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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La pletimografía barométrica sin restricciones se utiliza para cuantificar el patrón de respiración en ratones despiertos. Mostramos que los segmentos de 15 s bajo un protocolo estandarizado muestran valores similares a una duración prolongada de respiración silenciosa. Esta metodología también permite la cuantificación de la apnea y las respiraciones aumentadas durante la primera hora en la cámara.

Resumen

La pletimografía barométrica sin restricciones (UBP) es un método para cuantificar el patrón de respiración en ratones, donde se notifica rutinariamente la frecuencia respiratoria, el volumen de marea y la ventilación diminosa. Además, se puede recopilar información sobre la salida neuronal de la respiración, incluyendo la existencia de apneas centrales y respiraciones aumentadas. Una consideración importante para la UBP es la obtención de un segmento respiratorio con un impacto mínimo de comportamientos ansiosos o activos, para dilucidar la respuesta a los problemas respiratorios. Aquí, presentamos un protocolo que permite obtener líneas de base cortas y silenciosas en ratones envejecidos, comparables a esperar más largos de respiración tranquila. El uso de segmentos de tiempo más cortos es valioso, ya que algunas cepas de ratones pueden ser cada vez más excitables o ansiosos, y períodos más largos de respiración silenciosa pueden no lograrse dentro de un plazo razonable. Colocamos ratones de 22 meses de edad en una cámara UBP y comparamos cuatro segmentos de respiración silenciosa de 15 s entre los minutos 60-120 y un período de respiración silenciosa más largo de 10 minutos que tardó de 2 a 3 horas en adquirirse. También obtuvimos recuentos de apneas centrales y respiraciones aumentadas antes de los segmentos de respiración tranquila, después de un período de familiarización de 30 minutos. Mostramos que 10 minutos de respiración silenciosa es comparable a usar una duración mucho más corta de 15 s. Además, el tiempo que conduce a estos 15 segmentos de respiración silenciosa se puede utilizar para recopilar datos sobre apneas de origen central. Este protocolo permite a los investigadores recopilar datos de patrón de respiración en una cantidad determinada de tiempo y hace que las medidas de referencia silenciosas sean factibles para ratones que pueden exhibir mayores cantidades de comportamiento excitable. La propia metodología UBP proporciona una forma útil y no invasiva de recopilar datos de patrones de respiración y permite que los ratones se prueben en varios puntos de tiempo.

Introducción

UBP es una técnica común para la evaluación de patrones respiratorios1,2,3,4. En este método, los ratones se colocan en una cámara cerrada donde las diferencias de presión entre la cámara principal (donde el animal está alojado) y una cámara de referencia se filtran a través de un neumotachogramógrafo para obtener valores. La configuración de UBP resultante no es invasiva y sin restricciones y permite evaluar las medidas respiratorias sin necesidad de anestesia o cirugía. Además, esta técnica es adecuada para estudios que requieren múltiples mediciones en el mismo ratón a lo largo del tiempo. Variables como la frecuencia respiratoria, el volumen de marea y la ventilación diminal se pueden cuantificar con este método, durante un solo ensayo o durante varios ensayos. La UBP de todo el cuerpo también proporciona medidas de flujos máximos y duración del ciclo respiratorio. Juntos, estos parámetros cuantifican el patrón de respiración. Los rastros respiratorios registrados también permiten revisar los datos y contar el número de apneas centrales mostradas dentro de un período de tiempo determinado. Este recuento se puede utilizar junto con un análisis del volumen de marea y los tiempos inspiratorios para medir otras alteraciones en el patrón de respiración.

Mientras que existen varias técnicas de pletimismografía no invasiva para la evaluación directa de los parámetros fisiológicos pulmonares, UBP de todo el cuerpo permite una manera de detectar la función respiratoria con un mínimo estrés indebido para el ratón. La pletimografía head-out, que utiliza medidas de flujo midexpiratorio de marea y también no es invasiva, se basa en la restricción, como muchos otros tipos de pletimografía (por ejemplo, pletismografía de doble cámara). Si bien estos métodos se han utilizado en modelos de roedores para medir la capacidad de respuesta de las vías respiratorias5, el uso de cuellos o pequeños tubos de retención puede llevar ratones (frente a otras especies) más tiempo para aclimatarse y devolver su respiración a los niveles de reposo.

La obtención de un segmento óptimo de respiración del aire es una consideración importante para las comparaciones de línea de base. El mayor uso de los sistemas de pletimografía disponibles comercialmente hace posible la recopilación de datos de patrones de respiración en muchos laboratorios. Es importante destacar que el patrón de respiración es variable durante todo el período de recolección, especialmente para ratones. Dicho esto, es necesario estandarizar el análisis de línea de base como un medio para garantizar que el nivel de formación de los experimentadores no confunde los resultados. Hay numerosas maneras de recoger un segmento de respiración del aire, sirviendo como un área de variación entre los diseños experimentales. Un ejemplo incluye promediar los últimos 10-30 minutos de datos después de un conjunto de tiempo previamente definido dentro de la cámara1, mientras que otro método implica esperar hasta que el ratón esté visiblemente tranquilo durante 5-10 min6. Este último puede tomar de 2 a 3 h para lograr y, en algunos casos, un ensayo puede necesitar ser abandonado si el ratón no está tranquilo durante el tiempo suficiente. Esta preocupación es una consideración especialmente importante para las cepas de ratones donde los comportamientos observados son más ansiosos y excitables7. Estos ratones pueden tardar más en adaptarse al entorno de la cámara y sólo permanecen tranquilos durante breves ráfagas de tiempo. Limitar el tiempo dedicado a la colección de líneas base estandariza el tiempo de cámara para cada ratón.

Es crucial que los experimentadores obtengan una línea base adecuada que abarque los valores de comportamiento en reposo en el ratón, pero también se produzca de manera oportuna. Por lo tanto, el objetivo de este informe es proporcionar una descripción de los métodos utilizados para obtener valores de referencia silenciosos cortos para los parámetros de respiración en ratones. Además, informamos que las apneas y las respiraciones aumentadas se pueden cuantificar durante la primera hora en la cámara.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Le Moyne College. Todo uso de animales estuvo de acuerdo con las políticas descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio8.

NOTA: (Crítico) Antes de la experimentación, obtenga todas las aprobaciones necesarias y el entrenamiento necesario para el uso animal. Es importante que los experimentadores estén familiarizados con los comportamientos del ratón y los niveles de actividad, incluyendo signos de sueño, angustia y/o artefacto de movimiento frente al olfato normal y la respiración.

1. Cámara de Plethysmography Barométrica de cuerpo entero

  1. Lea los manuales de usuario adecuados para la cámara de pletimografía barométrica, incluidos conectores, anillos tóricas, etc., y cree un archivo de protocolo estándar para definir analizadores (por ejemplo, metabólicos) y parámetros específicos del software.
  2. Asegúrese de que todas las mangueras y tubos estén conectados a la cámara. Conecte un tubo de flujo de gas (flujo de entrada) y un tubo de vacío (salida de flujo) directamente a la cámara de pletimografía barométrica.
    NOTA: La entrada debe estar unida al flujo de polarizaciónmarcado de apertura.
  3. Conecte los tanques de gas CO2,O2y N2 a la mezcladora de gas. Asegúrese de que todos los tanques de gas estén en la posición abierta antes de la experimentación.

2. Calibración de la Cámara de Plegógrafo Barométrico

  1. Calibre un flujo alto y bajo de gas seleccionando la configuración de 7700 amplificadores en la pestaña Hardware del software de pletimografía barométrica.
  2. Fije un vacío (flujo fuera de la cámara) apropiado para el diseño experimental y los analizadores de gas (0,1 L/min).
    NOTA: La tasa de salida debe seguir siendo la misma a lo largo de las calibraciones y experimentar para obtener registros metabólicos precisos.
  3. Ajuste un flujo bajo de aire quitando el tubo de flujo de la cámara y apagando el vacío.
  4. Registre el flujo cero introduciendo un 0 en la celda Unidad baja para la cámara correspondiente. Haga doble clic en la celda Cal baja, cambie la hora a 3 s y pulse Medir.
  5. Vuelva a colocar el tubo de flujo y permita que el gas (20,93% O2, balanceado N2) fluya a través de la cámara de pletimografía barométrica desde el mezclador de gas.
  6. Convierta la entrada de litros/minutos en mililitros/segundo. Haga clic en la celda Unidad alta de la cámara correspondiente e introduzca el valor en mililitros/segundo. Haga doble clic en Cal alta, cambie la hora a 3 s y haga clic en Medir.
  7. Deje abierta la pestaña 7700-Amplifier Setup para calibrar los analizadores metabólicos al software de pletimografía barométrica.

3. Calibración del analizador metabólico

  1. En el programa de mezclador de gas, configure el mezclador de gas para liberar un flujo de gas que contenga 20,93% O2 y 79,07% N2.
  2. En los analizadores metabólicos, establezca el nivel de calibración O2 en 20,93% y elCO2 para que lea 0%. Vuelva a girar el dial a Muestra una vez que se introduzcan los valores adecuados.
  3. Establezca el alto porcentaje de O2. Haga clic en la pestaña ABCD-4 del software de pletimografía barométrica y luego ingrese 20.93 bajo Unidad alta de la línea C2. En Cal alta, cambie la hora a 3 s y pulse Medir.
  4. Establezca el porcentaje bajo de CO2. Ingrese 0 bajo Cal baja de la línea C3, y después cambie el tiempo a 3 s y haga clic la medida bajo cal baja.
  5. En el programa de mezclador de gas, cambie el valor de O2 a 10% y el valor de CO2 a 5%. Espere varios minutos para que el flujo de gas se ajuste a estos valores. En los analizadores metabólicos, gire las perillas de ajuste para calibrar CO2 igual al 5%. Asegúrese de volver a girar el dial a Muestra una vez calibrados los valores.
  6. Establezca el alto porcentaje de CO2. Asegúrese de que las lecturas del analizador sean estables antes de insertar los valores adecuados en el O2 y CO2 en el software de pletimografía barométrica. Haga clic en Unidad alta en C3 e introduzca 5. Cambie Cal alto a 3 s y pulse Medir.
  7. Establezca el porcentaje bajo de O2. Haga clic en Unidad baja en la opción C2 e introduzca 10. Haga clic en Cal baja, entrada 3 s y haga clic en Medir.
  8. Cambie los valores de gas en el mezclador de gas de nuevo a 20,93% O2 y 79,07% N2. Espere varios minutos hasta que la cámara se ajuste a estos valores. Repita los pasos 3.1-u20123.7 si los analizadores metabólicos no leen automáticamente 20,93% O2 y 0% CO2,para garantizar una calibración adecuada. Confirme de forma rutinaria la calibración adecuada con tanques de gas certificados.
  9. Vuelva a comprobar los caudalímetros conectados a la cámara de pletimografía barométrica. Ajuste el flujo de aire dentro y fuera de la cámara a velocidades apropiadas para el experimento (normalmente, 0,1–0,3 L/min).
  10. Una vez que todos los ajustes se hayan aplicado al software de pletimografía barométrica, haga clic en Aceptar para comenzar a grabar.

4. Plethysmography barométrica sin restricciones

  1. Registre el peso del ratón y la temperatura corporal inicial. Espere 10 minutos antes de colocar el ratón en la cámara, para recoger los datos de O2 yCO2 de una cámara vacía. Trabajar en un área tranquila familiar para los ratones para que el ruido y los olores no interfieran con la recopilación de datos. Evite posibles interrupciones, incluyendo la apertura y el cierre de puertas o personal que se mueve dentro/fuera de la sala de recopilación de datos.
    NOTA: Este protocolo específico empleaba el ratón C57BL/6J masculino de 22 meses.
  2. Durante la primera hora, documente los comportamientos del ratón y tome notas detalladas, incluidos los valores específicos del flujo de entrada/salida de la cámara.
  3. Después de 60 minutos de habituación de cámara, esté atento a los segmentos de respiración tranquila. para los siguientes 60 min. Listar todos los segmentos que duren al menos 15 s de longitud sin oler y acicalarse. Tome medidas de temperatura corporal cada 10 minutos cuando utilice un dispositivo implantable.
  4. Al final del experimento, retire el ratón de la cámara y colóquelo de nuevo en su jaula. Todo el equipo debe limpiarse y limpiarse a fondo. Si quedan gotas de agua, utilice aire presurizado para retirarlas.

5. Análisis del patrón de la respiración y el metabolismo

  1. Abra el archivo de revisión de la pletimografía barométrica y consulte las notas grabadas para el animal de interés.
  2. Abra el panel Metabólico en el software y tome el promedio de los primeros 10 min de O2 y CO2,cuando la cámara estaba vacía. Registre estos valores como FiO2 y FiCO2.
  3. Vea el panel Flujo del software de pletimografía barométrica. Haga clic con el botón derecho en Analizar atributos y establezca los parámetros adecuados. En la pestaña Meta 1, introduzca el FiO2 y el FiCO2 del paso 5.2, así como el flujo en la cámara bajo Meta 2,para calcular EL VO2 y el VCO2.
  4. Para el patrón de análisis de respiración, confirme los tiempos para los 15 segundos de respiración silenciosa utilizando notas sobre el comportamiento animal, así como el trazado del panel de flujo. Introduzca los tiempos para los intervalos de 15 s de respiración silenciosa Parser View Mode en Diálogo de analizador de datos abierto en la ficha Analizador de datos.
  5. Haga clic en Guardar datos derivados analizados. Abra el archivo de datos en una hoja de cálculo para obtener los datos en la base.

6. Análisis de apneas y respiraciones aumentadas

  1. En el archivo de revisión abierto, salga del modo de vista del analizador. Vaya a la opción Configuración de gráfico en Configuración > Configuración p3 y seleccione Vista de página en Tipo. Seleccione 5 para el número de paneles. Ingrese -2 en la caja etiquetada Low y 2 en la caja etiquetada High para las medidas de flujo en mililitros/segundo. Aplique los cambios.
  2. Desplácese hasta la marca de 30 minutos en el panel de trazados de flujo.
  3. Recuento de apneas y respiraciones aumentadas durante los 30-60 minutos después de que el ratón fue colocado en la cámara. Cuantificar los períodos de respiración suspendida que duran más o igual a 0,5 s, indicativo de una apnea. Las respiraciones aumentadas están indicadas por un fuerte aumento en el rastro respiratorio por encima de 1,25 ml/s seguido de una fuerte disminución por debajo de -0,75 ml/s.

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Resultados

Se informan los resultados de la UBP como evaluación del patrón de respiración en ratones de 16 años (22 meses) realizados bajo gas de aire normal (20,93% O2 con N2equilibrado). El análisis primero incluyó una comparación de un segmento de respiración silenciosa más largo de 10 minutos (que tomó más de 2 h para obtener) frente al promedio de cuatro segmentos cortos de 15 s (cuantificados en minutos 60-120). En la Figura 1A se proporciona un seguimiento repres...

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Discusión

El protocolo proporciona información sobre una línea de base de respiración silenciosa en ratones, así como la recopilación de datos sobre apneas centrales y respiraciones aumentadas. Los resultados representativos muestran que una línea de base silenciosa de 10 minutos tiene un patrón de respiración similar en comparación con un promedio de cuatro peleas de 15 s para una cohorte de ratones viejos. Es importante destacar que los 15 s no son estadísticamente diferentes, ni estos grupos tienen diferencias en la v...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Angela Le, Sarah Ruby y Marisa Mickey por su trabajo manteniendo las colonias de animales. Este trabajo fue financiado por 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. para apoyar al CNR), y la Beca McDevitt de Investigación de Grado en Ciencias Naturales (BEE).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Carbon Dioxide AnalyzerAEI TechnologiesCD-3A 
Carbon Dioxide SensorAEI Technologies P-61B
Computermust be compliant with Ponemah requirements
Drierite beadsPermaPure LLCDM-AR
Flow ControlAEI TechnologiesR-1vacuum
FlowmeterTSI4100need one per chamber and one for vacuum
Gas MixerMCQ InstrumentsGB-103
Gas TanksHaun100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen AnalyzerAEI TechnologiesS-3A
Oxygen SensorAEI Technologies N-22M
Polyurethane TubingSMCTUS 0604 Y-20
Ponemah SoftwareDSI
Small Rodent ChamberBuxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)Destron-Fearingany type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber 
TransducersValidyneDP45need one per chamber 
Whole Body Plethysmography System Data Science International (DSI)Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. 

Referencias

  1. DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
  2. Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
  3. Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
  4. van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
  5. Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
  6. Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
  7. Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
  8. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  9. Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
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