Méthode pour obtenir le modèle de la respiration dans les souris sénescentes par la pléthysmographie barométrique non retenue

Résumé

La pléthysmographie barométrique non retenue est utilisée pour quantifier le modèle de respiration chez les souris éveillées. Nous montrons que les segments de 15 s sous un protocole standardisé affichent des valeurs similaires à une durée prolongée de respiration silencieuse. Cette méthodologie permet également la quantification de l’apnée et des respirations augmentées pendant la première heure dans la chambre.

Résumé

La pléthysmographie barométrique non retenue (UBP) est une méthode pour quantifier le modèle de respiration chez les souris, où la fréquence respiratoire, le volume de marée et la ventilation minute sont régulièrement rapportés. En outre, des informations peuvent être recueillies concernant la sortie neuronale de la respiration, y compris l’existence d’apnées centrales et de respirations augmentées. Une considération importante pour l’UBP est d’obtenir un segment de respiration avec un impact minimal des comportements anxieux ou actifs, pour élucider la réponse aux défis respiratoires. Ici, nous présentons un protocole qui permet d’obtenir des lignes de base courtes et silencieuses chez des souris âgées, comparables à l’attente de plus longues crises de respiration tranquille. L’utilisation de segments de temps plus courts est précieuse, car certaines souches de souris peuvent être de plus en plus excitables ou anxieuses, et de plus longues périodes de respiration tranquille peuvent ne pas être réalisées dans un délai raisonnable. Nous avons placé des souris de 22 mois dans une chambre de l’UBP et comparé quatre segments respiratoires silencieux de 15 s entre les minutes 60-120 à une période de respiration plus longue de 10 min calme qui a pris 2-3 h à acquérir. Nous avons également obtenu des dénombrements d’apnées centrales et de respirations augmentées avant les segments respiratoires silencieux, après une période de familiarisation de 30 min. Nous montrons que 10 min de respiration tranquille est comparable à l’utilisation d’une durée beaucoup plus courte de 15 s. En outre, le temps qui précède ces segments de respiration tranquille de 15 s peut être utilisé pour recueillir des données concernant les apnées d’origine centrale. Ce protocole permet aux chercheurs de recueillir des données sur le modèle de respiration dans un laps de temps défini et rend possible des mesures de base silencieuses pour les souris qui peuvent présenter des quantités accrues de comportement excitable. La méthodologie UBP elle-même fournit un moyen utile et non invasif de recueillir des données sur les modèles de respiration et permet aux souris d’être testées sur plusieurs moments.

Introduction

UBP est une technique courante pour l’évaluation des modèles respiratoires^1,2,3,4. Dans cette méthode, les souris sont placées dans une chambre fermée où les différences de pression entre la chambre principale (où l’animal est logé) et une chambre de référence sont filtrées à travers un pneumtachographe pour obtenir des valeurs. La configuration UBP qui en résulte est non invasive et non retenue et permet d’évaluer les mesures respiratoires sans l’exigence d’anesthésie ou de chirurgie. En outre, cette technique est adaptée aux études nécessitant plusieurs mesures dans la même souris au fil du temps. Des variables telles que la fréquence respiratoire, le volume des marées et la ventilation minute peuvent être quantifiées avec cette méthode, au cours d’un seul essai ou sur plusieurs essais. L’UBP du corps entier fournit également des mesures des débits de pointe et de la durée du cycle respiratoire. Ensemble, ces paramètres quantifient le modèle de respiration. Les traces respiratoires enregistrées permettent également d’examiner les données et de compter le nombre d’apnées centrales affichées dans un délai donné. Ce comptage peut être utilisé à côté d’une analyse du volume des marées et des temps inspiratoires pour évaluer d’autres altérations dans le modèle de respiration.

Tandis que plusieurs techniques non invasives de pléthysmographie existent pour l’évaluation directe des paramètres physiologiques pulmonaires, UBP de corps entier permet un moyen de dépister la fonction respiratoire avec un minimum de stress indu à la souris. La pléthysmographie de tête-out, qui utilise des mesures de débit mi-expiratoire des marées et qui est également non invasive, repose sur la retenue, comme beaucoup d’autres types de pléthysmographie (p. ex., pléthysmographie à double chambre). Bien que ces méthodes aient été utilisées dans les modèles de rongeurs pour mesurer la réactivité des voies respiratoires^5,l’utilisation de colliers de cou ou de petits tubes de retenue peut prendre des souris (contre d’autres espèces) plus longtemps pour s’acclimater et retourner leur respiration aux niveaux de repos.

L’obtention d’un segment optimal de respiration de l’air est une considération importante pour les comparaisons de base. L’utilisation accrue de systèmes de pléthysmographie disponibles dans le commerce permet de recueillir des données sur les modèles de respiration dans de nombreux laboratoires. Il est important de noter que le modèle de respiration est variable tout au long de la période de collecte, en particulier pour les souris. Cela dit, il est nécessaire de normaliser l’analyse de base comme un moyen de s’assurer que le niveau de formation des expérimentateurs ne confond pas les résultats. Il existe de nombreuses façons de recueillir un segment de respiration de l’air, servant comme un domaine de variation entre les conceptions expérimentales. Un exemple comprend la moyenne des 10-30 minutes finales de données suivant un ensemble de temps précédemment défini dans la chambre¹, tandis qu’une autre méthode consiste à attendre jusqu’à ce que la souris est visiblement calme pendant 5-10 min⁶. Ce dernier peut prendre 2-3 h pour atteindre et dans certains cas, un essai peut avoir besoin d’être abandonné si la souris n’est pas calme assez longtemps. Cette préoccupation est une considération particulièrement importante pour les souches de souris où les comportements observés sont plus anxieux et excitables⁷. Ces souris peuvent prendre plus de temps à s’adapter à l’environnement de la chambre et ne restent calmes que pour de courtes rafales de temps. Limiter le temps consacré à la collecte de base normalise le temps de chambre pour chaque souris.

Il est crucial que les expérimentateurs obtiennent une ligne de base appropriée qui englobe les valeurs de comportement au repos dans la souris, mais se produit également en temps opportun. Par conséquent, le but de ce rapport est de fournir une description des méthodes utilisées pour obtenir de courtes valeurs de base silencieuses pour les paramètres respiratoires chez les souris. De plus, nous rapportons que les apnées et les respirations augmentées peuvent être quantifiées pendant la première heure dans la chambre.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels du Collège Le Moyne. Toute utilisation des animaux était en accord avec les politiques décrites dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire⁸.

REMARQUE : (Critique) Avant l’expérimentation, obtenir toutes les approbations et la formation nécessaires à l’utilisation des animaux. Il est important que les expérimentateurs soient familiarisés avec les comportements de la souris et les niveaux d’activité, y compris les signes de sommeil, de détresse et/ou d’artefact de mouvement par rapport à l’inhalation et à la respiration normales.

1. Chambre barométrique de pléthysmographie du corps entier

1. Lisez les manuels d’utilisation appropriés pour la chambre de pléthysmographie barométrique, y compris les connecteurs, les anneaux O, etc., et créez un fichier de protocole standard pour définir les analyseurs (p. ex., métaboliques) et les paramètres spécifiques au logiciel.
2. Assurez-vous que tous les tuyaux et tubes sont connectés à la chambre. Connectez un tube de débit de gaz (flow-in) et un tube à vide (écoulement) directement à la chambre barométrique de pléthysmographie.
   REMARQUE: L’afflux doit être attaché au flux de biaismarqué d’ouverture.
3. Attachez le CO₂, les réservoirs de gaz O₂et N₂ au mélangeur à gaz. Assurez-vous que tous les réservoirs de gaz sont en position ouverte avant l’expérimentation.

2. Étalonnage de la Chambre barométrique du pléthysmographe

1. Calibrer un débit élevé et faible de gaz en sélectionnant la configuration 7700-Amplificateur sous l’onglet Matériel du logiciel de pléthysmographie barométrique.
2. Définissez un vide (flux hors de la chambre) approprié pour la conception expérimentale et les analyseurs de gaz (0,1 L/min).
   REMARQUE: Le taux d’écoulement doit rester le même tout au long des étalonnages et expérimenter pour des enregistrements métaboliques précis.
3. Réglez un faible flux d’air en enlevant le tube d’écoulement de la chambre et en éteignant le vide.
4. Enregistrez le flux zéro en entrant un 0 dans la cellule Low Unit pour la chambre correspondante. Double-cliquez sur la cellule Low Cal, changer l’heure à 3 s, et frapper Measure.
5. Réattachez le tube d’écoulement et laissez le gaz (20,93% O₂, équilibré N₂) de circuler à travers la chambre barométrique de pléthysmographie du mélangeur à gaz.
6. Convertir l’afflux de litres/minutes en millilitres/seconde. Cliquez sur la cellule High Unit pour la chambre correspondante et entrez la valeur en millilitres/seconde. Double-clic High Cal, changer l’heure à 3 s, et cliquez sur Mesure.
7. Laissez l’onglet 7700-Amplifier Setup ouvert pour calibrer les analyseurs métaboliques au logiciel barométrique de pléthysmographie.

3. Étalonnage d’analyseur métabolique

1. Dans le programme de mélangeur à gaz, réglez le mélangeur à gaz pour libérer un flux de gaz contenant 20,93% O₂ et 79,07% N₂.
2. Sur les analyseurs métaboliques, définissez le niveau d’étalonnage O₂ à 20,93% et le CO₂ à lire 0%. Retournez le cadran à l’échantillon une fois que les valeurs appropriées sont saisies.
3. Réglez le pourcentage élevé D_2. Cliquez sur l’onglet ABCD-4 du logiciel barométrique de pléthysmographie, puis entrez 20,93 sous Haute Unité de la ligne C2. Sous High Cal, changer l’heure à 3 s et hit Measure.
4. Réglez le faible pourcentage de CO_2. Entrez 0 sous Low Cal de la ligne C3, puis changez l’heure à 3 s et cliquez sur Mesure sous Low Cal.
5. Dans le programme de mélangeur à gaz, changez la valeur O₂ à 10 % et la valeur du CO₂ à 5 %. Attendez plusieurs minutes que le débit de gaz s’adapte à ces valeurs. Sur les analyseurs métaboliques, tourner les boutons d’ajustement pour calibrer le CO₂ égal à 5%. Assurez-vous de retourner le cadran à l’échantillon une fois que les valeurs sont calibrées.
6. Réglez le pourcentage élevé de CO_2. Assurez-vous que les lectures d’analyseur sont stables avant d’insérer des valeurs appropriées dans le logiciel de pléthysmographie O₂ et CO₂ sur le logiciel de pléthysmographie barométrique. Cliquez sur High Unit sous C3 et entrez 5. Changez High Cal à 3 s et a frappé Measure.
7. Réglez le faible pourcentage D_2. Cliquez sur Low Unit sous l’option C2 et entrez 10. Cliquez sur Low Cal, entrée 3 s, et cliquez sur Mesure.
8. Changez les valeurs gazeuses sur le mélangeur à gaz à 20,93% O₂ et 79,07% N₂. Attendez que la chambre s’adapte à ces valeurs pendant plusieurs minutes. Répétez les étapes 3.1-u20123.7 si les analyseurs métaboliques ne lisent pas automatiquement 20,93% O₂ et 0% DE CO₂, pour assurer un calibrage approprié. Confirmez régulièrement l’étalonnage approprié avec des réservoirs de gaz certifiés.
9. Revérifier les compteurs de débit reliés à la chambre barométrique de pléthysmographie. Ajuster le débit d’air dans et hors de la chambre pour les taux appropriés à l’expérience (généralement, 0,1 à 0,3 L/min).
10. Une fois que tous les paramètres ont été appliqués au logiciel de pléthysmographie barométrique, cliquez sur OK pour commencer l’enregistrement.

4. Pléthysmographie barométrique non retenue

1. Enregistrez le poids de la souris et la température corporelle initiale. Attendez 10 min avant de placer la souris dans la chambre, pour recueillir des données O₂ et CO₂ à partir d’une chambre vide. Travaillez dans un endroit calme familier aux souris afin que le bruit et les odeurs n’interfèrent pas avec la collecte de données. Évitez toute perturbation possible, y compris l’ouverture et la fermeture des portes ou le personnel qui entre ou sort de la salle de collecte de données.
   REMARQUE: Ce protocole spécifique a employé la souris mâle de 22 mois C57BL/6J.
2. Pendant la première heure, documentez les comportements de la souris et prenez des notes détaillées, y compris des valeurs spécifiques du flux à l’in/extérieur de la chambre.
3. Après 60 min d’accoutumation de chambre, surveillez les segments de la respiration tranquille pendant les 60 minutes suivantes. Énumérez tous les segments d’une longueur d’au moins 15 s sans renifler et setoiletter. Prenez des mesures de température corporelle toutes les 10 minutes lorsque vous utilisez un dispositif implantable.
4. À la fin de l’expérience, retirez la souris de la chambre et remettez-la dans sa cage. Tout l’équipement doit être nettoyé et nettoyé à fond. Si des gouttelettes d’eau subsistent, utilisez de l’air pressurisé pour les enlever.

5. Analyse du modèle de respiration et de métabolisme

1. Ouvrez le dossier barométrique d’examen de la pléthysmographie et consultez les notes enregistrées pour l’animal d’intérêt.
2. Ouvrez le panneau métabolique dans le logiciel et prenez la moyenne des 10 premières minutes de O₂ et CO₂, lorsque la chambre était vide. Enregistrez ces valeurs comme la FiO₂ et fiCO₂.
3. Voir le panneau Flow du logiciel barométrique de pléthysmographie. Cliquez à droite Analysez les attributs et définissez les paramètres appropriés. Sous l’onglet Meta 1, entrez le FiO₂ et fiCO₂ de l’étape 5.2, ainsi que le flux dans la chambre sous Meta 2, pour calculer VO₂ et VCO₂.
4. Pour le modèle d’analyse de respiration, confirmer les temps pour les 15 secondes de respiration tranquille en utilisant des notes sur le comportement animal aussi bien que le tracé du panneau de débit. Entrez les heures pour les intervalles de 15 s de respiration silencieuse sous Open Data Parser Dialogue à partir de l’onglet Data Parser. Cliquez sur le mode Parser View pour afficher uniquement les segments d intérêt spécifiques des 15 s.
5. Cliquez sur Enregistrer les données dérivées parsed. Ouvrez le fichier de données dans une feuille de calcul pour obtenir les données binned.

6. Analyse des apnées et des respirations augmentées

1. Dans le fichier d’examen ouvert, sortez le mode Parser View. Entrez dans l’option De configuration de graphique sous configuration 'gt; P3 Setup et sélectionnez Page View sous Type. Sélectionnez 5 pour le nombre de volets. Entrez -2 dans la boîte étiquetée Low et 2 dans la boîte étiquetée High pour les mesures de débit en millilitres/seconde. Appliquer les modifications.
2. Faites défiler jusqu’à la marque de 30 minutes sur le panneau de traçage du débit.
3. Comptez les apnées et les respirations augmentées pour les 30-60 minutes après que la souris a été placée dans la chambre. Quantifier les périodes de respiration en suspension d’une durée supérieure ou égale à 0,5 s, ce qui indique une apnée. Les respirations augmentées sont indiquées par une forte augmentation de la trace respiratoire au-dessus de 1,25 ml/s, suivie d’une forte diminution en dessous de -0,75 ml/s.

Résultats

Les résultats de l’UBP comme une évaluation du modèle de la respiration chez les souris âgées de 16 ans (22 mois) effectuées sous le gaz d’air normal (20,93% O₂ avec N₂équilibré ) sont rapportés. L’analyse comprenait d’abord une comparaison d’un segment de respiration silencieux plus long de 10 minutes (qui a pris plus de 2 h à obtenir) par rapport à la moyenne de quatre segments courts de 15 s (quantifiés en quelques minutes 60-120). Un tracé représentatif de la respiration ...

Discussion

Le protocole fournit des informations concernant une ligne de base de respiration silencieuse chez les souris, ainsi que la collecte de données sur les apnées centrales et les respirations augmentées. Les résultats représentatifs montrent qu’une ligne de base tranquille de 10 min a un modèle similaire de respiration par rapport à une moyenne de quatre 15 s combats pour une cohorte de vieilles souris. Fait important, les 15 s ne sont pas statistiquement différents, et ces groupes n’ont pas de différences de v...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon Dioxide Analyzer	AEI Technologies	CD-3A
Carbon Dioxide Sensor	AEI Technologies	P-61B
Computer			must be compliant with Ponemah requirements
Drierite beads	PermaPure LLC	DM-AR
Flow Control	AEI Technologies	R-1	vacuum
Flowmeter	TSI	4100	need one per chamber and one for vacuum
Gas Mixer	MCQ Instruments	GB-103
Gas Tanks	Haun		100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen Analyzer	AEI Technologies	S-3A
Oxygen Sensor	AEI Technologies	N-22M
Polyurethane Tubing	SMC	TUS 0604 Y-20
Ponemah Software	DSI
Small Rodent Chamber	Buxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)	Destron-Fearing		any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber
Transducers	Validyne	DP45	need one per chamber
Whole Body Plethysmography System	Data Science International (DSI)		Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc.