Metodo per ottenere il modello di respirazione nei topi senescenti attraverso Pletimografia Barometrica Sfrenata

Riepilogo

La pletismografia barometrica non vincolata viene utilizzata per quantificare il modello di respirazione nei topi svegli. Mostriamo che 15 segmenti s sotto un protocollo standardizzato visualizzano valori simili a una durata prolungata di respirazione silenziosa. Questa metodologia consente anche la quantificazione di apnea e respiri aumentati durante la prima ora nella camera.

Abstract

La pletismografia barometrica sfrenata (UBP) è un metodo per quantificare il modello di respirazione nei topi, dove la frequenza respiratoria, il volume delle maree e la ventilazione minuti sono regolarmente segnalati. Inoltre, le informazioni possono essere raccolte per quanto riguarda l'uscita neurale della respirazione, compresa l'esistenza di apnee centrali e respiri aumentati. Una considerazione importante per UBP è ottenere un segmento respiratorio con un impatto minimo di comportamenti ansiosi o attivi, per chiarire la risposta alle sfide respiratorie. Qui, presentiamo un protocollo che permette di ottenere linee di base brevi e tranquille in topi invecchiati, paragonabili ad aspettare periodi più lunghi di respirazione tranquilla. L'uso di segmenti di tempo più brevi è prezioso, poiché alcuni ceppi di topi possono essere sempre più eccitabili o ansiosi, e periodi più lunghi di respirazione tranquilla potrebbero non essere raggiunti entro un lasso di tempo ragionevole. Abbiamo collocato topi di 22 mesi in una camera UBP e abbiamo confrontato quattro segmenti di respirazione tranquilla di 15 s tra i minuti 60-120 a un periodo di respirazione tranquillo più lungo di 10 minuti che ha richiesto 2-3 h per l'acquisizione. Abbiamo anche ottenuto conteggi di apnee centrali e respiri aumentati prima dei segmenti di respirazione tranquilla, dopo un periodo di familiarizzazione di 30 minuti. Dimostriamo che 10 min di respirazione tranquilla è paragonabile all'utilizzo di una durata di 15 s molto più breve. Inoltre, il tempo che porta a questi segmenti di respirazione silenziosa di 15 s può essere utilizzato per raccogliere dati riguardanti le apnee di origine centrale. Questo protocollo consente agli investigatori di raccogliere dati di respirazione in un determinato lasso di tempo e rende possibili misure di base silenziose per i topi che possono presentare una maggiore quantità di comportamento eccitabile. La stessa metodologia UBP fornisce un modo utile e non invasivo per raccogliere dati di pattern-of-breathing e consente ai topi di essere testati su diversi punti temporali.

Introduzione

UBP è una tecnica comune per la valutazione dei modelli respiratori^1,2,3,4. In questo metodo, i topi vengono collocati in una camera chiusa dove le differenze di pressione tra la camera principale (dove l'animale è ospitato) e una camera di riferimento vengono filtrate attraverso uno pneumotacografo per ottenere valori. La configurazione UBP risultante è non invasiva e non vincolata e consente di valutare le misure respiratorie senza la necessità di anestesia o chirurgia. Inoltre, questa tecnica è adatta per studi che richiedono più misurazioni nello stesso mouse nel tempo. Variabili come la frequenza respiratoria, il volume delle maree e la ventilazione minuti possono essere quantificate con questo metodo, durante un singolo studio o in più prove. L'UBP di tutto il corpo fornisce anche misure dei flussi di picco e della durata del ciclo respiratorio. Insieme, questi parametri quantificano il modello di respirazione. Le tracce respiratorie registrate consentono inoltre di esaminare i dati e contare il numero di apnee centrali visualizzate entro un determinato periodo di tempo. Questo conteggio può essere utilizzato insieme ad un'analisi del volume delle maree e dei tempi di inspirazione per misurare altre alterazioni del modello di respirazione.

Sebbene esistano diverse tecniche di pletismografia non invasiva per la valutazione diretta dei parametri fisiologici polmonari, l'UBP per tutto il corpo consente di valutare la funzione respiratoria con uno stress indebito minimo per il topo. Pletismografia a testa in testa, che utilizza misure di flusso midexpiratory di marea ed è anche non invasiva, si basa sulla moderazione, come molti altri tipi di pletismografia (ad esempio, pletismografia a doppia camera). Mentre questi metodi sono stati utilizzati nei modelli di roditori per misurare la reattività delle vie aeree⁵, l'uso di collari del collo o piccoli tubi di ritenuta può prendere topi (vs. altre specie) più a cclimato e tornare la loro respirazione a livelli di riposo.

Ottenere un segmento ottimale di respirazione dell'aria è una considerazione importante per i confronti di base. L'aumento dell'uso di sistemi di pletismografia disponibili in commercio rende possibile la raccolta di dati di pattern of breathing in molti laboratori. È importante sottolineare che il modello di respirazione è variabile per tutto il periodo di raccolta, in particolare per i topi. Detto questo, è necessario standardizzare l'analisi di base come mezzo per garantire che il livello di formazione degli sperimentatori non confonda i risultati. Ci sono numerosi modi per raccogliere un segmento di respirazione dell'aria, che serve come un'area di variazione tra i disegni sperimentali. Un esempio include la media dell'ultimo 10-30 min di dati che seguono un insieme di tempo definito in precedenza all'interno della camera¹, mentre un altro metodo prevede l'attesa fino a quando il mouse è visibilmente calmo per 5-10 min⁶. Quest'ultimo può richiedere 2-3 h per raggiungere e in alcuni casi, una prova potrebbe essere necessario abbandonare se il mouse non è calmo abbastanza a lungo. Questa preoccupazione è una considerazione particolarmente importante per i ceppi di topi in cui i comportamenti osservati sono più ansiosi ed eccitabili⁷. Questi topi possono richiedere più tempo per adattarsi all'ambiente della camera e rimanere calmi solo per brevi raffiche di tempo. Limitare il tempo dedicato alla raccolta della linea di base standardizza il tempo della camera per ogni mouse.

È fondamentale che gli sperimentatori ottengano una linea di base adatta che comprenda i valori di comportamento a riposo nel mouse, ma che si verifichino anche in modo tempestivo. Pertanto, l'obiettivo di questo rapporto è fornire una descrizione dei metodi utilizzati per ottenere brevi valori di base silenziosi per la respirazione dei parametri nei topi. Inoltre, riportiamo che le apnee e i respiri aumentati possono essere quantificati durante la prima ora in camera.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Le Moyne College. Tutto l'uso degli animali era in accordo con le politiche descritte nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio⁸.

NOTA: (Critico) Prima della sperimentazione, ottenere tutte le approvazioni e la formazione necessarie per l'uso degli animali. È importante che gli sperimentatori abbiano familiarità con i comportamenti e i livelli di attività del mouse, inclusi i segni di sonno, angoscia e/o artefatto di movimento rispetto al normale sniffing e respirazione.

1. Camera di Pletismografia Barometrica dell'intero corpo

1. Leggere i manuali utente appropriati per la camera di pletismografia barometrica, inclusi connettori, o-anelli, ecc., e creare un file di protocollo standard per definire gli analizzatori (ad esempio, metabolici) e i parametri specifici del software.
2. Assicurarsi che tutti i tubi flessibili e i tubi siano collegati alla camera. Collegare un tubo di flusso del gas (flow-in) e un tubo sottovuoto (flusso- out) direttamente alla camera di pletismografia barometrica.
   NOT: L'afflusso deve essere collegato al flusso di distorsionecontrassegnato dall'apertura.
3. Attaccare i serbatoi di gas CO₂, O₂e N₂ al miscelatore di gas. Assicurarsi che tutti i serbatoi di gas siano in posizione aperta prima della sperimentazione.

2. Calibrazione della camera pletismografica barometrica

1. Calibrare un flusso elevato e basso di gas selezionando l'impostazione 7700-Amplifier nella scheda Hardware del software di pletismografia barometrica.
2. Impostare un vuoto (flusso fuori dalla camera) appropriato per la progettazione sperimentale e gli analizzatori di gas (0,1 L/min).
   NOT: Il tasso di deflusso deve rimanere lo stesso per tutta la durata delle calibrazioni e sperimentare registrazioni metaboliche accurate.
3. Impostare un flusso d'aria basso rimuovendo il tubo di flusso dalla camera e spegnendo il vuoto.
4. Registrare il flusso zero immettendo uno 0 nella cella Unità bassa per la camera corrispondente. Fare doppio clic sulla cella Cal basso, modificare l'ora in 3 s e premere Misura.
5. Ricollegare il tubo di flusso e consentire al gas (20,93% O₂, bilanciato N₂) di fluire attraverso la camera di pletismografia barometrica dal miscelatore di gas.
6. Convertire l'afflusso da litri/minuti in millilitri/secondo. Fare clic sulla cella Unità alta per la camera corrispondente e immettere il valore in millilitri al secondo. Fare doppio clic su High Cal, modificare l'ora in 3 s e fare clic su Misura.
7. Lasciare aperta la scheda Impostazione amplificatore 7700 per calibrare gli analizzatori metabolici al software di pletismografia barometrica.

3. Calibrazione dell'analizzatore metabolico

1. Nel programma di miscelazione del gas, impostare il miscelatore di gas per rilasciare un flusso di gas contenente 20.93% O₂ e 79.07% N₂.
2. Sugli analizzatori metabolici, impostare il livello di calibrazione O₂ al 20,93% e il CO₂ per leggere 0%. Riportare il quadrante su Campione una volta immessi i valori appropriati.
3. Impostare la percentuale alta O_2. Fare clic sulla scheda ABCD-4 del software di pletismografia barometrica, quindi immettere 20,93 sotto Unità alta della linea C2. In High Cal, cambiare il tempo a 3 s e premere Misura.
4. Impostare la bassa percentuale di CO_2. Immettere 0 in Basso Cal della linea C3, quindi modificare l'ora in 3 s e fare clic su Misura in Cal basso.
5. Nel programma di miscelazione del gas, modificare il valore O₂ al 10% e il valore di CO₂ al 5%. Attendere alcuni minuti che il flusso di gas si adatti a questi valori. Sugli analizzatori metabolici, ruotare le manopole di regolazione per calibrare CO₂ uguale al 5%. Assicurarsi di riportare il quadrante in Campione una volta calibrati i valori.
6. Impostare l'alta percentuale di CO_2. Assicurarsi che le letture dell'analizzatore siano stabili prima di inserire valori appropriati nell'O₂ e CO₂ nel software barometrico di pletismografia. Fare clic su Unità alta sotto C3 e immettere 5. Cambia High Cal a 3 s e premi Misura.
7. Impostare la bassa percentuale O_2. Fare clic su Unità bassa sotto l'opzione C2 e immettere 10. Fare clic su Low Cal, immettere 3 s e fare clic su Misura.
8. Modificare i valori del gas sul miscelatore di gas al 20,93% O₂ e 79.07% N₂. Attendere alcuni minuti che la camera si adatti a questi valori. Ripetere i passaggi 3.1 -u20123.7 se gli analizzatori metabolici non leggono automaticamente 20,93% O₂ e 0% CO₂, per garantire la corretta calibrazione. Confermare regolarmente la corretta calibrazione con serbatoi di gas certificati.
9. Ricontrollare i misuratori di flusso collegati alla camera di pletismografia barometrica. Regolare il flusso d'aria dentro e fuori dalla camera alle velocità appropriate per l'esperimento (in genere, 0,1–0,3 L/min).
10. Una volta applicate tutte le impostazioni al software di pletismografia barometrica, fare clic su OK per iniziare la registrazione.

4. Pletimografia barometrica sfrenata

1. Registrare il peso del mouse e la temperatura corporea iniziale. Attendere 10 min prima di posizionare il mouse nella camera, per raccogliere i dati O₂ e CO₂ da una camera vuota. Lavorare in una zona tranquilla familiare ai topi in modo che il rumore e gli odori non interferiscano con la raccolta dei dati. Evitare possibili interruzioni, tra cui l'apertura e la chiusura delle porte o del personale che si sposta all'interno e all'esterno della sala di raccolta dati.
   NOT: Questo protocollo specifico impiegava il topo C57BL/6J di 22 mesi.
2. Durante la prima ora, documentare i comportamenti del mouse e prendere appunti dettagliati, compresi i valori specifici del flusso dentro/fuori dalla camera.
3. Dopo 60 min di assuefazione da camera, guardare per i segmenti di respirazione tranquilla per i seguenti 60 min. Elencare tutti i segmenti della durata di almeno 15 s di lunghezza senza annusare e toelettare. Prendere misure di temperatura corporea ogni 10 min quando si utilizza un dispositivo impiantabile.
4. Alla fine dell'esperimento, rimuovere il mouse dalla camera e rimetterlo nella sua gabbia. Tutte le attrezzature devono essere pulite e spazzate via accuratamente. Se rimangono goccioline d'acqua, utilizzare l'aria pressurizzata per rimuoverle.

5. Analisi del modello di respirazione e metabolismo

1. Aprire il file di revisione della plitismo barometrica e consultare le note registrate per l'animale di interesse.
2. Aprire il pannello Metabolico nel software e prendere la media dei primi 10 min di O₂ e CO₂, quando la camera era vuota. Registrare questi valori come FiO₂ e FiCO₂.
3. Visualizzare il pannello Flusso del software di pletismografia barometrica. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Analizza attributi e impostare i parametri appropriati. Nella scheda Meta 1, inserire FiO₂ e FiCO₂ del passaggio 5.2, nonché il flusso nella camera sotto Meta 2, per calcolare VO₂ e VCO₂.
4. Per il modello di analisi della respirazione, confermare i tempi per i 15 secondi di respirazione tranquilla utilizzando note sul comportamento animale e il tracciato del pannello di flusso. Immettere gli orari per gli intervalli di 15 s di respirazione Parser View Mode silenziosa in Open Data Parser Dialogue dalla scheda Data Parser.
5. Fare clic su Salva dati derivati analizzati. Aprire il file di dati in un foglio di calcolo per ottenere i dati collocati.

6. Analisi di Apnee e Respiri Aumentati

1. Nel file di revisione aperto, uscire dalla modalitàdi visualizzazione del parser . Passare all'opzione Impostazione grafico in Impostazione > Impostazione P3 e selezionare Vista pagina in Tipo. Selezionare 5 per il numero di riquadri. Immettere -2 nella casella Bassa e 2 nella casella Alta per le misure di flusso in millilitri/secondo. Applicare le modifiche.
2. Scorrere fino al contrassegno di 30 minuti nel pannello di tracciamento del flusso.
3. Contare apnee e respiri aumentati per i 30-60 min dopo che il topo è stato posto nella camera. Quantificare i periodi di respirazione sospesa che durano più a lungo o uguale a 0,5 s, indicativo di un'apnea. I respiri aumentati sono indicati da un forte aumento della traccia respiratoria superiore a 1,25 mL/s, seguito da una forte diminuzione al di sotto di -0,75 mL/s.

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Risultati

I risultati di UBP come valutazione del modello di respirazione in topi di età compresa tra 16 (22 mesi) eseguiti con gas d'aria normale (20,93% O₂ con bilanciato N₂₎sono riportati. L'analisi ha incluso un confronto tra un segmento di respirazione silenziosa di 10 minuti più lungo (che ha richiesto più di 2 h per ottenere) rispetto alla media di quattro brevi segmenti di 15 s (quantificati in pochi minuti 60–120). Nella Figura 1Aè riportato un flu...

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Discussione

Il protocollo fornisce informazioni riguardanti una linea di base di respirazione silenziosa nei topi, oltre a raccogliere dati sulle apnee centrali e sui respiri aumentati. I risultati rappresentativi mostrano che una linea di base tranquilla di 10 min ha un modello di respirazione simile rispetto a una media di quattro s bouts per una coorte di vecchi topi. È importante sottolineare che gli out 15 s non sono statisticamente diversi, né questi gruppi hanno differenze di variazione l'uno dall'altro utilizzando il test ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon Dioxide Analyzer	AEI Technologies	CD-3A
Carbon Dioxide Sensor	AEI Technologies	P-61B
Computer			must be compliant with Ponemah requirements
Drierite beads	PermaPure LLC	DM-AR
Flow Control	AEI Technologies	R-1	vacuum
Flowmeter	TSI	4100	need one per chamber and one for vacuum
Gas Mixer	MCQ Instruments	GB-103
Gas Tanks	Haun		100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen Analyzer	AEI Technologies	S-3A
Oxygen Sensor	AEI Technologies	N-22M
Polyurethane Tubing	SMC	TUS 0604 Y-20
Ponemah Software	DSI
Small Rodent Chamber	Buxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)	Destron-Fearing		any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber
Transducers	Validyne	DP45	need one per chamber
Whole Body Plethysmography System	Data Science International (DSI)		Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc.