Methode, um Muster der Atmung in seneszierenden Mäusen durch hemmungslose Barometrische Plethysmographie zu erhalten

Zusammenfassung

Hemmungslose Barometrische Plethysmographie wird verwendet, um das Muster der Atmung bei wachen Mäusen zu quantifizieren. Wir zeigen, dass 15 s Segmente unter einem standardisierten Protokoll ähnliche Werte wie eine längere Dauer der leisen Atmung anzeigen. Diese Methode ermöglicht auch die Quantifizierung von Apnoe und Augmented Atem während der ersten Stunde in der Kammer.

Zusammenfassung

Die hemmungslose Barometrische Plethysmographie (UBP) ist eine Methode zur Quantifizierung des Atmungsmusters bei Mäusen, bei der Atemfrequenz, Gezeitenvolumen und Minutenbeatmung routinemäßig berichtet werden. Darüber hinaus können Informationen über die neuronale Leistung der Atmung gesammelt werden, einschließlich der Existenz von zentralen Apnoen und augmented Atem. Eine wichtige Überlegung für UBP ist es, ein Atmungssegment mit minimalen Auswirkungen von ängstlichen oder aktiven Verhaltensweisen zu erhalten, um die Reaktion auf Atemprobleme aufzuklären. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das kurze, leise Grundlinien bei gealterten Mäusen ermöglicht, vergleichbar mit dem Warten auf längere Anfälle von stiller Atmung. Die Verwendung kürzerer Zeitabschnitte ist wertvoll, da einige Mäusestämme zunehmend erregbar oder ängstlich sein können und längere Perioden der stillen Atmung nicht innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens erreicht werden können. Wir platzierten 22 Monate alte Mäuse in einer UBP-Kammer und verglichen vier 15 s ruhige Atmungssegmente zwischen den Minuten 60–120 mit einer längeren 10 min leisen Atmungsphase, die 2–3 h dauerte. Wir erhielten auch Zählungen von zentralen Apnoen und augmentierten Atemzügen vor den ruhigen Atmungssegmenten, nach einer 30 min Eingewöhnungszeit. Wir zeigen, dass 10 min leise Atmung mit einer viel kürzeren 15 s Dauer vergleichbar ist. Darüber hinaus kann die Zeit bis zu diesen 15 s ruhigen Atmungssegmenten verwendet werden, um Daten über Apnoen zentralen Ursprungs zu sammeln. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, Muster-Atmungsdaten in einer festgelegten Zeit zu sammeln und macht ruhige Basismaßnahmen für Mäuse möglich, die erhöhte Mengen an erregbarem Verhalten aufweisen können. Die UBP-Methodik selbst bietet eine nützliche und nichtinvasive Möglichkeit, Atmungsmusterdaten zu sammeln, und ermöglicht es Mäusen, über mehrere Zeiträume hinweg getestet zu werden.

Einleitung

UBP ist eine gängige Technik zur Beurteilung von Atemmustern^1,2,3,4. Bei dieser Methode werden Mäuse in einer geschlossenen Kammer platziert, in der Druckunterschiede zwischen der Hauptkammer (wo das Tier untergebracht ist) und einer Referenzkammer durch einen Pneumochographen gefiltert werden, um Werte zu erhalten. Die daraus resultierende UBP-Einrichtung ist nicht invasiv und hemmungslos und ermöglicht die Bewertung von Atemwegsmaßnahmen ohne Anästhesie oder Operation. Darüber hinaus eignet sich diese Technik für Studien, die im Laufe der Zeit mehrere Messungen in derselben Maus erfordern. Variablen wie Atemfrequenz, Gezeitenvolumen und Minutenbelüftung können mit dieser Methode, während einer einzigen Studie oder über mehrere Versuche quantifiziert werden. Ganzkörper-UBP bietet auch Messungen der Spitzenströme und der Atemzyklusdauer. Zusammen quantifizieren diese Parameter das Atmungsmuster. Die aufgezeichneten Atemspuren ermöglichen es auch, die Daten zu überprüfen und die Anzahl der zentralen Apnoen zu zählen, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums angezeigt werden. Diese Anzahl kann zusammen mit einer Analyse des Gezeitenvolumens und der inspiratorischen Zeiten verwendet werden, um andere Veränderungen im Atmungsmuster zu messen.

Während es mehrere nichtinvasive Plethysmographie-Techniken für die direkte Beurteilung der pulmonalen physiologischen Parameter gibt, ermöglicht ganzkörperliches UBP eine Möglichkeit, die Atemfunktion mit minimalem Unmut für die Maus abzuschirmen. Die Kopf-out-Plethysmographie, die Gezeitenmittelexipirationsfließmaßnahmen nutzt und auch nicht invasiv ist, beruht auf Zurückhaltung, wie viele andere Arten der Plethysmographie (z. B. Doppelkammerplethysmographie). Während diese Methoden in Nagetiermodellen verwendet wurden, um die Reaktionsfähigkeit der Atemwege zu messen⁵, kann die Verwendung von Halshalsbändern oder kleinen Rückhalterohren Mäusen (im Vergleich zu anderen Arten) länger zeitnehmen, um sich an ihre Atmung zu gewöhnen und ihre Atmung wieder auf Ruheniveau zu bringen.

Die Erlangung eines optimalen Luftatmungssegments ist eine wichtige Überlegung für Basisvergleiche. Der verstärkte Einsatz kommerziell erhältlicher Plethysmographiesysteme ermöglicht das Sammeln von Atmungsmusterdaten in vielen Laboratorien. Wichtig ist, dass das Atmungsmuster während des gesamten Sammelzeitraums variabel ist, insbesondere für Mäuse. Dabei ist es notwendig, die Basisanalyse zu standardisieren, um sicherzustellen, dass das Ausbildungsniveau der Experimentatoren die Ergebnisse nicht verwirrt. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, ein luftatmendes Segment zu sammeln, das als ein Bereich der Variation zwischen experimentellen Designs dient. Ein Beispiel ist die Mittelung der letzten 10–30 min Daten nach einem zuvor definierten Satz von Zeit innerhalb der Kammer¹, während eine andere Methode beinhaltet zu warten, bis die Maus für 5–10 min⁶sichtbar ruhig ist. Letzteres kann 2-3 h dauern, um zu erreichen, und in einigen Fällen muss eine Prüfung möglicherweise abgebrochen werden, wenn die Maus nicht lange genug ruhig ist. Diese Sorge ist eine besonders wichtige Überlegung für Stämme von Mäusen, wo beobachtete Verhaltensweisen ängstlicher und erregbarer sind⁷. Diese Mäuse können länger brauchen, um sich an die Kammerumgebung anzupassen und nur für kurze Zeitausbrüche ruhig zu bleiben. Durch die Begrenzung der Zeit für die Baseline-Sammlung wird die Kammerzeit für jede Maus standardisiert.

Es ist entscheidend, dass Die Experimentatoren eine geeignete Ausgangsbasis erhalten, die Ruheverhaltenswerte in der Maus umfasst, aber auch zeitnah auftritt. Daher besteht das Ziel dieses Berichts darin, eine Beschreibung der Methoden zu liefern, die verwendet werden, um kurze stille Ausgangswerte für Atemparameter bei Mäusen zu erhalten. Darüber hinaus berichten wir, dass Apnoen und augmentierte Atemzüge während der ersten Stunde in der Kammer quantifiziert werden können.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Jede Verwendung von Tieren stimmte mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschriebenen Richtlinien^{überein 8}.

HINWEIS: (Kritisch) Vor dem Experimentieren alle erforderlichen Genehmigungen und Schulungen für den Einsatz von Tieren einholen. Es ist wichtig, dass die Experimentatoren mit dem Verhalten und den Aktivitätsstufen der Maus vertraut gemacht werden, einschließlich Anzeichen von Schlaf, Not und/oder Bewegungsartefakt im Vergleich zu normalem Schnüffeln und Atmen.

1. Ganzkörper-Kammer der Barometrischen Plethysmographie

1. Lesen Sie die entsprechenden Bedienungsanleitungen für die barometrische Plethysmographiekammer, einschließlich Steckverbinder, O-Ringe usw., und erstellen Sie eine Standardprotokolldatei, um Analysatoren (z. B. metabolische) und softwarespezifische Parameter zu definieren.
2. Stellen Sie sicher, dass alle Schläuche und Rohre mit der Kammer verbunden sind. Verbinden Sie ein Gasdurchflussrohr (Flow-In) und ein Vakuumrohr (Flow-Out) direkt mit der barometrischen Plethysmographiekammer.
   HINWEIS: Der Zufluss muss an den öffnungsmarkierten Bias-Flowangehängt werden.
3. Befestigen Sie die Gastanks CO₂, O₂und N₂ an den Gasmischer. Stellen Sie sicher, dass sich alle Gastanks vor dem Experimentieren in der offenen Position befinden.

2. Kalibrierung der Barometrischen Plethysmographenkammer

1. Kalibrieren Sie einen hohen und einen niedrigen Gasstrom, indem Sie das 7700-Verstärker-Setup unter der Registerkarte Hardware der barometrischen Plethysmographie-Software auswählen.
2. Stellen Sie ein Vakuum (Ausfluss aus der Kammer) auf, das für die experimentelle Konstruktion und die Gasanalysatoren geeignet ist (0,1 L/min).
   HINWEIS: Die Abflussrate muss während der Kalibrierungen gleich bleiben und auf genaue metabolische Aufnahmen experimentieren.
3. Stellen Sie einen niedrigen Luftstrom ein, indem Sie das Durchflussrohr aus der Kammer entfernen und das Vakuum ausschalten.
4. Zeichnen Sie den Nullstrom auf, indem Sie eine 0 in die Zelle "Niedrige Einheit" für die entsprechende Kammer eingeben. Doppelklicken Sie auf die Zelle Low Cal, ändern Sie die Zeit auf 3 s, und klicken Sie auf Messen.
5. Schließen Sie das Durchflussrohr wieder an und lassen Sie Gas (20,93%_O2, symmetrisch N₂) durch die barometrische Plethysmographiekammer aus dem Gasmischer fließen.
6. Konvertieren Sie den Zufluss von Litern/Minuten in Milliliter/Sekunde. Klicken Sie auf die Zelle "Hohe Einheit" für die entsprechende Kammer, und geben Sie den Wert in Milliliter/Sekunde ein. Doppelklicken Sie auf High Cal, ändern Sie die Zeit auf 3 s, und klicken Sie auf Messen.
7. Lassen Sie die Registerkarte 7700-Amplifier Setup geöffnet, um die metabolischen Analysatoren auf die barometrische Plethysmographie-Software zu kalibrieren.

3. Metabolische Analyzer-Kalibrierung

1. Stellen Sie im Gasmischerprogramm den Gasmischer so ein, dass er einen Gasstrom mit 20,93 %_O2 und 79,07 % N₂freisetzt.
2. Setzen Sie bei den metabolischen Analysatoren den_{O2-Kalibrierwert} auf 20,93 % und den CO₂ auf 0 %. Drehen Sie das Zifferblatt zurück in Sample, sobald die entsprechenden Werte eingegeben wurden.
3. Legen Sie den hohen O_{2-Prozentsatz} fest. Klicken Sie auf die ABCD-4-Registerkarte der barometrischen Plethysmographie-Software und geben Sie dann 20.93 unter High Unit der C2-Linie ein. Ändern Sie unter High Caldie Zeit auf 3 s und drücken Sie Measure.
4. Stellen Sie den niedrigen CO_{2-Prozentsatz} ein. Geben Sie 0 unter Low Cal der C3-Linie ein, und ändern Sie dann die Zeit auf 3 s, und klicken Sie unter Low Calauf Messen .
5. Ändern Sie im Gasmischerprogramm den_O2-Wert auf 10 % und den_CO2-Wert auf 5 %. Warten Sie einige Minuten, bis sich der Gasstrom an diese Werte anpasst. Drehen Sie bei den metabolischen Analysatoren die Einstellknöpfe, um CO₂ gleich 5 % zu kalibrieren. Stellen Sie sicher, dass Sie das Zifferblatt nach der Kalibrierung der Werte wieder auf Beispiel zurückdrehen.
6. Stellen Sie den hohen CO_{2-Prozentsatz} ein. Stellen Sie sicher, dass die Messwerte des Analysators stabil sind, bevor Sie entsprechende Werte in die_O2- und_CO2-Werte der Barometrischen Plethysmographie-Software einfügen. Klicken Sie auf Hohe Einheit unter C3 und geben Sie 5ein. Ändern Sie High Cal auf 3 s und drücken Sie Measure.
7. Legen Sie den niedrigen O_{2-Prozentsatz} fest. Klicken Sie unter der Option C2 auf "Niedrige Einheit" und geben Sie 10ein. Klicken Sie auf Low Cal, geben Sie 3 s ein, und klicken Sie auf Messen.
8. Ändern Sie die Gaswerte am Gasmischer wieder auf 20,93% O₂ und 79,07% N₂. Warten Sie einige Minuten, bis sich die Kammer an diese Werte anpasst. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-u20123.7, wenn die metabolischen Analysatoren nicht automatisch 20,93 % O₂ und 0 % CO₂lesen, um eine ordnungsgemäße Kalibrierung zu gewährleisten. Bestätigen Sie routinemäßig die ordnungsgemäße Kalibrierung mit zertifizierten Gastanks.
9. Überprüfen Sie die Mitflussmesser, die mit der barometrischen Plethysmographiekammer verbunden sind. Stellen Sie den Luftstrom in und aus der Kammer auf die für das Experiment geeigneten Raten ein (in der Regel 0,1–0,3 L/min).
10. Sobald alle Einstellungen auf die barometrische Plethysmographie-Software angewendet wurden, klicken Sie auf OK, um mit der Aufnahme zu beginnen.

4. Hemmungslose Barometrische Plethysmographie

1. Zeichnen Sie das Gewicht der Maus und die anfängliche Körpertemperatur auf. Warten Sie 10 min, bevor Sie die Maus in die Kammer legen, um O_2- und_CO2-Daten aus einer leeren Kammer zu sammeln. Arbeiten Sie in einem ruhigen Bereich, der den Mäusen vertraut ist, so dass Lärm und Gerüche die Datenerfassung nicht stören. Vermeiden Sie mögliche Störungen, einschließlich des Öffnens und Schließens von Türen oder des Ein- oder Auszugs von Personal aus dem Datenerfassungsraum.
   HINWEIS: Dieses spezifische Protokoll beschäftigte 22 Monate alte männliche C57BL/6J Maus.
2. Dokumentieren Sie in der ersten Stunde das Verhalten der Maus und machen Sie detaillierte Notizen, einschließlich spezifischer Werte des Ein-/Ausflusses aus der Kammer.
3. Nach 60 min Kammerbehausung, achten Sie auf Segmente der ruhigen Atmung für die folgenden 60 min. Listen Sie alle Segmente mit einer Länge von mindestens 15 s ohne Schnüffeln und Pflegenauf. Nehmen Sie Körpertemperaturmessungen alle 10 min, wenn Sie ein implantierbares Gerät verwenden.
4. Entfernen Sie am Ende des Experiments die Maus aus der Kammer und legen Sie sie wieder in ihren Käfig. Alle Geräte sollten gründlich gereinigt und abgewischt werden. Wenn Wassertröpfchen übrig bleiben, verwenden Sie Druckluft, um sie zu entfernen.

5. Analyse des Musters der Atmung und des Stoffwechsels

1. Öffnen Sie die Barometrische Plethysmographie-Überprüfungsdatei und konsultieren Sie die aufgezeichneten Notizen für das Tier von Interesse.
2. Öffnen Sie das Metabolic Panel in der Software und nehmen Sie den Durchschnitt der ersten 10 min von O₂ und CO₂, wenn die Kammer leer war. Zeichnen Sie diese Werte als FiO₂ und FiCO₂auf.
3. Sehen Sie sich das Flow-Bedienfeld der barometrischen Plethysmographie-Software an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Attribute analysieren, und legen Sie die entsprechenden Parameter fest. Geben Sie unter der Registerkarte Meta 1 die FiO₂ und FiCO₂ ab Schritt 5.2 sowie den Durchfluss in die Kammer unter Meta 2ein, um VO₂ und VCO₂zu berechnen.
4. Für Muster der Atemanalyse, bestätigen Sie die Zeiten für die 15 Sekunden der stillen Atmung mit Notizen über das Verhalten des Tieres sowie die Ablauftafel Tracing. Geben Sie die Zeiten für die 15 s Intervalle der leisen Atmung unter Open Data Parser Dialogue auf der Registerkarte Data Parser ein. Klicken Sie auf Parser-Ansichtsmodus, um nur die spezifischen 15 s Segmente anzuzeigen, die von Interesse sind.
5. Klicken Sie auf Analysierte abgeleitete Daten speichern. Öffnen Sie die Datendatei in einer Kalkulationstabelle, um die bindierten Daten zu erhalten.

6. Analyse von Apnoe und Augmented Breaths

1. Beenden Sie in der Datei "Offene Überprüfung" den Analyseansichtsmodus. Gehen Sie unter Setup > P3-Setup in die Option Graph-Setup und wählen Sie Seitenansicht unter Typaus. Wählen Sie 5 für die Anzahl der Bereiche aus. Geben Sie -2 in die Box mit der Bezeichnung Niedrig und 2 in die Box mit der Bezeichnung Hoch für Durchflussmaße in Milliliter/Sekunde ein. Wenden Sie die Änderungen an.
2. Scrollen Sie zur 30-min-Markierung im Bedienfeld "Flow-Tracings".
3. Zählen Sie Apnoen und erhöhte Atemzüge für die 30-60 min, nachdem die Maus in die Kammer gelegt wurde. Quantifizieren Sie Perioden der suspendierten Atmung, die länger als oder gleich 0,5 s dauert, was auf eine Apnoe hindeutet. Erweiterte Atemzüge werden durch einen starken Anstieg der Atemspur über 1,25 ml/s gefolgt von einem starken Rückgang unter -0,75 ml/s angezeigt.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse von UBP als Bewertung des Atmungsmusters bei 16 (22 Monate alten) Mäusen, die unter normalem Luftgas (20,93%_O2 mit ausgeglichenem N₂) durchgeführt wurden, werden berichtet. Die Analyse beinhaltete zunächst einen Vergleich eines längeren 10 min leisen Atmungssegments (das über 2 h benötigte) mit dem Durchschnitt von vier kurzen 15 s Segmenten (quantifiziert innerhalb von Minuten 60–120). Eine repräsentative Strömungsverfolgung der stillen Atmung, bei der die Atmung ohne aktiv...

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Diskussion

Das Protokoll liefert Informationen über eine stille Atmungsbasislinie bei Mäusen sowie das Sammeln von Daten über zentrale Apnoen und erweiterte Atemzüge. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass eine 10 min ruhige Grundlinie ein ähnliches Atmungsmuster aufweist, verglichen mit durchschnittlich vier 15 s Anfällen für eine Kohorte alter Mäuse. Wichtig ist, dass die 15-S-Kämpfe statistisch nicht unterschiedlich sind, noch haben diese Gruppen Unterschiede in der Variation voneinander mit Levenes Test. Diese Da...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon Dioxide Analyzer	AEI Technologies	CD-3A
Carbon Dioxide Sensor	AEI Technologies	P-61B
Computer			must be compliant with Ponemah requirements
Drierite beads	PermaPure LLC	DM-AR
Flow Control	AEI Technologies	R-1	vacuum
Flowmeter	TSI	4100	need one per chamber and one for vacuum
Gas Mixer	MCQ Instruments	GB-103
Gas Tanks	Haun		100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen Analyzer	AEI Technologies	S-3A
Oxygen Sensor	AEI Technologies	N-22M
Polyurethane Tubing	SMC	TUS 0604 Y-20
Ponemah Software	DSI
Small Rodent Chamber	Buxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)	Destron-Fearing		any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber
Transducers	Validyne	DP45	need one per chamber
Whole Body Plethysmography System	Data Science International (DSI)		Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc.