JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Безудержная барометрическая плетисмография используется для количественной оценки структуры дыхания у проснувающихся мышей. Мы показываем, что 15 сегментов в рамках стандартизированного протокола отображают аналогичные значения длительной продолжительности тихого дыхания. Эта методология также позволяет количественно количественно апноэ и увеличенные вдохи в течение первого часа в камере.

Аннотация

Безудержная барометрическая плетисмография (UBP) является методом количественной оценки структуры дыхания мышей, где обычно сообщается частота дыхания, приливный объем и минутная вентиляция. Кроме того, может быть собрана информация о нервном выходе дыхания, включая наличие центрального апноэ и увеличенного дыхания. Важным фактором для UBP является получение дыхательного сегмента с минимальным воздействием тревожного или активного поведения, чтобы прояснить реакцию на проблемы с дыханием. Здесь мы представляем протокол, который позволяет получить короткие, тихие базовые линии у пожилых мышей, сравнимые с ожиданием более длительных приступов тихего дыхания. Использование более коротких сегментов времени является ценным, так как некоторые штаммы мышей могут быть все более возбудимыми или тревожными, и более длительные периоды тихого дыхания не могут быть достигнуты в разумные сроки. Мы поместили 22-месячных мышей в камеру UBP и сравнили четыре 15 сегментов тихого дыхания между минутами 60-120 и более длинным 10 минутами спокойного дыхания, который занял 2-3 ч, чтобы приобрести. Мы также получили количество центрального апноэ и увеличенные вдохи до тихого дыхания сегментов, после 30 минут периода ознакомления. Мы показываем, что 10 минут тихого дыхания сравнимо с использованием гораздо более короткой 15-й продолжительности. Кроме того, время, предшествуя этим 15 с тихого дыхания сегментов могут быть использованы для сбора данных о апноэ центрального происхождения. Этот протокол позволяет следователям собирать шаблон-дыхания данных в определенное количество времени и делает тихие базовые меры осуществимы для мышей, которые могут проявлять увеличение количества возбудимого поведения. Сама методология UBP обеспечивает полезный и неинвазивный способ сбора данных о шаблонах дыхания и позволяет мыши тестироваться в течение нескольких временных точек.

Введение

UBP является распространенной техникой для оценки дыхательных узоров1,,2,23,,4. В этом методе мыши помещаются в закрытую камеру, где различия в давлении между основной камерой (где находится животное) и эталонной камерой, фильтруются через пневмотахограф для получения значений. Полученная установка UBP является неинвазивной и безудержной и позволяет оценить респираторные меры без необходимости анестезии или хирургического вмешательства. Кроме того, этот метод подходит для исследований, требующих нескольких измерений в одной и той же мыши с течением времени. Переменные, такие как частота дыхания, объем приливов и минутная вентиляция может быть количественно с помощью этого метода, во время одного испытания или в течение нескольких испытаний. UBP всего тела также обеспечивает измерения пиковых потоков и продолжительности дыхательного цикла. Вместе эти параметры количественно определить структуру дыхания. Записанные следы дыхания также позволяют просматривать данные и подсчитывать количество центральных апноэ, отображаемых в течение определенного периода времени. Это количество может быть использовано наряду с анализом приливного объема и inspiratory раз для оценки других изменений в структуре дыхания.

В то время как существует несколько неинвазивных методов плейсмографии для непосредственной оценки легочных физиологических параметров, UBP всего тела позволяет провести скрининг на дыхательную функцию с минимальным неоправданным стрессом для мыши. Головной плетисмографии, которая использует приливные меры среднего течения потока, а также неинвазивный, опирается на сдержанность, как и многие другие виды плетисмографии (например, двухкамерный плетисмографии). Хотя эти методы были использованы в моделях грызунов для измерения реакции дыхательных путей5, использование воротники шеи или небольшие удерживающие трубки могут занять мышей (по сравнению с другими видами) дольше, чтобы акклиматизироваться и вернуть свое дыхание к уровню отдыха.

Получение оптимального сегмента воздуходыша является важным фактором для базовых сравнений. Более широкое использование коммерчески доступных систем плейсмографии делает возможным сбор данных о шаблонах дыхания во многих лабораториях. Важно отметить, что структура дыхания является переменной на протяжении всего периода сбора, особенно для мышей. С указанной стороной необходимо стандартизировать базовый анализ как средство обеспечения того, чтобы уровень подготовки экспериментаторов не смуал результаты. Существует множество способов сбора сегмента дыхания воздуха, который служит одной из областей вариаций между экспериментальными проектами. Один пример включает в себя усреднение окончательного 10-30 мин данных после ранее определенного набора времени в камере1, в то время как другой метод включает в себя ожидание, пока мышь заметно спокойно в течение 5-10 мин6. Последний может занять 2-3 ч для достижения, а в некоторых случаях, судебное разбирательство, возможно, потребуется отказаться, если мышь не спокойна достаточно долго. Эта озабоченность является особенно важным фактором для штаммов мышей, где наблюдаемое поведение более тревожным и возбудимым7. Эти мыши могут занять больше времени, чтобы приспособиться к камере окружающей среды и только оставаться спокойным в течение коротких очередей времени. Ограничение времени, отведенного на базовую коллекцию, стандартизирует время камеры для каждой мыши.

Очень важно, чтобы экспериментаторы получили подходящий базовый участок, который включает в себя значения поведения отдыха в мыши, но также происходит своевременно. Таким образом, цель этого доклада заключается в предоставлении описания методов, используемых для получения коротких тихих базовых значений для дыхания параметров у мышей. Кроме того, мы сообщаем, что апноэ и увеличенные вдохи могут быть количественно в течение первого часа в камере.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных колледжа Ле Мойн. Все использование животных было в согласии с политикой, описанной в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных8.

ПРИМЕЧАНИЕ: (Критически) До экспериментов, получить все необходимые разрешения и обучение, необходимые для использования животных. Важно, чтобы экспериментаторы были ознакомины с поведением и уровнем активности мыши, включая признаки сна, дистресса и/или артефакта движения против нормального нюхания и дыхания.

1. Барометрическая палата плейсмографии всего тела

  1. Прочитайте соответствующие руководства пользователя для барометрической камеры плетисмографии, включая разъемы, O-кольца и т.д., и создайте стандартный протокольный файл для определения анализаторов (например, метаболических) и параметров, характерных для программного обеспечения.
  2. Убедитесь, что все шланги и трубки подключены к камере. Соедините трубку потока газа (flow-in) и вакуумную трубку (выход) непосредственно к барометрической камере плейсмографии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приток должен быть прикреплен к потокусмещения открывания marked.
  3. Прикрепите CO2,O2и N2 газовые баллоны к газовому смесителю. Убедитесь, что все газовые баллоны находятся в открытом положении до экспериментов.

2. Калибровка барометрической палаты плейзирования

  1. Калибрайте высокий и низкий поток газа, выбрав 7700-усилитель настройки под аппаратной вкладке барометрического программного обеспечения плетисмографии.
  2. Установите вакуум (выход из камеры), подходящий для экспериментальных проектных и газоанализаторов (0,1 л/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость оттока должна оставаться прежней на протяжении всей калибровки и экспериментировать для точных метаболических записей.
  3. Установите низкий поток воздуха, удалив трубку потока из камеры и выключив вакуум.
  4. Запись нулевого потока, введя 0 в ячейку Low Unit для соответствующей камеры. Дважды щелкните ячейку Low Cal, измените время до 3 с и нажмите Measure.
  5. Прикрепите трубку потока и позвольте газу (20.93% O2,сбалансированному N2)течь через барометрическую камеру плетисмографии из газового смесителя.
  6. Преобразуйте приток из литров/минут в миллилиты в секунду. Нажмите ячейку High Unit для соответствующей камеры и введите значение в миллилитрах в секунду. Двойной щелчок High Cal,изменить время до 3 с, и нажмите Мера.
  7. Оставьте вкладку 7700-Amplifier Setup открытой для калибровки метаболических анализаторов в программное обеспечение барометрической плетисмографии.

3. Метаболический анализатор калибровки

  1. В газовой программе смесителя установите газовый смеситель для выпуска потока газа, содержащего 20,93% O2 и 79,07% N2.
  2. На метаболических анализаторов установите уровень калибровки O2 до 20,93%, а CO2 - до 0%. Поверните циферблат обратно в образец после ввода соответствующих значений.
  3. Установите высокий процент O2. Нажмите на вкладку ABCD-4 барометрического программного обеспечения плетилисмографии, а затем введите 20.93 под высоким блоком линии C2. Под High Cal, изменить время до 3 с и хит мера.
  4. Установите низкий процент CO2. Введите 0 под Low Cal линии C3, а затем изменить время до 3 с и нажмите Мера под Low Cal.
  5. В программе смесителя газа измените значение O2 до 10%, а значение CO2 до 5%. Подождите несколько минут, пока поток газа приспособится к этим значениям. На метаболических анализаторов, включите регулировки ручки для калибровки CO2 равна 5%. Не забудьте повернуть циферблат обратно в образец после откалибровки значений.
  6. Установите высокий процент CO2. Убедитесь, что показания анализатора стабильны перед вставкой соответствующих значений в O2 и CO2 на программное обеспечение барометрической плетисмографии. Нажмите высокой единицы под C3 и введите 5. Изменение High Cal до 3 с и хит мера.
  7. Установите низкий процент O2. Нажмите Низкий блок под опцией C2 и введите 10. Нажмите Низкий Cal, ввод 3 с, и нажмите Мера.
  8. Изменение значений газа на газовом смесителе обратно до 20,93% O2 и 79,07% N2. Подождите несколько минут, пока камера приспособится к этим значениям. Повторите шаги 3.1'u20123.7, если метаболические анализаторы автоматически не считывают 20,93% O2 и 0% CO2,чтобы обеспечить надлежащую калибровку. Регулярно подтверждайте надлежащую калибровку с сертифицированными газовыми баллонами.
  9. Перепроверить счетчики потока, подключенные к барометрической камере плейсмографии. Отрегулируйте поток воздуха в камеру и из нее на тарифы, подходящие для эксперимента (обычно, 0,1-0,3 л/мин).
  10. После того, как все настройки были применены к программному обеспечению барометрической плетисмографии, нажмите OK, чтобы начать запись.

4. Безудержная барометрическая плетисмография

  1. Запишите вес мыши и начальную температуру тела. Подождите 10 минут, прежде чем поместить мышь в камеру, чтобы собрать данные O2 и CO2 из пустой камеры. Работа в тихом районе, знакомом мышам, поэтому шум и запахи не мешают сбору данных. Избегайте возможных сбоев, включая открытие и закрытие дверей или перемещения персонала в/из комнаты сбора данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом специальном протоколе использовался 22-месячный мужчина C57BL/6J mouse.
  2. В течение первого часа документируйте поведение мыши и сделать подробные заметки, включая конкретные значения потока в/из камеры.
  3. После 60 минут камерного привыкания, следите за сегментами тихого дыхания в течение следующих 60 мин. Перечислите любые сегменты продолжительностью не менее 15 с в длину без обнюхивания иухода. Принимайте меры температуры тела каждые 10 минут при использовании имплантируемого устройства.
  4. В конце эксперимента выньте мышь из камеры и поместите ее обратно в клетку. Все оборудование должно быть тщательно очищено и вытерто. Если капли воды остаются, используйте воздух под давлением, чтобы удалить их.

5. Анализ модели дыхания и метаболизма

  1. Откройте барометрический файл проверки плетисмографии и проконсультируйтесь с записанными примечаниями для интересуемого животному.
  2. Откройте метаболическую панель в программном обеспечении и возьмите в среднем первые 10 минут O2 и CO2, когда камера была пуста. Запись этих значений, как FiO2 и FiCO2.
  3. Посмотреть панель потока программного обеспечения барометрической плетисмографии. Нажмите справа, проанализируйте атрибуты и установите соответствующие параметры. Под вкладкой Meta 1 введите FiO2 и FiCO2 со ступени 5.2, а также поток в камеру под Meta 2,чтобы рассчитать VO2 и VCO2.
  4. Для модели анализа дыхания, подтвердить время для 15 секунд тихого дыхания, используя заметки о поведении животных, а также отслеживание панели потока. Введите время для 15 с интервалами тихого дыхания под Open Data Parser Диалог из вкладки Data Parser. Нажмите Parser View Mode, чтобы показать только конкретные 15 сегментов интереса.
  5. Нажмите Сохранить Parsed полученных данных. Откройте файл данных в электронной таблице для получения связанных данных.

6. Анализ апноэ и дополненных дыханий

  1. В открытом файле обзора выйдите в режим Parser ViewMode . Перейти в Graph Настройка вариант под настройкой и P3 Настройка и выберите просмотр страницы под типом. Выберите 5 для количества стекол. Введите -2 в поле с пометкой Низкий и 2 в поле с пометкой High для измерения потока в миллилитрах в секунду. Примените изменения.
  2. Прокрутите до отметки 30 минут на панели отслеживания потока.
  3. Подсчитайте апноэ и увеличенные вдохи в течение 30-60 минут после того, как мышь была помещена в камеру. Количественная оценка периодов подвесного дыхания продолжительностью более или равна 0,5 с, что свидетельствует о апноэ. Дополненные вдохи указывают на резкий рост дыхания выше 1,25 м/с с последующим резким снижением ниже -0,75 м/с.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Сообщается о результатах UBP как оценки структуры дыхания у 16 возрастных (22-месячных) мышей, выполняемых при нормальном воздушном газе (20,93% O2 со сбалансированным N2). Анализ первый включал в себя сравнение более 10 мин тихого дыхания сегмента (который взял более 2 ч, чтобы получит...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол содержит информацию о тихом дыхании базовых у мышей, а также сбор данных о центральных апноэ и увеличенных вдохов. Репрезентативные результаты показывают, что 10 мин тихий базовый имеет аналогичную картину дыхания по сравнению с в среднем четыре 15 с боями для когорты старых мыш...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Анжелу Ле, Сару Руби и Марису Микки за их работу по поддержанию колоний животных. Эта работа была профинансирована 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. для поддержки CNR), и McDevitt бакалавриат научно-исследовательской стипендии в естественных науках (BEE).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Carbon Dioxide AnalyzerAEI TechnologiesCD-3A 
Carbon Dioxide SensorAEI Technologies P-61B
Computermust be compliant with Ponemah requirements
Drierite beadsPermaPure LLCDM-AR
Flow ControlAEI TechnologiesR-1vacuum
FlowmeterTSI4100need one per chamber and one for vacuum
Gas MixerMCQ InstrumentsGB-103
Gas TanksHaun100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen AnalyzerAEI TechnologiesS-3A
Oxygen SensorAEI Technologies N-22M
Polyurethane TubingSMCTUS 0604 Y-20
Ponemah SoftwareDSI
Small Rodent ChamberBuxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)Destron-Fearingany type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber 
TransducersValidyneDP45need one per chamber 
Whole Body Plethysmography System Data Science International (DSI)Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. 

Ссылки

  1. DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
  2. Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
  3. Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
  4. van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
  5. Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
  6. Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
  7. Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
  8. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  9. Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
  10. Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
  11. Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
  12. Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
  13. Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
  14. Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
  15. Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
  16. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
  17. Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
  18. Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

158VCO2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены