv-grna/dnt3a 系统会导致 Snca 内ss1 区域的 DNA 甲基化显著增加。这一增加与Snca mrna 和蛋白质23水平的降低相对应。此外, snca下调还将相关的表型恢复在snca三联/hipc 衍生的多巴胺能神经元 (例如, 线粒体 ros 的产生和细胞活力)23。重要的是, 我们证明了 Lv-grna-dnas3a 系统在 Snca 表达中的减少能够逆转 Hipc 衍生的多巴胺能神经元的表型, 而这些表型是 hipc 衍生的多巴胺能神经元的特征。SNCA三联, 如线粒体 ros 的产生和细胞活力23。本协议的目的是: 1) 概述用于生成高分病毒制剂的优化 LV 平台的生产和浓缩协议; 2) 描述 Hipsc 向 npc 的分化, 这些差异化模式是成熟的多巴胺能神经元31,32 和描述的甲基化水平的目标区域内 snca 内合子1。

与最流行的载体平台, 即腺相关载体 (aav) 相比, 慢病毒平台具有主要优势, 后者是前者容纳更大的基因插入33、34 的能力。Aav 的产量可以高得多, 但包装能力很低 (lt;4.8 kb), 这影响了其在提供一体机 CRISPR/Cas9 系统方面的使用。因此, 在交付 Crispr/cas9 工具所涉及的应用程序中, Lv 似乎是首选平台。因此, 这里概述的协议将是一个宝贵的工具, 研究人员希望有效地提供表观基因组编辑组件的细胞和器官。该协议进一步概述了通过修改矢量表达盒 30、35中的元素来增加向量的生产和表达能力的策略。该战略以我们实验室开发和研究的新系统为基础, 突出了其在 1010个病毒单位 (vu)/30,35范围内产生病毒颗粒的能力。

研究方案

1. 系统设计和病毒生产

  1. 质粒设计与制造
    请注意:利用 Ortinski 等人出版的生产和表达优化表达盒, 构建了一体机 Lv-grna-dna-dnt3a 矢量.矢量盒式磁带带有转录因子 sp1 的识别点的重复, 并在 3 ' 长的终端重复 (ltr) (ltr) (图 2a) 30、36的未翻译 (u3 ')区域内进行最先进的删除。病媒主干已被发现能够有效地传递和表达 crispr/cas9 30,35。
    1. 通过站点定向诱变 (未显示数据) 获取 SpCas9 (dCas9) 的停用 (死) 版本。用 PBK301 29 中的活性 CAS9 取代 HNH 和 RuvC 催化域中的具有 D10A 和 H840A 突变的克隆, 在 Agi-bbanhi碎片之间交换 (图 3)。
    2. 通过放大 DNMT3A 部分 BAMHI-429/R 5, 从 Pdcas9-dnt3a-egfp (见材料表) 中衍生 DNMT3A 催化域 "gaggggatcccccccccg-3" Bahi-429l 5 '-ctccccccccgggggggg-3 ' (图 3)。要放大包含 DMT3A 的区域, 请使用以下条件: (1) 95°c 为 60秒, (2) 95°c 为 10秒, (3) 60°c 为 20秒, (4) 68°c 为60秒。对于最后的扩展, 请使用 68°c 3分钟, 并保持4°c。
    3. 将 DNMT3A 片段克隆到携带 dcas9 的改良 pBK301 载体的 Bahi 位点, 用 Bahi 限制酶消化。通过直接桑格测序验证克隆。请注意, 所产生的质粒 haspors-dnt3a-p2a-puromycin 转基因。质粒表达了来自人 U6 启动子的 gRNA 支架 (图 3)。
    4. 用绿色荧光蛋白 (GFP) 取代 puromycin 报告基因, 以产生 Dcas9-dnt3a-pcp。摘要 Dcas9-dnt3a-p2a-puro 质粒与 FseI。使用凝胶纯化方法纯化载体片段。用 FseI 消化 pBK201a (Pleti-gfp) 来准备插入物。将 FseI 片段克隆到矢量中。结果的质粒 pBK539 habs DCAS9-DNT3A-P2A-GFP 转基因 (图 3)。
  2. HEK-293T 细胞和转染用电镀细胞的培养
    请注意:人类胚胎肾 293T (HEK-293T) 细胞在37°c 的37°c 培养在完全高血糖的 Dulbecco 改性的鹰培养基 (DMEM; 10% 的牛小牛血清, 1x 抗生素-抗真菌, 1x 亚鲁瓦酸钠, 1x 非必需氨基酸, 2 mM l-谷氨胺) 在37°c 与 5% co2. 为了该协议的重现性, 建议在切换到不同的批次时测试小牛血清。慢病毒生产需要多达 6个15厘米的板。
    1. 使用低通道细胞开始新的培养 (低于第20段)。一旦细胞达到 90%-95% 的融合, 吸气培养基, 并用无菌的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 轻轻清洗。
    2. 添加2毫升色氨酸 edta (0.05%)在37°c 孵育3-5分钟。为了不激活离解试剂, 加入8毫升的完整高血糖 DMEM, 并在移液器10x–15x 与10毫升血清学移液器, 以创建一个单细胞悬浮液 4 x 10 6 细胞/毫升。
    3. 对于转染, 涂15厘米板与0.2% 明胶。加入 22.5 mL 高糖培养基, 加入2.5 毫升细胞悬浮液 (共 ~ 1x 10 7 细胞板), 将细胞播种。在37°c 下, 用5% 的 CO2 将板材培育至 70%-80% 的融合。
  3. HEK-293T 细胞的转染
    1. 根据 Vijayraghavan 和 Kantor35的说法, 准备 2x bes 缓冲溶液 bbs 和 1M ccl2。通过0.22μm 过滤器对解决方案进行筛选, 并将其存储在4°c。转染组合在添加到细胞之前必须是明确的。如果混合物在孵育过程中变得混浊, 准备新鲜的 2倍 BBS (pH = 6.95)。
    2. 要准备质粒混合物, 请使用列出的四个质粒 (以下组合对于一个15厘米的板来说就足够了): 37.5 微克的 Crispr/dcas9 转移载体 (Pbmt3a-puro-no-grna] 或 PBK492 [DNT3A-GFP-NO-GRNA]);25μg 的 pBK240 (psPAX2);12.5 微克的 pMD2.G. g;6.25 微克的 pRSV-rev (图 4a)。根据浓度计算质粒的体积, 并将所需的数量添加到15毫升的锥形管中。加入312μl 的 1 m Ccl2 , 并使最终体积为 1.25 ml, 使用无菌 Dd-h2o. 轻轻加入 1.25 ml 的 2X bbs 溶液, 同时对混合.在室温下孵化30分钟。细胞一旦融合了 70%-80%, 就可以转染了。
    3. 吸收培养基, 用22.5 毫升的新鲜制备的高血糖 DMEM 代替, 不含血清。将转染混合物的2.5 毫升滴入每个15厘米的板。在37°c 下旋转板材并孵育, 用5% 的 CO2 孵育 2-3小时.
    4. 3小时后, 加入2.5 毫升 (10%)在37°c 条件下, 用5% 的 CO2 孵育.
    5. 在转染后的第1天, 观察细胞, 以确保没有或最小的细胞死亡, 细胞形成融合培养 (100%)。
      1. 在每个板中加入25毫升新鲜制备的高血糖 DMEM 和10% 的血清来改变培养基。
    6. 在37°c 下, 用5% 的 CO2 进行 48小时的孵化。
  4. 病毒的收获
    1. 从所有转染细胞中收集上清液, 并将其集中在50毫升的锥形管中。离心机以 400–450 x x g的速度进行10分钟的过滤, 通过0.45 微米的真空过滤器单元过滤上清液。过滤后, 上清液可保存在4°c 下短期储存 (最长 4天)。对于长期储存, 请准备等价物并将其存放在-80°c。
      请注意:非浓缩病毒制剂预计为 ~ 2x10 7 至 3 x 10 7 Vu/vuml (参见第1.5 节, 用于滴度测定).强烈建议准备一次性的等价物, 因为多个冻融循环将导致功能滴度损失 10%-20%。
  5. 病毒颗粒的浓度
    请注意:在纯化过程中, 采用了两步双蔗糖法, 采用蔗糖梯度步骤和蔗糖垫步骤 (图 4B)。
    1. 要创建蔗糖渐变, 按以下顺序制备锥形超离心管: 1x PBS 中70% 蔗糖的 0.5 mL、DMEM 中60% 蔗糖的 0.5 mL、DMEM 中30% 蔗糖的1毫升和 1x PBS 中20% 蔗糖的2毫升。
    2. 小心地将根据第1.4 节收集的上清液添加到梯度中。由于从 4个15厘米板收集的总体积为100毫升, 因此使用6个超离心管处理病毒上清液。
    3. 同样分布病毒上清液在每个超离心管。为避免在离心过程中堵塞管, 将超离心管填充到其总容量的至少四分之三。用 1x PBS 平衡管材。在17°c 条件下, 以 70 x g的速度将样品离心2小时。
      请注意:为了在加速和减速步骤中保持蔗糖层, 允许超离心在旋转的第一个和最后3分钟分别缓慢地加速和减速转子从0到 200 x g 和从 200 x g 到 0 x g。
    4. 轻轻将 30%-60% 的蔗糖组分收集到干净的管中 (图 4b)。添加 1x PBS (冷) 高达总体积的100毫升。通过多次移液进行混合。
    5. 小心地, 通过在试管中加入4毫升的20% 蔗糖 (在 1x PBS 中), 在蔗糖垫上对病毒制剂进行分层。继续通过移液 ~ 20–25毫升的病毒溶液每管。如果管内含量小于四分之三, 则在管中填充 1x PBS。小心平衡管。在17°c 下以 70 x g 离心2小时。清空上清液, 倒置纸巾上的管子, 让剩余的液体排出。
    6. 通过谨慎地吸气剩余的液体来取出所有的液体。请注意, 在此步骤中, 含有病毒的颗粒几乎无法看到为小的半透明斑点。在第一管中加入70μl 的 1x PBS, 以重新悬浮颗粒。彻底移液悬浮液, 并将其转移到下一个管, 直到所有颗粒重新悬浮。
    7. 用额外的 50Μl 1x PBS 清洗管道, 并像以前一样混合。请注意, 在此步骤中, 最终悬架的体积为 ~ 120μl, 并显示为微微。为了获得明确的悬浮液, 请以 10, 000 x g 的速度进行60秒的离心。将上清液转移到新管中, 制成5Μl 的等价物, 并将其存放在-80°c。
      请注意:慢病毒载体制剂对反复的冻融循环敏感。此外, 建议在组织培养遏制或在符合适当生物安全标准水平的指定地区采取其余步骤 (图 4B)。
  6. 病毒滴度的定量
    请注意:病毒滴度的估计是使用 p24 酶联免疫吸附法 (ELISA) 法 (p24 gag elisa) 和根据国家卫生研究院 (nih) 艾滋病疫苗计划协议的 Hiv-1 P24 抗原捕获检测进行的。轻微的修改。
    1. 在冷的 1x PBS (PBS-T) 中, 使用 0.05% tween 20 的200Μl 清洗96孔板3x 的井。
    2. 要覆盖板, 请使用100μl 的单克隆抗 p24 抗体在 1x P24 中以1:1500 稀释。在4°C 下将板材连夜孵化。
    3. 在 1x PBS 中制备阻断试剂 (1% 的牛血清白蛋白 [BSA]), 并在每口井中添加 200Μl, 以避免非特异性结合。使用200μl 的 PBS-T 在室温下清洗3x 至少1小时的井。
    4. 继续进行样品制备。在使用浓缩载体制剂时, 使用样品的1:100、dd-h 2 0 的89μl 和 triton X-100 的 10μl (最终浓度为 10%) 将矢量稀释为 1:100.对于非浓缩制剂, 将样品稀释在1:10。
    5. 通过使用双重连续稀释 (起始浓度为 5 ngml) 获得 HIV-1 标准。
    6. 在 RPMI 1640 中稀释浓缩样品 (1.6.4 步骤), 辅以 0.2% Tween 20 和 1% BSA, 以获得1:10000、1:500000 和 1:250 000 稀释。同样, 在 RPMI 1640 中稀释非浓缩样品 (步骤 1.6.4), 辅以 0.2% Tween 20 和 1% BSA, 以建立1:500、1:2500 和1:12500 稀释。
    7. 在板材上添加样品和标准, 以三重奏为形式。在4°C 下过夜。
    8. 第二天, 洗井6xx。
    9. 加入100μl 的多克隆兔抗 p24 抗体, 在 RPMI 1640 中稀释为 1:1000, 在10% 的胎儿牛血清 (FBS)、0.25% 的 BSA 和2% 的正常小鼠血清 (NMS) 中稀释, 在37°c 孵育4小时。
    10. 洗井6x。在 RPMI 1640 中加入山羊抗家兔辣根过氧化物酶 IgG, 补充5% 正常山羊血清、2% NMS、0.25% BSA 和 0.01% Tween 20, 稀释为1:10000。在37°c 下孵化1小时。
    11. 洗井6x。加入 TMB 过氧化物酶底物, 在室温下孵育15分钟。
    12. 要停止反应, 请加入100μl 的 1 n HCl。在微板读取器中, 测量450纳米的吸收率。
  7. 荧光报告强度的测量
    1. 使用病毒悬浮液在 1x PBS 中获得10倍的连续稀释 (从10-fold 到 10-fold).
    2. 在6孔板的每口井中都有 5 x10 5 hek-293t 电池。将每个病毒稀释的10Μl 应用于细胞, 并在37°c 孵育, 5% co2 , 48小时。
    3. 进行荧光活化细胞分选 (FACS) 分析, 方法如下: 通过添加 200Μl 0.05% 的胰蛋白酶-edta 溶液来分离细胞。在37°c 下将细胞培养 5分钟, 并在 DMEM 培养基 (血清) 2 毫升中重新悬浮。在4°C 下, 以 400 x g 的温度将样品收集到15毫升的锥形管和离心机中。在500μl 的冷 1x PBS 中重新填充颗粒。
    4. 通过添加500μl 的4% 甲醛 (PFA) 并在室温下孵育10分钟来固定细胞。
    5. 在4°C 下以 400 x g离心, 并在 1X pbs 的1毫升中重新悬浮颗粒。使用流式细胞仪分析 GFP 表达, 如 Ortinski 等人30中所述。若要确定病毒功能滴度, 请使用以下公式。
      figure-protocol-6576
      这里
      Tg = gfp 阳性细胞的数量;
      Tn = 细胞总数;
      N = 被转移的细胞总数;
      V = 用于转导的体积 (以微升为单位)。
  8. 对 gfp 阳性细胞进行计数
    请注意:确定用于转导的感染 (MOI) 的多样性。测试范围广泛的 Moi (从 MOI = 1 到 MOI = 10)。
    1. 种子 3 x10 5 至 4 x 10 5 Hek-293t 细胞每口井的一个6孔板。
    2. 当细胞达到 & & gt;80% 的融合时, 用感兴趣的 MOI 的载体将它们转化出来。
    3. 用5% 的 CO2 在37°c 下进行培养, 并监测细胞中的 gfp 信号1-7天。
    4. 计算 gfp 阳性细胞的数量。使用荧光显微镜 (计划4倍目标, 0.1 n. a., 40x 放大倍率) 使用 GFP 过滤器 (激发波长 = 470 nm, 发射波长 = 525 nm)。使用未转移的细胞来设置 gfp 阴性细胞的控制种群。
    5. 使用以下公式来确定病毒的功能滴度。
      figure-protocol-7242
      这里
      N = gfp 阳性细胞的数量;
      D = 稀释系数;
      M = 放大倍率;
      V = 用于转导的病毒体积。
      注: 计算此示例后的结果: 对于 10个 gfp 阳性细胞 (n) 计数为稀释 (D) 10-4 (1 : 10000) 在10Μl 样品 (v) 中的20x 放大倍率 (m) 下, 每毫升的 tu 为 (10 x 10 4) x (20) x(10) x (100) = 2 x 108武姆

2. 多巴胺能神经祖细胞的分化

  1. 培养高保能和私营保安公司
    注:来自 snca 位点 nd34391 的患者的 hpsc 是从国家神经疾病和中风研究所 (ninsd) 目录中获得的 (见材料表)。
    1. 在无微弱独立的 ESC-iPSC 培养基 (见材料表) 中培养高维菌素, 贴在符合 hesco 条件的基本基质膜 (bmm) 涂层板上 (见材料表)。用1毫升的 DMEM/F12 清洗融合菌落, 加入1毫升的离解试剂 (见材料表), 并在室温下孵育3分钟。
    2. 吸收离解试剂, 加入1毫升无助推性 ESC-iPSC 培养基。
    3. 使用细胞提升器刮板, 并使用硼硅酸盐移液器移液4x–5x 在11毫升的无质 ESC-iPSC 培养基中重新悬浮菌落。
    4. 板2毫升的菌落悬浮在 bmm 涂层板上, 并将板放置在37°c 与 5% CO2。每天进行介质变化, 每5-7天拆分一次细胞。
  2. 多巴胺能神经祖细胞分化为多巴胺能
    请注意:根据制造商的指示, 使用市售神经感应介质协议, 将高 psc 分化为多巴胺能神经祖细胞 (md npc), 略作修改31,32 (请参见材料表)。区分的第一天被考虑作为天 0。高质量的高 Psc 是高效神经分化所必需的。MD Npc 的诱导是利用基于胚胎体 (EB) 的协议进行的。
    1. 在开始区分高聚多氯塞病药之前, 请根据制造商的说明准备一个微井培养板 (见材料表)。
    2. 制备微井培养板后, 加入1毫升的神经诱导介质 (NIM; 见材料表), 辅以 10μm y-27632。
    3. 把盘子放在一边, 直到可以使用。
    4. 用 DMEM/F12 清洗 Hispc, 加入1毫升的细胞分离溶液 (见材料表), 在37°c 孵育 5分钟, 用5% 的 co2 孵育。
    5. 在 DMEM/F12 中重新移植单个细胞, 并以 300 x g离心5分钟。
    6. 小心吸气上清液, 并重新悬浮 NIM + 10μm y-27632 中的细胞, 以获得 3 x10 6 细胞的最终浓度。
    7. 将单细胞悬浮液的1毫升加入微井培养板的单井, 并以 100 x g离心板3分钟。
    8. 在显微镜下检查板, 以确保细胞在微井中的均匀分布, 并在37°c 孵育细胞与5% 的 CO2.
    9. 在第1– 4天, 执行每日部分介质更改。
    10. 使用1毫升微移液器, 取出 1.5 mL 的介质并丢弃。慢慢地, 在没有 Y-27道理的情况下加入1.5 毫升新鲜的 NIM。
    11. 重复步骤2.2.10 直到第4天。
    12. 第5天, 用 bmm 覆盖6孔板的一口井.
    13. 将37微米可逆过滤器 (见材料表) 放在50毫升锥形管 (废物) 的顶部。向上点可逆过滤器的箭头。
    14. 在不干扰形成的 eb 的情况下, 从微井培养板上取出培养基。
    15. 加入1毫升的 dmemmef12, 及时收集 Eb 硅酸盐移液器, 并通过过滤器对其进行过滤。
    16. 重复步骤 2.2.15, 直到从微井培养板上取出所有 Eb。
    17. 将过滤器倒置在一个新的50毫升锥形管, 并添加2毫升的 NIM 来收集所有的 Eb。
    18. 板材2毫升的 EB 悬浮液进入 bmm 涂层板的单井, 采用硼硅酸盐移液器。用5% 的 CO2 在37°c 下培养 Eb.
    19. 第6天, 准备2毫升的 nim + 200 ngml shh (见材料表), 并执行每日介质变化。
    20. 第8天, 检查神经元诱导的百分比。
    21. 计算所有附加的 Eb, 具体确定每个充满神经玫瑰的 eb 的数量。使用以下公式对神经玫瑰诱导进行量化。
      figure-protocol-9822
      请注意:如果神经感应 lt;75%, 神经玫瑰的选择可能效率低下。
    22. 第12天, 用119毫升的神经基部培养基制备250毫升 n2b27 培养基, DMM/2 f12 培养基119毫升, 谷胱甘肽 2.5 ml, neaa 2.5 ml, na2 补充 2.5 ml, 没有维生素 a 的 B27 5 毫升, 庆大霉素 255μl (50 mgmml), 和 19.66微米 BSA (7 Mg/ml)。
    23. 制备50毫升的完整 N2B27 培养基, 加入 3μm CHIR99021, 2Μm SB431542, 20 ngml bfgf, 20 ngml EGF, 和 200 ngml SHH。
      请注意:重要的是要在使用前准备好完成的介质。
    24. 从含有神经玫瑰的井中吸气培养基, 用 dmmmw f12 的1毫升清洗。
    25. 神经玫瑰选择试剂 (见材料表) 的 Ad 1 ml, 在37°c 下孵育, 5% co2为1小时。
    26. 取出选择试剂, 并使用1毫升移液器, 直接瞄准玫瑰团。
    27. 将悬浮液添加到15毫升锥形管中, 并重复步骤2.2.25 和 2.2.26, 直到收集了大部分的神经玫瑰簇。
      请注意:为避免非神经元细胞类型的污染, 请不要过度选择。
    28. 以 350 x g离心玫瑰悬浮液 5分钟, 吸收上清液, 并重新悬浮 n2b27 + 200 Ng/ML shh 中的神经玫瑰。将神经玫瑰液悬浮液加入 bmm 涂层井中, 在37°c 下孵育板, 并采用 5% co 2。
    29. 在13–17天, 使用完整的 N2B27 介质执行每日介质更改。当培养物 80%-90% 融合时, 通过细胞。
    30. 要拆分电池, 请准备一个 bmm 涂层板。
    31. 用 DMEM/F12 的1毫升清洗细胞, 吸入培养基, 并添加1毫升的离解试剂 (见材料表)。
    32. 在37°c 下孵化 5分钟, 加入1毫升的 dmemmcaf12, 并通过上下移液移出附着的细胞。收集 Npc 悬浮液在一个15毫升锥形管。以 300 x g 离心 5分钟 。
    33. 在完整的 N2B27 + 200 ngml shh 的1毫升中吸吸上清液并重新悬浮细胞。
    34. 计数细胞, 并将它们按 1.25 x10 5 cellscm 2 的密度进行平板, 并在37°c 下孵育细胞, 使其具有5% 的co2。
    35. 每隔一天更换一次介质, 使用完整的 N2B27 + 200 ngml SHH。
      请注意:在这篇文章中, Npc 被认为是通过 (P) 0。SHH 可以从 P2 的 N2B27 介质中提取。
    36. 一旦细胞达到 80%-90% 的融合。
    37. 在这一阶段, 用免疫细胞化学和 qPCR 证实细胞表达了 Nestin 和 Ffa2 标记。该协议为 Nestin 和 Ffas2 标记生成了85% 的双阳性细胞。
    38. 对于传代细胞, 重复步骤2.2.31 –2.2.36。
    39. 冻结细胞, 从 P2 通道开始。对于细胞的冷冻, 重复步骤 2.2.31--2.2.36, 然后使用冷神经祖体冷冻培养基将细胞颗粒重新悬浮在 2 x 10 6 至 4 x10 6 细胞中 (见材料表)。
    40. 将细胞悬浮液的1毫升转移到每个冷冻室中, 并使用标准的慢速控制冷却系统冷冻细胞。长期储存时, 将细胞保持在液氮中。
  3. 解冻 MD Npc
    1. 准备一个 bmm 涂层板和温暖完整的 N2B27。在15毫升锥形管中加入10毫升的温热 DMMM/F12。在37°c 的热块中放置一个冷冻瓶2分钟。
      1. 将细胞从冷冻瓶转移到含有 dmemmcf12 的试管中。以 300 x g 离心 5分钟 。
      2. 吸吸上清液, 将细胞重新悬浮在 N2B27 的2毫升中, 并将细胞悬浮液添加到 bmm 涂层板的一口井中。用5% 的 CO2 在37°c 下培养细胞.

3. MD Npc 的转导和甲基化变化分析

  1. MD Npc 的传导
    1. 在 MOI = 2 的情况下, 用 Lv-grna准备9-Dnt3a 载体在70% 的融合中传递 MD Npc。替换 N2B27 中等16h 后传导。
    2. 在转导后48小时加入 N2B27, 加入 5μgml puromycin。将细胞培养到 N2B27 加 puromycin 中 3周, 以获得稳定的 MD 鼻咽癌线。细胞已准备好用于下游应用 (DNA、RNA、蛋白质分析、表型表征23、冷冻和传代)。
  2. SNCA 内压子1甲基化剖面的表征
    1. 使用 DNA 提取试剂盒从每个稳定转移的细胞系中提取 DNA (见材料表)。
    2. 使用800纳克的 DNA, 使用商业上可获得的试剂盒进行亚硫酸盐转换 (见材料表)。在亚硫酸盐转化后, 将亚硫酸盐转化后的 DNA 提取为20ngμl。
  3. 用于热释电测分析的 PCR
    1. 在无核酸管中制备 PCR 主混合物。对于每个反应, 使用0.4μl 的反向底漆 (10μm), 0.4μl 的前向引物 (10μm), 1.6μl 的 MgCl 2 (25mm), 2μl 的 10x CoralLoad 浓度, 10μl 的 2x PCR 主混料, 4μl 的 5x q-溶液, 1Μl 的 DNA和0.6μl 的无核酸水。
    2. 将反应板转移到热环机, 并使用以下条件进行 PCR: 95°c 15分钟, 50°c 94°C 循环 30秒, 56°c 30秒, 72°c 30秒, 最后10分钟延长步骤在72°c。表 1、图 7A和补充图 1列出了用于 snca 内包括1的焦磷酸测序的引物。
    3. 扩增后, 用2μl 的 PCR 产物和溴化乙酯染色, 然后进行琼脂糖凝胶电泳, 将放大器可视化。
    4. 焦测序检测是通过使用非甲基化 (U) 和甲基化 (M) 双硫转换 Dna 的混合物在以下比率中验证的, 即100U:0M、75U:25M、50U:50M、25U:75M 和 0U:100M (见材料表)。
    5. 使用焦磷酸测序试剂进行热测序 (见材料表), 并使用焦磷酸测序软件计算每个 cpg 站点的甲基化值。有关详细的焦磷酸测序协议, 请参阅 Bassil 等人。

结果

与天真的 GFP 对应因素相比, 验证 Lv-dcas9-dnt3a-gfp-puro 载体的生产滴度

我们进行了 p24口型elisa 比较了 Lv-dcash9-dnt3a-gfp-puro 的物理滴度与天真的 Gfp/puro 同行。图 5A中给出的代表性结果表明, 使用本文概述的协议生成的向量的物理产量是可比较的。这表明, 优化的矢量主干的效用, 加上优化?...

讨论

Lv 已开始成为表观基因组编辑的首选载体, 特别是在遗传疾病的情况下, 主要是因为它们能够 (i) 容纳大量 DNA 有效载荷和 (ii) 有效地传输广泛的分裂和非分裂细胞。Lv 的大包装功效尤其适用于涉及超大尺寸 Crispr/cas9 系统包装的应用。从这个角度来看, Lv 代表了交付一体机 CRISPR/Cas9 系统的首选平台。事实上, AAV 平台, 这是通常用于临床前和临床基因治疗应用, 并不完全能够容纳大尺寸的 dCas9 效应系?...

披露声明

杜克大学提交了与这项研究有关的临时专利申请。

致谢

这项工作的部分资金来自卡恩神经技术发展奖 (致 o. c.) 和国家健康研究所/国家神经疾病和中风研究所 (NIH/NDS) (r01 NS085011 至 o. c.)。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Optima XPN-80 UltracentrifugeBeckman CoulterA99839
0.22 μM filter unit, 1 LCorning430513
0.45-μm filter unit, 500 mLCorning430773
100 mm TC-Treated Culture DishCorning430167
15 mL conical centrifuge tubesCorning430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm GridCorning353025
50 mL conical centrifuge tubesCorning430291
6-well platesCorning3516
Aggrewell 800StemCell Technologies34811
Allegra 25R tabletop centrifugeBeckman Coulter369434
BD FACSBecton Dickinson338960
Conical bottom ultracentrifugation tubesSeton Scientific5067
Conical tube adaptersSeton ScientificPN 4230
Eppendorf Cell Imaging SlidesEppendorf30742060
High-binding 96-well platesCorning3366
Inverted fluorescence microscopeLeicaDM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
Reversible StrainerStemCell Technologies27215
SW32Ti rotorBeckman Coulter369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, NonpyrogenicVWR93000-694
VWR® Vacuum Filtration SystemsVWR89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate readerBio-Rad1681150
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cellsATCCCRL-3216
AccutaseStemCell Technologies7920
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemCell Technologies7010
Anti-FOXA2 AntibodyAbcamAb60721
Anti-Nestin AntibodyAbcamAb18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100xSigma AldrichA5955-100ML
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AThermo Fisher Scientific12587010
BESSigma AldrichB9879 - BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)Thermo Fisher Scientific15260037
CHIR99021StemCell Technologies72052
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning08-774-552
Cosmic Calf SerumHycloneSH30087.04
DMEM-F12Lonza12-719
DMEM, high glucose mediaGibco11965
DNeasy Blood & Tissue KitQiagen69504
EpiTect PCR Control DNA SetQiagen596945
EZ DNA Methylation KitZymo ResearchD5001
GelatinSigma AldrichG1800-100G
GentamicinThermo Fisher Scientific15750078
Gentle Cell Dissociation ReagentstemCell Technologies7174
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Human Recombinant bFGFStemCell Technologies78003
Human Recombinant EGFStemCell Technologies78006
Human Recombinant Shh (C24II)StemCell Technologies78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
mTeSR1StemCell Technologies85850
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502001
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA)HycloneSH30087.04
PyroMark PCR KitQiagen978703
RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific11875-085
SB431542StemCell Technologies72232
Sodium pyruvateSigma AldrichS8636-100ML
STEMdiff Neural Induction MediumStemCell Technologies5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing MediumStemCell Technologies5838
TaqMan Assay FOXA2Thermo Fisher ScientificHs00232764
TaqMan Assay GAPDHThermo Fisher ScientificHs99999905
TaqMan Assay NestinThermo Fisher ScientificHs04187831
TaqMan Assay OCT4Thermo Fisher ScientificHs04260367
TaqMan Assay PPIAThermo Fisher ScientificHs99999904
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300054
Y27632StemCell Technologies72302
NameCompanyCatalog NumberComments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibodyNIH AIDS Research and Reference Reagent Program3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgGSigma Aldrich12-348Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10 mLSigmaG9023Working concentration 1:1000
HIV-1 standardsNIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500 mLEquitech-BioSM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibodyNIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP451T
TMB peroxidase substrateKPL5120-0076Working concentration 1:10,000
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmids
pMD2.GAddgene12253
pRSV-RevAddgene52961
psPAX2Addgene12259
NameCompanyCatalog NumberComments
Restriction enzymes
BsmBINew England BiolabsR0580S
BsrGINew England BiolabsR0575S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
KpnINew England BiolabsR0142S
PacINew England BiolabsR0547S
SphINew England BiolabsR0182S

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