JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Unrestrained barometrik plethysmography uyanık farelerde solunum paterni ölçmek için kullanılır. Standart bir protokol altında 15 s segmentleri sessiz nefes uzun bir süre benzer değerleri görüntülemek olduğunu göstermektedir. Bu metodoloji aynı zamanda apne ve artırılmış nefeslerin haznedeki ilk saat boyunca ölçülmesine olanak sağlar.

Özet

Sınırsız barometrik pletirmografi (UBP), solunum sıklığı, gelgit hacmi ve dakika havalandırmasının rutin olarak raporlandığı farelerde solunum paternini ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. Ayrıca, merkezi apne ve artırılmış nefes varlığı da dahil olmak üzere, solunum nöral çıkışı ile ilgili bilgi toplanabilir. UBP için önemli bir husus endişeli veya aktif davranışların en az etkisi ile bir nefes segmenti elde etmektir, solunum zorluklarına yanıt açıklamak için. Burada, yaşlı farelerde kısa ve sessiz taban çizgilerinin elde edilmesine olanak tanıyan bir protokol sıyoruz, daha uzun nefes alma nöbetlerini beklemekle karşılaştırılabilir. Farelerin bazı suşları giderek daha heyecanlı veya endişeli olabilir ve sessiz nefes alma uzun süre makul bir zaman dilimi içinde elde olmayabilir gibi kısa zaman segmentleri kullanımı değerlidir. 22 aylık fareleri UBP odasına yerleştirdik ve dakikalar arasında 4 adet 15 s sessiz nefes alma segmentini 60-120 dakika arasında, elde etmek için 2-3 saat süren daha uzun 10 dk sessiz nefes alma periyoduna karşılaştırdık. Ayrıca 30 dk'lık bir alışma dönemini takiben, sessiz nefes segmentlerinden önce merkezi apne ve artırılmış nefes sayımları elde ettik. Biz 10 dakika sessiz nefes çok daha kısa 15 s süresi kullanarak karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu 15 s sessiz nefes segmentleri kadar önde gelen zaman merkezi kökenli apne ile ilgili veri toplamak için kullanılabilir. Bu protokol, araştırmacıların belirli bir süre içinde nefes alma deseni verilerini toplamasına olanak tanır ve fareler için daha fazla heyecan verici davranış sergileyebilecek sessiz temel önlemleri uygulanabilir kılar. UBP metodolojisi kendisi, nefes alma deseni verilerini toplamak için yararlı ve noninvaziv bir yol sağlar ve farelerin birkaç zaman noktasında test edilmesine olanak tanır.

Giriş

UBP solunum desenleri1,2,,3,4değerlendirilmesi için ortak bir tekniktir. Bu yöntemde fareler, ana hazne (hayvanın bulunduğu yer) ile referans odası arasındaki basınç farklarının değer elde etmek için pnömonikokografyoluyla filtrelendiği kapalı bir odaya yerleştirilir. Ortaya çıkan UBP kurulumu noninvaziv ve sınırsızdır ve anestezi veya ameliyat şartı olmadan solunum önlemlerinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, bu teknik zaman içinde aynı farede birden fazla ölçüm gerektiren çalışmalar için uygundur. Solunum frekansı, gelgit hacmi ve dakika havalandırması gibi değişkenler bu yöntemle, tek bir deneme sırasında veya birkaç denemede ölçülebilir. Tüm vücut UBP de pik akışları ve solunum döngüsü süresi önlemleri sağlar. Birlikte, bu parametreler solunum deseni ölçmek. Kaydedilen solunum izleri, verilerin gözden geçirilmesini ve belirli bir süre içinde görüntülenen merkezi apne lerin sayısını saymayı da mümkün kılar. Bu sayı, nefes alma paternindeki diğer değişiklikleri ölçmek için gelgit hacmi ve inspiratuar zamanların analizi ile birlikte kullanılabilir.

Pulmoner fizyolojik parametrelerin doğrudan değerlendirilmesi için çeşitli noninvaziv pletirmografi teknikleri mevcut olmakla birlikte, tüm vücut UBP fareye en az gereksiz stres ile solunum fonksiyonu için tarama için bir yol sağlar. Gelgit orta ekspiratuar akış ölçütlerini kullanan ve aynı zamanda noninvaziv olan baş-out pletismografi, diğer birçok plethysmografi türünde (örn. çift odalı pletismografi) olduğu gibi kısıtlamaya dayanır. Bu yöntemler hava yolu duyarlılığını ölçmek için kemirgen modellerinde kullanılmış olsa da5,boyun yakalarının veya küçük bağlama tüplerinin kullanımı farelerin (diğer türlere karşı) alışması ve solunumlarını dinlenme seviyelerine döndürmesi için daha uzun sürebilir.

Optimum bir hava soluyan segment elde etmek temel karşılaştırmalar için önemli bir husustur. Ticari olarak mevcut pletismografi sistemlerinin kullanımının artması, birçok laboratuvarda nefes alma deseni verilerinin toplanmasımümkün kılmaktadır. Daha da önemlisi, nefes alma deseni toplama dönemi boyunca, özellikle fareler için değişkendir. Bununla birlikte, deneycilerin eğitim düzeyinin sonuçları şaşırtmamasını sağlamak için temel analizi standartlaştırmak gerekir. Deneysel tasarımlar arasında bir varyasyon alanı olarak hizmet veren, bir hava soluma segmenti toplamak için çeşitli yollar vardır. Bir örnek, oda1içinde daha önce tanımlanmış bir zaman kümesini izleyerek son 10-30 dk veri ortalamaiçerir, başka bir yöntem fare 5-10 dk6için gözle görülür sakin olana kadar bekleme içerir. İkinci ulaşmak için 2-3 saat sürebilir ve bazı durumlarda, fare yeterince uzun süre sakin değilse bir deneme terk edilmesi gerekebilir. Bu endişe, gözlenen davranışların daha endişeli ve heyecan verici olduğu fare suşları için özellikle önemli bir husustur7. Bu farelerin oda ortamına uyum sağlaması daha uzun sürebilir ve sadece kısa bir süre için sakin kalırlar. Taban çizgisi koleksiyonuna ayrılan süreyi sınırlamak, her fareiçin oda süresini standartlaştırır.

Denemecilerin faredeki dinlenme davranış değerlerini kapsayan ancak aynı zamanda zamanında meydana gelen uygun bir taban çizgisi edinmeleri çok önemlidir. Bu nedenle, bu raporun amacı farelerde solunum parametreleri için kısa sessiz temel değerleri elde etmek için kullanılan yöntemlerin bir açıklamasını sağlamaktır. Ayrıca, apne ve artırılmış nefes odasında ilk saat içinde ölçülebilir rapor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm prosedürler Le Moyne College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanların tüm kullanımı, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklanan politikalarla uyum içindedir8.

NOT: (Kritik) Deneyden önce, hayvan kullanımı için gerekli tüm onayları ve eğitimi alın. Deneycilerin uyku, sıkıntı ve/veya hareket objesi ve normal koklama ve nefes alma işaretleri de dahil olmak üzere fare davranışları ve aktivite düzeylerine aşina olması önemlidir.

1. Tüm vücut Barometrik Pletilografi Odası

  1. Konektörler, O-halkalar, vb. dahil olmak üzere barometrik pletirmografi odası için uygun kullanım kılavuzlarını okuyun ve analizörleri (örn. metabolik) ve yazılıma özgü parametreleri tanımlamak için standart bir protokol dosyası oluşturun.
  2. Tüm hortumların ve tüplerin haznebağlı olduğundan emin olun. Bir gaz akış tüpü (akış-in) ve bir vakum tüpü (flow-out) doğrudan barometrik pletismografi odasına bağlayın.
    NOT: Giriş, açılış işaretli sapma akışınailiştirilmelidir.
  3. GAZ mikserine CO2, O2ve N2 gaz tanklarını takın. Denemeden önce tüm gaz tanklarının açık konumda olduğundan emin olun.

2. Barometrik Plethysmograph Odasının Kalibrasyonu

  1. Barometrik pletizmografi yazılımının Donanım sekmesi altında 7700-Amplifikatör Kurulumunu seçerek yüksek ve düşük bir gaz akışını kalibre edin.
  2. Deneysel tasarım ve gaz analizörleri (~0.1 L/dk) için uygun bir vakum (hazneden dışarı akış) ayarlayın.
    NOT: Doğru metabolik kayıtlar için kalibrasyonlar ve deney boyunca çıkış hızı aynı kalmalıdır.
  3. Akış tüpünü hazneden çıkararak ve vakumu kapatarak düşük bir hava akışı ayarlayın.
  4. İlgili oda için Düşük Birim hücresine 0 girerek sıfır akışını kaydedin. Düşük Cal hücresine çift tıklayın, zamanı 3'e değiştirin ve Ölçü'yetıklayın.
  5. Akış tüpünü yeniden takın ve gazın (%20,93 O2, dengeli N2) gaz karıştırıcısından barometrik pletirmografi odasından akmasına izin verin.
  6. Girişi litre/dakikadan mililitre/saniyeye dönüştürün. İlgili oda için Yüksek Birim hücresini tıklatın ve değeri mililitre/saniye cinsinden girin. Yüksek Cal'ıçift tıklatın, zamanı 3'e değiştirin ve Ölçü'yetıklayın.
  7. Metabolik analizörleri barometrik plethysmography yazılımına kalibre etmek için 7700-Amplifikatör Kurulumu sekmesini açık bırakın.

3. Metabolik Analizör Kalibrasyonu

  1. Gaz karıştırıcı programında, gaz karıştırıcısını %20,93 O2 ve %79,07 N2içeren bir gaz akışı sağlamak için ayarlayın.
  2. Metabolik analizörlerde, O2 kalibrasyon seviyesini %20,93'e, CO2'yi ise %0'a ayarlayın. Uygun değerler girilen aramayı Örnek'e geri çevirin.
  3. Yüksek O2 yüzdesini ayarlayın. Barometrik pletiksmografi yazılımının ABCD-4 sekmesine tıklayın ve ardından C2 hattının Yüksek Birimi'nin altına 20.93 girin. Yüksek Calaltında, 3 s zaman değiştirin ve Measureçarptı.
  4. Düşük CO2 yüzdesini ayarlayın. C3 satırının Düşük Cal'ının altına 0 girin ve sonra zamanı 3'e değiştirin ve Düşük Cal'ınaltındaki Ölçü'ye tıklayın.
  5. Gaz karıştırıcı programında, O2 değerini %10'a, CO2 değerini ise %5'e değiştirin. Gaz akışının bu değerlere uyum sağlaması için birkaç dakika bekleyin. Metabolik analizörlerde, CO2'yi %5'e eşit olarak kalibre etmek için ayarlama düğümlerini çevirin. Değerler kalibre edildikten sonra kadranı Örnek'e geri çevirdiğinden emin olun.
  6. Yüksek CO2 yüzdesini ayarlayın. Barometrik pletismografi yazılımına O2 ve CO2'ye uygun değerler eklemeden önce analizör okumalarının kararlı olduğundan emin olun. C3 altında Yüksek Birim tıklayın ve 5girin . Yüksek Cal'ı 3 s'e değiştirin ve Measuretuşuna basın.
  7. Düşük O2 yüzdesini ayarlayın. C2 seçeneğinin altındaki Düşük Birim'i tıklatın ve 10girin. Düşük Cal'ıtıklatın, 3 s'yi girdive Ölçü'yetıklayın.
  8. Gaz karıştırıcıüzerindeki gaz değerlerini %20,93 O2 ve %79,07 N2'yedeğiştirin. Odanın bu değerlere uyum sağlaması için birkaç dakika bekleyin. Metabolik analizörler otomatik olarak% 20.93 O2 ve 0% CO2okumazsanız adımları 3.1\u20123.7 tekrarlayın , uygun kalibrasyon sağlamak için. Sertifikalı gaz tankları ile uygun kalibrasyonu rutin olarak onaylayın.
  9. Barometrik pletismografi odasına bağlı akış ölçerleri yeniden kontrol edin. Hava akışını odanın içine ve dışına, deneyiçin uygun hızlara göre ayarlayın (genellikle 0.1-0.3 L/dk).
  10. Barometrik pletismografi yazılımına tüm ayarlar uygulandıktan sonra, kayda başlamak için Tamam'ı tıklatın.

4. Sınırsız Barometrik Pletilografi

  1. Farenin ağırlığını ve ilk vücut sıcaklığını kaydedin. Boş bir odadan O2 ve CO2 verilerini toplamak için fareyi odaya yerleştirmeden önce 10 dakika bekleyin. Gürültü ve kokuların veri toplamaya engel olmaması için farelere aşina sakin bir alanda çalışın. Veri toplama odasına girip çıkan kapıların veya personelin açılması ve kapatılması da dahil olmak üzere olası aksaklıkları önleyin.
    NOT: Bu özel protokolde 22 aylık erkek C57BL/6J fare kullanılmıştır.
  2. İlk saat boyunca, farenin davranışlarını belgele ve odanın giriş/çıkışı akışının belirli değerleri de dahil olmak üzere ayrıntılı notlar alın.
  3. Oda alışkanlığı 60 dakika sonra, aşağıdaki 60 dk için sessiz nefes segmentleri için izlemek. Koklama ve tımar olmadan uzunluğu en az 15 s süren herhangi bir segmentleri liste. İmplante edilebilir bir cihaz kullanırken her 10 dakikada bir vücut ısısı ölçüleri alın.
  4. Deneyin sonunda fareyi odadan çıkarın ve kafesine geri yerleştirin. Tüm ekipmanlar temizlenmeli ve iyice silinmelidir. Su damlacıkları kalırsa, bunları kaldırmak için basınçlı hava kullanın.

5. Solunum Ve Metabolizma Deseni Analizi

  1. Barometrik pletismografi inceleme dosyasını açın ve ilgi çeken hayvan için kaydedilen notlara başvurun.
  2. Yazılımda Metabolik paneli açın ve oda boşken, O2 ve CO2'ninilk 10 dk ortalamasını alın. Bu değerleri FiO2 ve FiCO2olarak kaydedin.
  3. Barometrik plethysmography yazılımının Akış panelini görüntüleyin. Öznitelikleri Çözümle'yi sağ tıklatın ve uygun parametreleri ayarlayın. Meta 1 sekmesi altında, Adım 5.2'den FiO2 ve FiCO2'yi girin ve VO 2 ve VCO2'yihesaplamak için Meta 2'ninaltındaki odaya akışı girin.
  4. Nefes analizi deseni için, hayvan davranışları ve akış paneli izleme hakkında notlar kullanarak sessiz nefes 15 saniye için zaman onaylamak. Data Parser sekmesinden Açık Veri Parser Diyaloğu altında 15 s aralıklı sessiz nefes alma sürelerini girin. Yalnızca belirli 15 s'lik ilgi segmentlerini göstermek için Parser Görünüm Modu'nu tıklatın.
  5. Ayrışmış Türemiş Verileri Kaydet'itıklatın. Binned verileri elde etmek için bir elektronik tablodaki veri dosyasını açın.

6. Apne ve Artırılmış Nefeslerin Analizi

  1. Açık inceleme dosyasında Parser Görünüm Modu'ndançıkın. Kurulum > P3 Kurulumu altında Grafik Kurulumu seçeneğine gidin ve Tür altında Sayfa Görünümü'nü seçin. Type Bölme sayısı için 5'i seçin. Mililitre/saniyede akış ölçümleri için -2'yi Düşük etiketli kutuya ve 2'yi yüksek etiketli kutuya girin. Değişiklikleri uygulayın.
  2. Akış izleme panelindeki 30 dk işaretine gidin.
  3. Fare odaya yerleştirildikten sonra 30-60 dakika boyunca apne ve artırılmış nefes leri sayın. Bir apne göstergesi, 0,5 s daha uzun veya eşit süren askıya nefes süreleri ölçmek. Artırılmış nefesler, 1,25 mL/s'nin üzerindeki solunum takibinde keskin bir artış ve ardından -0,75 mL/s'nin altında keskin bir düşüş ile gösterilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

UBP sonuçları normal hava gazı altında yapılan 16 yaşlı (22 aylık) farelerde (22 aylık) solunum paterninin değerlendirilmesinde (%20.93 O2 dengeli N2)rapor edilmiştir. Analiz ilk olarak daha uzun 10 dk sessiz nefes alma segmentinin (elde etmek için 2 saat üzerinden alınan) dört kısa 15 s segmentinin ortalaması ile karşılaştırılmasını içeriyordu (60-120 dakika içinde ölçüldü). Sakin nefes almanın, aktif solunum davranışları yla tutarlı olmadığı temsili bir akış...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protokol, farelerde sakin bir solunum taban çizgisi nin yanı sıra merkezi apneler ve artırılmış nefesler hakkında veri toplama hakkında bilgi sağlar. Temsili sonuçlar, 10 dk sessiz bir taban çizgisinin, yaşlı farelerden oluşan bir kohort için ortalama dört 15 s nöbeti ile karşılaştırıldığında benzer bir nefes alma desenine sahip olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, 15 s nöbetleri istatistiksel olarak farklı değildir, ne de bu grupların Levene testi kullanarak birbirinden varyasyon f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar Angela Le, Sarah Ruby ve Marisa Mickey'e hayvan kolonilerini koruma çalışmaları için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (CNR'yi desteklemek için L.R.D. ve McDevitt Lisans Araştırma Bursu( BEE) tarafından finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Carbon Dioxide AnalyzerAEI TechnologiesCD-3A 
Carbon Dioxide SensorAEI Technologies P-61B
Computermust be compliant with Ponemah requirements
Drierite beadsPermaPure LLCDM-AR
Flow ControlAEI TechnologiesR-1vacuum
FlowmeterTSI4100need one per chamber and one for vacuum
Gas MixerMCQ InstrumentsGB-103
Gas TanksHaun100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen AnalyzerAEI TechnologiesS-3A
Oxygen SensorAEI Technologies N-22M
Polyurethane TubingSMCTUS 0604 Y-20
Ponemah SoftwareDSI
Small Rodent ChamberBuxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)Destron-Fearingany type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber 
TransducersValidyneDP45need one per chamber 
Whole Body Plethysmography System Data Science International (DSI)Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. 

Referanslar

  1. DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
  2. Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
  3. Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
  4. van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
  5. Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
  6. Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
  7. Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
  8. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  9. Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
  10. Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
  11. Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
  12. Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
  13. Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
  14. Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
  15. Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
  16. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
  17. Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
  18. Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

DavranSay 158Apnefrekansdakika havaland rmagelgit hacmiVCO2art r lm nefes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır