שיטה להשגת תבנית הנשימה בעכברים מרחבי הדרך

Summary

משמש לכמת את תבנית. הנשימה בעכברים ערים אנו מראים כי מקטעים של 15 מתחת לפרוטוקול מתוקננת מציגים ערכים דומים למשך זמן ממושך של נשימה שקטה. מתודולוגיה זו מאפשרת גם הכמת של דום נשימה ונשימות מוגבר במהלך השעה הראשונה בחדר.

Abstract

(UBP) הוא שיטה לכמת את תבנית הנשימה בעכברים, היכן שתדר הנשימה, נפח הגאות והאוורור של הדקה מדווחים באופן שגרתי. כמו-כן, ניתן לאסוף מידע לגבי התפוקה העצבית של הנשימה, כולל קיומה של מרכז apneas ונשימה מורחבת. שיקול חשוב של UBP הוא להשיג קטע נשימה עם השפעה מינימלית של התנהגויות להוט או פעיל, כדי להבהיר את התגובה לאתגרים נשימה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר בסיסיות קצרות, שקטות להתקבל בעכברים מיושנים, הדומה להמתנה לתקופות ארוכות יותר של נשימה שקטה. השימוש במקטעי זמן קצרים יותר הוא יקר ערך, כמו כמה זנים של עכברים עשויים להיות יותר ויותר מתרגש או חרד, ותקופות ארוכות יותר של נשימה שקטה לא ניתן להשיג בתוך פרק זמן סביר. הונחו 22 חודשים בן עכברים בחדר UBP והשוו 4 15 s שקטים נשימה מקטעים בין דקות 60 – 120 למשך זמן ארוך יותר 10 דקות נשימה שקטה כי לקח 2 – 3 h כדי לרכוש. כמו כן הצלחנו להשיג ספירות מרכזיות של apneas ונשימות מרושמות לפני מקטעי הנשימה השקטים, לאחר תקופת ההכרות של 30 דקות. אנו מראים כי 10 דקות של נשימה שקטה דומה לשימוש קצר הרבה יותר 15 s משך. בנוסף, את הזמן המוביל של אלה 15 שקטים מגזרי נשימה ניתן להשתמש כדי לאסוף נתונים לגבי apneas של המקור המרכזי. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לאסוף נתונים של תבנית של נשימה בפרק זמן מוגדר ועושה אמצעים שקטים בסיסיים ריאלי עבור עכברים שעשויים להפגין כמויות מוגברת של התנהגות להתרגש. מתודולוגיית UBP עצמה מספקת דרך שימושית ולא פולשנית לאסוף נתונים של דפוס-of-נשימה ומאפשר לעכברים להיבדק על מספר נקודות זמן.

Introduction

Ubp היא טכניקה נפוצה להערכת דפוסי נשימה^1,2,3,4. בשיטה זו, עכברים ממוקמים בתא סגור שבו הבדלים בלחץ בין החדר הראשי (שבו החיה שוכנת) וחדר התייחסות מסוננים באמצעות הינע פנאומטי כדי להשיג ערכים. ההתקנה של UBP וכתוצאה מכך הוא פולשני ולא מרסן ומאפשר אמצעים הנשימה להיות מוערך ללא דרישה של הרדמה או ניתוח. בנוסף, טכניקה זו מתאימה למחקרים המצריכים מדידות מרובות באותו עכבר לאורך זמן. משתנים כגון תדר נשימה, נפח גאות, ואוורור דקה ניתן לכמת עם שיטה זו, במהלך ניסוי אחד או על פני מספר מבחנים. הגוף השלם UBP גם מספק מדדים של זרמי השיא משך מחזור הנשימה. ביחד, הפרמטרים הללו. מכמת את תבנית הנשימה סימני הנשימה המוקלט גם מאפשרים לסקור את הנתונים ולספור את מספר האפניאס המרכזי המוצג בפרק זמן נתון. ניתן להשתמש בספירה זו לצד ניתוח של עוצמת הגאות והinspiratory פעמים כדי לאמוד שינויים אחרים בתבנית הנשימה.

בעוד כמה טכניקות plethysmography לא פולשני קיימים עבור הערכה ישירה של פרמטרים פיזיולוגיים ריאתי, הגוף השלם UBP מאפשר דרך המסך עבור פונקציית הנשימה עם מתח מינימלי מזערי לעכבר. הראש החוצה החוצה, אשר משתמשת באמצעים זרימת הגזים הגאות והוא גם לא פולשני, מסתמך על איפוק, כמו סוגים רבים אחרים של הפלתיגרפיה (למשל, השני הקאמרית בחדר). בעוד שיטות אלה נעשה שימוש במודלים מכרסמים למדוד תגובתיות דרכי הנשימה⁵, השימוש קולרים צוואר או שפופרות ריסון קטן עלול לקחת עכברים (לעומת מינים אחרים) יותר כדי התאקלם ולהחזיר את הנשימה שלהם כדי לנוח רמות.

השגת קטע אוויר אופטימלי הוא שיקול חשוב עבור השוואות בסיסיות. השימוש המוגבר במערכות הפלתיגרפיה הפנויות מסחרית מאפשר איסוף נתונים של תבנית הנשימה האפשרית במעבדות רבות. וחשוב מכך, דפוס הנשימה משתנה לאורך כל תקופת האיסוף, במיוחד לעכברים. עם זאת, יש צורך לתקנן את הניתוח הבסיסי כאמצעי להבטיח שרמת האימון של הניסויים לא מרמה תוצאות. ישנן דרכים רבות לאיסוף מקטע נושם אוויר, המשמש כתחום אחד של וריאציה בין עיצובים ניסיוניים. דוגמה אחת כוללת חישוב ממוצע של 10 – 30 דקות של נתונים לאחר מערכת זמן שהוגדרה בעבר בתוך חדר¹, בעוד ששיטה אחרת כרוכה בהמתנה עד שהעכבר יהיה רגוע בעליל עבור 5 – 10 מינימום⁶. האחרון יכול לקחת 2 – 3 h כדי להשיג במקרים מסוימים, המשפט עשוי להיות צריך להיות נטוש אם העכבר אינו רגוע מספיק זמן. חשש זה הוא שיקול חשוב במיוחד עבור זנים של עכברים שבהם התנהגויות נצפו הם להוטים יותר ולהתרגש⁷. עכברים אלה עלולים להימשך זמן רב יותר כדי להסתגל לסביבה הקאמרית ולהישאר רגועים רק להתפרצויות קצרות של זמן. מגביל את הזמן המוקדש האוסף הבסיסי מתקן את הזמן החדר עבור כל עכבר.

זה חיוני כי ניסויים לקבל בסיס מתאים המקיף ערכי התנהגות מנוחה בעכבר, אך גם מתרחשת בזמן. מכאן, המטרה של דו ח זה היא לספק תיאור של שיטות המשמשות להשגת ערכים בסיסיים שקטים קצרים עבור פרמטרים נשימה בעכברים. כמו-כן, אנו מדווחים כי האפנאס והנשימות הרבודה ניתן לכמת בשעה הראשונה בחדר.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים במכללת לה ממוין. כל שימוש בבעלי חיים היה בהסכמה עם המדיניות המתוארת במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה⁸.

הערה: (קריטי) לפני ניסויים, השג את כל האישורים וההדרכה הדרושים לשימוש בעלי חיים. חשוב שהנסחנים מוכרים עם התנהגויות העכבר ורמות הפעילות, כולל סימנים של שינה, מצוקה ו/או חפץ התנועה לעומת הריח והנשימה הרגילים.

1. לשכת החלל הפלמטריים השלמה

1. קראו את מדריכי המשתמשים המתאימים לחדר הסטנדרט הברומטרי, כולל מחברים, טבעות O, וכו ', וצרו קובץ פרוטוקול סטנדרטי להגדרת אנלייזרים (לדוגמה, חילוף חומרים) ופרמטרים ספציפיים לתוכנה.
2. ודא שכל הזרנוקים והצינורות מחוברים לחדר. חברו צינור גז (זרימה פנימה) ושפופרת ואקום (זרימה-out) ישירות לחדר החריץ הברומטרי.
   הערה: יש לצרף את הזרימה הנכנס לפתח המסומן בזרם הטיה.
3. הצמד CO₂, O₂, ו N₂ מיכלי גז למיקסר גז. ודא שכל מיכלי הגז נמצאים במצב פתוח לפני הניסויים.

2. כיול החדר הפלמטריים הברומטרי

1. כיילו את זרימת הגז הגבוהה והנמוכה על-ידי בחירה בתוכנית ההתקנה של 7700-מגבר , תחת הכרטיסייה חומרה של תוכנת הרנטגן הברומטריים.
2. הגדר ואקום (זרימה מתוך התא) המתאים לעיצוב ניסיוני ומנתחי גז (~ 0.1 L/min).
   הערה: קצב הזרימה חייב להישאר זהה לאורך כל הכיול ולהתנסות בהקלטות מטבולית מדויקות.
3. הגדר זרימת אוויר נמוכה על-ידי הסרת צינור הזרימה מהתא וכיבוי הוואקום.
4. הקלט את זרימת האפס על-ידי הזנת 0 לתא היחידה הנמוכה עבור התא המתאים. לחץ פעמיים על התא Cal הנמוך , שנה את השעה ל-3 s והיכה מדידה.
5. חברו את צינור הזרימה ואפשר גז (20.93% O₂, מאוזנת N₂) כדי לזרום דרך החדר החריץ הברומטרי ממערבל הגז.
6. המר את הזרימה הנכנסת מפני ליטר/דקות לתוך מילימטר/שניה. לחץ על תא היחידה הגבוהה עבור התא המתאים והזן את הערך במילי-ליטר/שניה. לחץ פעמיים על Cal גבוהה, שנה את השעה עד 3 s ולחץ על מדידה.
7. השאר את כרטיסיית ההתקנה של 7700-מגבר פתוחה כדי לכייל את מנתחי החילוף המטוליים לתוכנת הפלתיגרפיה הברומטריים.

3. כיול מנתח מטבולית

1. בתוכנית מערבל הגז, להגדיר את מערבל הגז כדי לשחרר את זרימת הגז המכיל 20.93% O₂ ו 79.07% N₂.
2. על מאבחנים חילוף החומרים, להגדיר את רמת כיול O₂ כדי 20.93% ו-CO₂ לקרוא 0%. הפעל את החיוג חזרה למדגם לאחר הזנת הערכים המתאימים.
3. הגדר את האחוז הגבוה או₂ . לחץ על הכרטיסייה Abcd-4 של תוכנת הרנטגן הברומטריים ולאחר מכן הזן 20.93 תחת היחידה הגבוהה של קו c2. תחת Cal גבוה, לשנות את הזמן כדי 3 s ולהכות מדידה.
4. הגדר את האחוז הנמוך של CO₂ . הזן 0 תחת cal נמוך של הקו C3 ולאחר מכן שנה את השעה ל-3 ולחץ על מדידה תחת Cal נמוך.
5. בתוכנית מערבל הגז, לשנות את הערך O₂ ל 10% ואת ערך CO₂ ל 5%. המתן מספר דקות עד שזרימת הגז תתאים לערכים אלה. על מאבחנים חילוף החומרים, להפוך את ידיות הכוונון כדי לכייל CO₂ שווה ל 5%. הקפד להפוך את החיוג חזרה לדגימה לאחר שהערכים מכוילים.
6. הגדר את האחוז הגבוה של CO₂ . ודא שקריאות המנתח יציבות לפני הכנסת הערכים המתאימים לתוך O₂ ו-CO₂ על התוכנה הפלנוגרפיה ברומטריים. לחץ על יחידה גבוהה תחת C3 והזן 5. לשנות את ה- Cal הגבוה ל -3 ולהכות מדידה.
7. הגדר את האחוז הנמוך O₂ . לחץ על יחידה נמוכה תחת האפשרות C2 והזן 10. לחץ על Cal נמוכה, קלט 3 s ולחץ על מדידה.
8. לשנות את ערכי הגז על מערבל הגז חזרה 20.93% O₂ ו 79.07% N₂. המתן מספר דקות עד שהתא יתאים לערכים אלה. חזור על השלבים 3.1 \ u 20123.7 אם מנתחי חילוף החומרים לא לקרוא באופן אוטומטי 20.93% O₂ ו -0% CO₂, כדי להבטיח כיול ראוי. מאשרים באופן שגרתי כיול. מתאים עם מיכלי גז מוסמכים
9. בדיקה חוזרת של מוני הזרימה. המחוברים לחדר הפלתיגרפיה הברומטרי כוונן את זרימת האוויר לתוך ומחוץ לחדר לתעריפים המתאימים לניסוי (בדרך כלל, 0.1 – 0.3 L/דקות).
10. לאחר שהחלת כל ההגדרות על התוכנה הרונוגרפיה ברומטריים, לחץ על אישור כדי להתחיל בהקלטה.

4. הפלתיגרפיה ברומטריים

1. הקלט את משקל העכבר וטמפרטורת הגוף הראשונית. לחכות 10 דקות לפני הצבת העכבר בחדר, כדי לאסוף O₂ ו-CO₂ נתונים מתא ריק. עבוד באזור שקט המוכר לעכברים כך שרעש וריחות לא יפריעו לאיסוף הנתונים. הימנע מהפרעות אפשריות, כולל הפתיחה והסגירה של דלתות או אנשי צוות העוברים פנימה/החוצה מחדר איסוף הנתונים.
   הערה: פרוטוקול ספציפי זה המועסקים 22 C57BL בן זכר/בעכבר 6J.
2. במהלך השעה הראשונה, תעד את התנהגויות העכבר ורשום הערות מפורטות, כולל ערכים ספציפיים של הזרימה מהתא.
3. לאחר 60 דקות של הרגלה קאמרית, לצפות קטעים של נשימה שקטה עבור הבאים 60 min. List כל מקטעים שנמשכים לפחות 15 s באורך מבלי לרחרח ולטפח. קחו את טמפרטורת הגוף כל 10 דקות כאשר משתמשים במכשיר להשתלות.
4. בסוף הניסוי, להסיר את העכבר מן התא ולמקם אותו חזרה בכלוב שלו. יש לנקות את כל הציוד ולהימחק ביסודיות. אם נותרו טיפות מים, השתמשו באוויר לחצים כדי להסירם.

5. ניתוח תבנית הנשימה וחילוף החומרים

1. והתייעץ עם ההערות המוקלטות. של בעל החיים המעניין
2. פתח את לוח מטבולית בתוכנה ולקחת את הממוצע של 10 הדקות הראשונות של O₂ ו-CO₂, כאשר החדר היה ריק. הקלט ערכים אלה כ-FiO₂ ו-fico₂.
3. לצפיה בלוח הזרימה של תוכנת הפלתיגרפיה הברומטריים. לחץ לחיצה ימנית על ' ניתוח תכונות ' והגדר פרמטרים מתאימים. תחת הכרטיסייה Meta 1 , הזן את fio₂ ו-fico₂ משלב 5.2, כמו גם את הזרימה לתוך התא תחת Meta 2, כדי לחשב VO₂ ו-vco₂.
4. לדפוס של ניתוח נשימות, לאשר את הזמנים עבור 15 שניות של נשימה שקטה באמצעות הערות על התנהגות בעלי חיים, כמו גם את מעקב לוח הזרימה. הזן את המועדים עבור מרווחי ה-15 של הנשימה השקטה תחת דו-שיח מנתח נתונים פתוח מהכרטיסיה מנתח נתונים . לחץ על מצב תצוגת מנתח כדי להציג רק את מקטעי הריבית הספציפיים של 15.
5. לחץ על שמור נתונים נגזרים שנותחה. פתח את קובץ הנתונים בגיליון אלקטרוני כדי לקבל את נתוני ה-נופה.

6. ניתוח אפיאס ונשימות רבודה

1. בקובץ הסקירה הפתוחה, צא מ'מצב תצוגה של מנתח'. עבור אל האפשרות הגדרת גרף תחת ההתקנה > P3 ההתקנה ובחר תצוגת עמוד תחת סוג. בחר 5 עבור מספר החלוניות. הזן -2 לתוך התיבה המסומנת כ- Low ו- 2 לתוך התיבה המסומנת כגבוהה עבור אמצעי זרימה במילי-ליטר/שנייה. החל את השינויים.
2. גלול לסימן 30 דקות בלוח הבקרה של הזרימה.
3. הרוזן apneas ואת מגבירה נשימות עבור 30-60 דקות לאחר העכבר הוצב בחדר. תקופות מכמת של נשימה מושהה נמשך זמן רב יותר או שווה ל 0.5 s, מעיד על דום נשימה. נשימות רבודה מסומנות על ידי עלייה חדה בעקבות נשימה מעל 1.25 mL/s ואחריו ירידה חדה מתחת-0.75 mL/s.

תוצאות

התוצאות של UBP כהערכה של דפוס של נשימה בגיל 16 (בן 22 חודשים) עכברים שבוצעו תחת גז האוויר הרגיל (20.93% O₂ עם מאוזנת N₂) מדווחים. הניתוח כלל השוואה של מקטע נשימה ארוך יותר של 10 דקות (שלקח למעלה מ -2 שעות להשיג) לעומת הממוצע של ארבעה מגזרים קצרים של 15 דקות (כימות בתוך מספר שניות 60 – 120). מעקב אחר...

Discussion

הפרוטוקול מספק מידע לגבי בסיס נשימה שקט בעכברים, כמו גם איסוף נתונים על מרכזי apneas ונשימות מוגבר. תוצאות הנציג מראים כי 10 דקות הבסיסית שקט יש דפוס דומה של נשימה בהשוואה לממוצע של 4 15 s התקפי עבור קבוצה של עכברים ישנים. וחשוב מכך, התקפי ה-15 אינם שונים מבחינה סטטיסטית, וגם לקבוצות אלה אין הבדלים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon Dioxide Analyzer	AEI Technologies	CD-3A
Carbon Dioxide Sensor	AEI Technologies	P-61B
Computer			must be compliant with Ponemah requirements
Drierite beads	PermaPure LLC	DM-AR
Flow Control	AEI Technologies	R-1	vacuum
Flowmeter	TSI	4100	need one per chamber and one for vacuum
Gas Mixer	MCQ Instruments	GB-103
Gas Tanks	Haun		100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen Analyzer	AEI Technologies	S-3A
Oxygen Sensor	AEI Technologies	N-22M
Polyurethane Tubing	SMC	TUS 0604 Y-20
Ponemah Software	DSI
Small Rodent Chamber	Buxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)	Destron-Fearing		any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber
Transducers	Validyne	DP45	need one per chamber
Whole Body Plethysmography System	Data Science International (DSI)		Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc.