JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يستخدم التصوير البهوي البثري غير المقيد لقياس نمط التنفس في الفئران المستيقظة. نظهر أن 15 شريحة s في إطار بروتوكول موحد تعرض قيمًا مماثلة لفترة طويلة من التنفس الهادئ. تسمح هذه المنهجية أيضًا بالقياس الكمي لانقطاع النفس والأنفاس المعززة خلال الساعة الأولى في الغرفة.

Abstract

التصوير البهوي البُقيّمي غير المقيّد (UBP) هو طريقة لقياس نمط التنفس لدى الفئران، حيث يتم الإبلاغ بشكل روتيني عن تواتر التنفس وحجم المد والجزر والتهوية الدقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن جمع المعلومات المتعلقة بالناتج العصبي للتنفس، بما في ذلك وجود انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة. أحد الاعتبارات الهامة لUBP هو الحصول على شريحة التنفس مع الحد الأدنى من تأثير السلوكيات القلقة أو النشطة ، لتوضيح الاستجابة لتحديات التنفس. هنا، نقدم بروتوكول يسمح بالحصول على خطوط أساس قصيرة وهادئة في الفئران القديمة، مقارنة بالانتظار لنوبات أطول من التنفس الهادئ. استخدام شرائح زمنية أقصر أمر قيم ، حيث أن بعض سلالات الفئران قد تكون متحمسة أو قلقة بشكل متزايد ، وقد لا يتم تحقيق فترات أطول من التنفس الهادئ في غضون إطار زمني معقول. وضعنا فئرانعمرها 22 شهرًا في غرفة UBP وقارننا أربعة أجزاء تنفس هادئة من 15 ثانية بين دقائق 60-120 بفترة تنفس هادئة أطول مدتها 10 دقائق استغرقت 2-3 ساعات للحصول عليها. كما حصلنا على عدد من انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة قبل أجزاء التنفس الهادئة ، بعد فترة تعريف 30 دقيقة. نظهر أن 10 دقيقة من التنفس الهادئ مماثلة لاستخدام أقصر بكثير 15 سنة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الوقت المؤدي إلى هذه الأجزاء التنفس 15 s هادئة لجمع البيانات المتعلقة انقطاع النفس من المنشأ المركزي. يسمح هذا البروتوكول للمحققين بجمع بيانات نمط التنفس في فترة زمنية محددة ويجعل تدابير خط الأساس الهادئة ممكنة للفئران التي قد تظهر كميات متزايدة من السلوك المنفعل. توفر منهجية UBP نفسها طريقة مفيدة وغير باضعة لجمع بيانات نمط التنفس وتسمح باختبار الفئران عبر عدة نقاط زمنية.

Introduction

UBP هو تقنية شائعة لتقييم أنماط التنفس1،2،3،4. في هذه الطريقة ، يتم وضع الفئران في غرفة مغلقة حيث اختلافات الضغط بين الغرفة الرئيسية (حيث يتم إيواء الحيوان) وغرفة مرجعية يتم تصفيتها من خلال pneumotachograph للحصول على القيم. إعداد UBP الناتج غير جراحي وغير مقيد ويسمح بتقييم التدابير التنفسية دون الحاجة إلى التخدير أو الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية مناسبة للدراسات التي تتطلب قياسات متعددة في نفس الماوس مع مرور الوقت. يمكن قياس المتغيرات مثل تردد التنفس وحجم المد والجزر والتهوية الدقيقة باستخدام هذه الطريقة، أثناء تجربة واحدة أو عبر عدة تجارب. كما يوفر برنامج برمودا المتحد في الجسم كله مقاييس لذروة التدفقات ومدة الدورة التنفسية. معا، هذه المعلمات تحديد نمط التنفس. كما أن آثار التنفس المسجلة تجعل من الممكن استعراض البيانات وحساب عدد انقطاع النفس المركزي المعروض في غضون فترة زمنية معينة. يمكن استخدام هذا العد جنبا إلى جنب مع تحليل حجم المد والجزر وأوقات ملهمة لقياس التغيرات الأخرى في نمط التنفس.

في حين أن العديد من تقنيات التصوير بالجنب غير الغازية موجودة للتقييم المباشر للمعلمات الفسيولوجية الرئوية ، فإن UBP كامل الجسم يسمح بوسيلة لفحص وظيفة الجهاز التنفسي مع الحد الأدنى من الإجهاد غير المبرر للفأر. ويعتمد التصوير بالجنب، الذي يستخدم مقاييس تدفق المد والجزر المتوسطة المنهية وغير الباضعة أيضاً، على ضبط النفس، مثل العديد من الأنواع الأخرى من التصوير بالبليسيوم (على سبيل المثال، التصوير بالحجرة المزدوجة). في حين تم استخدام هذه الأساليب في نماذج القوارض لقياس استجابة مجرى الهواء5، فإن استخدام أطواق الرقبة أو أنابيب ضبط النفس الصغيرة قد يستغرق الفئران (مقابل الأنواع الأخرى) لفترة أطول للتأقلم مع التنفس وإعادته إلى مستويات الراحة.

يعد الحصول على الجزء الأمثل من تنفس الهواء اعتبارًا مهمًا للمقارنات الأساسية. زيادة استخدام نظم التصوير بالبليسيوم المتاحة تجاريا يجعل جمع بيانات نمط التنفس ممكن في العديد من المختبرات. الأهم من ذلك ، نمط التنفس متغير طوال فترة الجمع ، وخاصة بالنسبة للفئران. ومع ذلك، من الضروري توحيد التحليل الأساسي كوسيلة لضمان ألا يؤدي مستوى تدريب المجربين إلى إرباك النتائج. هناك العديد من الطرق لجمع جزء تنفس الهواء، بمثابة منطقة واحدة من الاختلاف بين التصاميم التجريبية. ومن الأمثلة على ذلك متوسط البيانات النهائية التي تتراوح بين 10 و30 دقيقة بعد مجموعة زمنية محددة مسبقًا داخل الغرفة1، في حين تتضمن طريقة أخرى الانتظار حتى يكون الماوس هادئًا بشكل واضح لمدة 5-10 دقيقة6. يمكن أن يستغرق هذا الأخير 2-3 ساعة لتحقيق وفي بعض الحالات ، قد تحتاج إلى التخلي عن المحاكمة إذا لم يكن الماوس هادئًا لفترة كافية. هذا القلق هو اعتبار مهم بشكل خاص لسلالات الفئران حيث السلوكيات الملاحظة هي أكثر قلقا ومثيرة7. قد تستغرق هذه الفئران وقتًا أطول للتكيف مع بيئة الغرفة وتظل هادئة فقط لرشقات نارية قصيرة من الوقت. يحد من الوقت المخصص لجمع خط الأساس يوحد وقت الغرفة لكل فأرة.

من الأهمية بمكان أن يحصل المجرّبون على خط أساس مناسب يشمل قيم سلوك الراحة في الماوس ولكن يحدث أيضًا في الوقت المناسب. وبالتالي ، فإن الهدف من هذا التقرير هو تقديم وصف للطرق المستخدمة للحصول على قيم خط الأساس الهادئة القصيرة لمعلمات التنفس في الفئران. وعلاوة على ذلك، فإننا نبلغ بأن انقطاع النفس والأنفاس المعززة يمكن قياسها كميا خلال الساعة الأولى في القاعة.

Protocol

وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية لكلية لو موين على جميع الإجراءات. وكان جميع استخدام الحيوانات بالاتفاق مع السياسات المبينة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية8.

ملاحظة: (حرجة) قبل التجريب، والحصول على جميع الموافقات اللازمة والتدريب اللازم ة للاستخدام الحيواني. من المهم أن يتم التعرف على التجارب مع سلوكيات الماوس ومستويات النشاط ، بما في ذلك علامات النوم والضيق و / أو حركة القطع الأثرية مقابل الشم العادي والتنفس.

1. كامل الجسم البارومتر ية غرفة التصوير البليسيوم

  1. قراءة أدلة المستخدم المناسبة لغرفة التصوير الجنبي البارومترية، بما في ذلك الموصلات، حلقات O، وما إلى ذلك، وإنشاء ملف بروتوكول قياسي لتحديد محللات (مثل الأيض) والمعلمات الخاصة بالبرنامج.
  2. تأكد من توصيل جميع الخراطيم والأنابيب بالغرفة. قم بتوصيل أنبوب تدفق الغاز (التدفق) وأنبوب فراغ (تدفق التدريجي) مباشرة إلى غرفة التصوير البُنى البارومتري.
    ملاحظة: يجب إرفاق التدفق الداخلي بتدفق التحيزالمميز لفتح.
  3. إرفاق CO2،O2،وN2 خزانات الغاز إلى خلاط الغاز. تأكد من أن جميع خزانات الغاز في وضع مفتوح قبل التجريب.

2- معايرة غرفة البريثيسموغراف البارومترية

  1. معايرة تدفق عالية ومنخفضة من الغاز عن طريق تحديد الإعداد 7700 مكبر للصوت تحت علامة التبويب الأجهزة من برنامج التصوير بالجنب ة البارومترية.
  2. تعيين فراغ (تدفق من الغرفة) مناسبة للتصميم التجريبي ومحللات الغاز (~ 0.1 لتر / دقيقة).
    ملاحظة: يجب أن يظل معدل التدفق إلى الخارج كما هو طوال المعايرة والتجربة للحصول على تسجيلات استقلابية دقيقة.
  3. تعيين تدفق منخفض من الهواء عن طريق إزالة أنبوب تدفق من الغرفة وإيقاف الفراغ.
  4. تسجيل التدفق صفر بإدخال 0 في خلية وحدة منخفضة للغرفة المقابلة. انقر نقرا مزدوجا على خلية كال منخفضة، وتغيير الوقت إلى 3 s، وضرب قياس.
  5. إعادة ربط أنبوب تدفق والسماح للغاز (20.93٪ O2، متوازنة N2)لتدفق من خلال غرفة الجنبية البارومترية من خلاط الغاز.
  6. تحويل التدفق من لتر / دقائق إلى ملليلتر / ثانية. انقر فوق خلية الوحدة العليا للغرفة المقابلة وأدخل القيمة بالملليلتر/الثانية. انقر نقرا مزدوجا عالية كال،وتغيير الوقت إلى 3 s، وانقر فوق قياس.
  7. اترك علامة التبويب إعداد 7700-Amplifier مفتوحة لمعايرة محللات التمثيل الغذائي إلى برنامج التصوير البُعد يُعد بمقياس الجنب.

3. معايرة محلل التمثيل الغذائي

  1. في برنامج خلاط الغاز، تعيين خلاط الغاز لإطلاق تدفق الغاز الذي يحتوي على 20.93٪ O2 و 79.07٪ N2.
  2. على محللات التمثيل الغذائي، تعيين مستوى معايرة O2 إلى 20.93٪ وCO2 لقراءة 0٪. أعد الاتصال الهاتفي إلى نموذج بمجرد إدخال القيم المناسبة.
  3. تعيين نسبة O2 عالية. انقر على علامة التبويب ABCD-4 من برنامج التصوير بالجنب ة البارومترية ثم أدخل 20.93 تحت الوحدة العالية لخط C2. تحت كال عالية،وتغيير الوقت إلى 3 s وضرب التدبير.
  4. تعيينالنسبة المئوية المنخفضة لثاني أكسيد الكربون. أدخل 0 تحت كال منخفض من خط C3، ثم قم بتغيير الوقت إلى 3 s وانقر فوق قياس تحت كال منخفض.
  5. في برنامج خلاط الغاز، قم بتغيير قيمة O2 إلى 10% وقيمة ثاني أكسيد الكربونإلى 5%. انتظر عدة دقائق حتى يتكيف تدفق الغاز مع هذه القيم. على محللات التمثيل الغذائي، بدوره مقابض التكيف لمعايرة CO2 يساوي 5٪. تأكد من إعادة تشغيل الطلب إلى العينة بمجرد معايرة القيم.
  6. تعيينالنسبة المئوية العالية لثاني أكسيد الكربون. تأكد من استقرار قراءات المحلل قبل إدراج القيم المناسبة في O2 و CO2 على برنامج التصوير بالجنبة البارومترية. انقر فوق الوحدة العالية تحت C3 وأدخل 5. تغيير كال عالية إلى 3 s وضرب التدبير.
  7. تعيين النسبة المئوية المنخفضة O2. انقر فوق وحدة منخفضة تحت الخيار C2 وأدخل 10. انقر فوق كال منخفض،إدخال 3 ق، وانقر فوق قياس.
  8. تغيير قيم الغاز على خلاط الغاز مرة أخرى إلى 20.93٪ O2 و 79.07٪ N2. انتظر عدة دقائق حتى تتكيف الغرفة مع هذه القيم. كرر الخطوات 3.1\u20123.7 إذا لم تقرأ محللات التمثيل الغذائي تلقائيًا 20.93٪ O2 و 0% CO2، لضمان المعايرة المناسبة. تأكيد المعايرة المناسبة بشكل روتيني مع خزانات الغاز المعتمدة.
  9. إعادة فحص متر التدفق المتصلة بغرفة التصوير البُطفيب البارومتري. ضبط تدفق الهواء من وإلى الغرفة إلى معدلات مناسبة للتجربة (عادة، 0.1-0.3 لتر / دقيقة).
  10. بمجرد تطبيق جميع الإعدادات على برنامج التصوير بالبُنى البُنى البارومتري، انقر فوق موافق لبدء التسجيل.

4- التصوير البُقيّم البُرّيّ غير المقيّد

  1. تسجيل وزن الماوس ودرجة حرارة الجسم الأولية. انتظر 10 دقيقة قبل وضع الماوس في الغرفة، لجمع بيانات O2 و CO2 من غرفة فارغة. العمل في منطقة هادئة مألوفة للفئران حتى الضوضاء والروائح لا تتداخل مع جمع البيانات. تجنب أي أعطال محتملة، بما في ذلك فتح وإغلاق الأبواب أو الموظفين الذين ينتقلون إلى غرفة جمع البيانات أو خارجها.
    ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول المحدد 22 شهرا من العمر ذكر C57BL/6J الماوس.
  2. خلال الساعة الأولى، قم بتوثيق سلوكيات الماوس وتدوين ملاحظات مفصلة، بما في ذلك قيم محددة للتدفق في/خارج الغرفة.
  3. بعد 60 دقيقة من اعتياد الغرفة، ومشاهدة لشرائح من التنفس الهادئ لل60 دقيقة التالية. قائمة أي شرائح. تستمر ما لا يقل عن 15 سنة في الطول دون شم والاستمالة. اتخاذ تدابير درجة حرارة الجسم كل 10 دقيقة عند استخدام جهاز قابل للزرع.
  4. في نهاية التجربة، قم بإزالة الماوس من الغرفة ووضعه مرة أخرى في قفصه. وينبغي تنظيف جميع المعدات ومسحها تماما. إذا بقيت قطرات الماء، فاستخدم الهواء المضغوط لإزالتها.

5. تحليل نمط التنفس والتمثيل الغذائي

  1. افتح ملف مراجعة البُثومتر البُنى وراجع الملاحظات المسجلة للرفقب الذي يهم.
  2. فتح لوحة التمثيل الغذائي في البرنامج واتخاذ متوسط أول 10 دقيقة من O2 و CO2، عندما كانت الغرفة فارغة. سجل هذه القيم كـ FiO2 و FiCO2.
  3. عرض لوحة التدفق لبرنامج التصوير البُنى البارومتري. انقر بزر الماوس الأيمن تحليل السمات وتعيين المعلمات المناسبة. تحت علامة التبويب ميتا 1، أدخل FiO2 و FiCO2 من الخطوة 5.2، فضلا عن تدفق إلى الغرفة تحت ميتا 2،لحساب VO2 و VCO2.
  4. لنمط من تحليل التنفس، تأكد من الأوقات لمدة 15 ثانية من التنفس الهادئ باستخدام ملاحظات حول سلوك الحيوان، فضلا عن تتبع لوحة التدفق. أدخل الأوقات لفترات 15 s من التنفس الهادئ تحت حوار محلل البيانات المفتوح من علامة التبويب محلل البيانات. انقر فوق وضع عرض بارزر لإظهار شرائح 15 s المحددة ذات الاهتمام فقط.
  5. انقر فوق حفظ البيانات المشتقة المنقّبة. افتح ملف البيانات في جدول بيانات للحصول على البيانات المنقّبة.

6. تحليل ابينياس والأنفاس المعززة

  1. في ملف المراجعة المفتوحة، إنهاء وضع عرض محلل. انتقل إلى خيار إعداد الرسم البياني ضمن الإعداد > إعداد P3 وحدد عرض الصفحة تحت النوع. حدد 5 لعدد الأجزاء. أدخل -2 في المربع المسمى منخفض و 2 في المربع المسمى عالية لتدابير التدفق في ملليلتر / الثانية. تطبيق التغييرات.
  2. انتقل إلى علامة 30 دقيقة على لوحة تتبع التدفق.
  3. عد انقطاع النفس والأنفاس المعززة لمدة 30-60 دقيقة بعد وضع الماوس في الغرفة. تحديد فترات التنفس المعلق ة التي تدوم لفترة أطول من أو تساوي 0.5 سنة، مما يدل على انقطاع النفس. ويشار إلى الأنفاس المعززة من خلال ارتفاع حاد في تتبع التنفس فوق 1.25 مل / سنة يليه انخفاض حاد أقل من -0.75 مل / سنة.

النتائج

تم الإبلاغ عن نتائج UBP كتقييم لنمط التنفس في 16 فأرًا يبلغ عمره ما يبلغ من العمر 22 شهرًا ويتم إجراؤها تحت غاز الهواء العادي (20.93٪ O2 مع N2متوازنًا). تضمن التحليل أولاً مقارنة شريحة التنفس الهادئ ة الأطول بـ 10 دقائق (والتي استغرق الحصول عليها أكثر من 2 ساعة) مقابل متوسط أربعة أجزاء قصي?...

Discussion

يوفر البروتوكول معلومات حول خط أساس التنفس الهادئ في الفئران ، بالإضافة إلى جمع البيانات حول انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة. تظهر النتائج التمثيلية أن خط الأساس الهادئ لمدة 10 دقيقة يحتوي على نمط مماثل من التنفس بالمقارنة مع متوسط أربع نوبات 15 s لفوج من الفئران القديمة. الأهم من ذلك?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفان أن يشكرا أنجيلا لو وسارة روبي وماريسا ميكي على عملهم في الحفاظ على مستعمرات الحيوانات. تم تمويل هذا العمل من قبل 1R15 HD076379 (L.R.D.) ، 3R15 HD076379 (L.R.D. لدعم CNR) ، وزمالة أبحاث ماكديفيت الجامعية في العلوم الطبيعية (BEE).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Carbon Dioxide AnalyzerAEI TechnologiesCD-3A 
Carbon Dioxide SensorAEI Technologies P-61B
Computermust be compliant with Ponemah requirements
Drierite beadsPermaPure LLCDM-AR
Flow ControlAEI TechnologiesR-1vacuum
FlowmeterTSI4100need one per chamber and one for vacuum
Gas MixerMCQ InstrumentsGB-103
Gas TanksHaun100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen AnalyzerAEI TechnologiesS-3A
Oxygen SensorAEI Technologies N-22M
Polyurethane TubingSMCTUS 0604 Y-20
Ponemah SoftwareDSI
Small Rodent ChamberBuxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)Destron-Fearingany type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber 
TransducersValidyneDP45need one per chamber 
Whole Body Plethysmography System Data Science International (DSI)Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. 

References

  1. DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
  2. Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
  3. Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
  4. van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
  5. Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
  6. Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , (2018).
  7. Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
  8. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , (2011).
  9. Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
  10. Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
  11. Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
  12. Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
  13. Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
  14. Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
  15. Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
  16. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
  17. Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
  18. Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158 Apnea VCO2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved