استخدام "واحد جزيء فلوري في الموقع التهجين" (SM-الأسماك) إلى مرناس Quantify و Localize في "بويضات مورين"

Summary

لعد تكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، صف واحد جزيء الحمض النووي الريبي في الموقع الأمثل التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) للخلايا غير ملتصقة. بويضات جمعت وتهجين مع تحقيقات محددة نسخة، وكمياً باستخدام برنامج تقدير حجم صورة.

Abstract

وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل روتيني لتقدير مرناً في بويضات والأجنة الرقمي النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (دبكر) والكمية، في الوقت الحقيقي RT-PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي. عندما يتم تنفيذ هذه التقنيات باستخدام واحدة من البويضات أو الأجنة، لا يتم كشف مرناس منخفضة-نسخة موثوق بها. للتغلب على هذه المشكلة، بويضات أو أجنة يمكن أن تجمع معا للتحليل؛ ومع ذلك، وهذا غالباً ما يؤدي إلى تباين عال بين العينات. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام الفلورية في الموقع التهجين (الأسماك) استخدام تشعبت كيمياء الحمض النووي. ويحدد هذا الأسلوب النمط المكاني مرناس في الخلايا الفردية. عندما يقترن التقنية "العثور على الفور" وتتبع برامج الكمبيوتر، يمكن أيضا قياس وفرة مرناس في الخلية. باستخدام هذا الأسلوب، وهناك انخفاض تقلب داخل مجموعة تجريبية وعدد أقل من بويضات والأجنة هي المطلوبة للكشف عن اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية. متوفرة تجارياً الحمض النووي تشعبت SM-مجموعات الأسماك قد تم الأمثل للكشف عن مرناس في مقطعة الأنسجة أو الخلايا ملتصقة على الشرائح. ومع ذلك، بويضات لا تلتزم بشكل فعال الشرائح وبعض الكواشف في المجموعة التي كانت قاسية جداً أدى إلى تفسخ البويضيه. لمنع هذا تحلل، تم إجراء تعديلات عدة لطقم السمك. على وجه التحديد، استبدال البويضيه مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي المصممة الفلورة بويضات والأجنة في مخازن الملكية. أجريت بيرميبيليزيشن ويغسل، وإينكوبيشنز مع تحقيقات ومكبر للصوت في لوحات 6-جيدا ووضعت بويضات على الشرائح في نهاية البروتوكول باستخدام وسائل الإعلام المتزايدة. وكانت هذه التعديلات قادرة على التغلب على القيود المفروضة على عدة متاحة تجارياً، على وجه الخصوص، تحلل البويضيه. بدقة، وتكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، تم استخدام برامج الكمبيوتر. معا، وهذا البروتوكول يمثل بديلاً لبكر وتسلسل مقارنة التعبير عن وقائع محددة في الخلايا المفردة.

Introduction

وقد عكس المنتسخة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) معيار الذهب كوانتيتاتيون مرناً. وتستخدم حاليا فحوصات اثنين والرقمية بكر (دبكر)¹ والوقت الحقيقي، والكمية بكر (qPCR)² . تقنيات PCR اثنين، قد دبكر حساسية أكبر من قبكر مما يوحي بأنه يمكن استخدامه لقياس وفرة مرناً في الخلايا المفردة. ومع ذلك، أنتج تحليل دبكر مرناس وفرة منخفضة في برك من 5 إلى 10 بويضات كل كل عينة تجريبية في أيدينا، البيانات مع إمكانية تكرار نتائج منخفضة وعالية التباين³. ومن المرجح نتيجة لخطأ التجريبية المرتبطة باستخراج الحمض النووي الريبي وكفاءة النسخ العكسي. تسلسل الحمض النووي الريبي قد أجريت باستخدام ماوس واحدة وبويضات بشرية^4،5. ويتطلب هذا الأسلوب كدنا التضخيم الخطوات المطلوبة لتوليد المكتبة مما يزيد من احتمال تقلب داخل مجموعة تجريبية. وعلاوة على ذلك، قد لا تكون النصوص وفرة منخفضة قابلة للاكتشاف. على الرغم من أن تسلسل الأسعار تراجعت في السنوات القليلة الماضية، لا يزال يمكن أن يكون تكلفة باهظة بسبب التكلفة العالية للتحليلات المعلوماتية. وأخيراً، مرناً الترجمة عملية دينامية مع التغيرات المكانية المساهمة في وظيفة البروتين⁶. ولذلك، نحن المبينة على اعتماد أسلوب التي ستنتج التدابير الكمية الدقيقة واستنساخه وتوطين مرناس الفردية في بويضات واحد.

تشعبت الحمض النووي بالإضافة إلى الأسفار في التهجين الموقعي تضخيم الإشارات fluorescence بدلاً من زيادة الحمض النووي الريبي/كدنا تمكين الكشف عن مرناس واحدة في الخلايا الفردية ^7،،من⁸⁹. الفحص يتم من خلال سلسلة من التهجين والتضخيم (باستخدام الحمض النووي تشعبت) والأسفار وسم خطوات من أجل تضخيم الإشارات fluorescence⁷. ويبدأ التقنية ملزمة أزواج مسبار اليغنوكليوتيد 18-25 قاعدة مكملة لمحددة مرناً^3،،من⁸¹⁰. أزواج التحقيق خمسة عشر إلى عشرين مصممة لخصوصية ضمان كل نسخة لنص الهدف. ويعقب التهجين مرناً على حدة تحقيقات ما قبل مكبر للصوت ومكبر للصوت التي تشكل تكويناً متفرع. تقريبا، ربط 400 التسمية fluorophores كل مكبر للصوت، أدى إلى زيادة 8000-fold في الأسفار يتيح الكشف عن مرناس الفردية (الشكل 1)¹¹.

رقم 1: التخطيطي البروتوكول SM-الأسماك- التهجين متسلسلة من محاضر جلسات التحقيق المحددة، تشعبت الحمض النووي مكبر للصوت وفلوروفوري إلى هدف يرد مرناً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

خلية الدراسات السابقة باستخدام جزيء واحد الأسفار في الموقع مرناس β-أكتين التهجين (SM-الأسماك) المترجمة في الخلايا العصبية الفردية¹² وفيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي في سرطان عنق الرحم خطوط⁷. برامج الكمبيوتر "العثور على الفور" و "تتبع البرنامج" يحدد إشارة الفلورسنت الشروريه الفردية وقد استخدمت بنجاح لتقدير عدد مرناس في كل خلية^3،13.

استناداً إلى نتائج الكشف مرناً في الخلايا العصبية¹²، افترضنا أن SM-الأسماك من شأنه أن يثبت أداة مفيدة كوانتيتاتي مستويات نسخة في بويضات مورين والأجنة بما في ذلك مرناس وفرة منخفضة. ومع ذلك، الأسلوب هو الأمثل للاستخدام مع خلايا ثابتة ملتصقة وفورمالدهايد ثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ أقسام الأنسجة (فب). لا يمكن أن تلتزم بويضات شريحة، حتى عندما كانوا المغلفة مع بولي-L-يسين. وعلاوة على ذلك، فأكثر هشاشة من خلايا جسدية وأقسام الأنسجة الناتجة في تحلل الخلية عند التعرض لبعض المخازن المؤقتة الملكية في مجموعات المتاحة تجارياً³. للتغلب على هذه التحديات، بويضات كانت ثابتة ونقلها يدوياً بين قطرات من المخازن المؤقتة. وعلاوة على ذلك، استعيض عن مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي في المجموعات لتقليل تحلل الخلية. المسابر المصممة مسبقاً يتم شراؤها جنبا إلى جنب مع مجموعة الأسماك أو يمكن أن يطلب إلى وقائع محددة. يتوفر كل مجموعة التحقيق الملكية في واحدة من ثلاث قنوات الفلورية (C1 و C2 و C3) للسماح بالإرسال المتعدد. في التجربة الحالية، كانت بويضات موريني المزدوج الملون وكمياً باستخدام مجس C2 نانوج وتحقيق C3 Pou5f1 . واختيرت هذه المسابر استناداً إلى التعبير عنها نانج و Pou5f1 في بويضات والأجنة. في ختام خطوات التهجين، وضعت بويضات في قطرات من تصاعد تتلاشى المضادة وسائل الإعلام لتطبيقها على الشرائح النسيجي. واستخدمت الصور [كنفوكل] للتحديد الكمي لعدد الإشارات الفلورسنت الشروريه التي تمثل مرناس الفردية. بالإضافة إلى تحديد كمية مرناس، كما أظهر تصوير التوزيع المكاني مرناً محددة في الخلية، يتم فيها أساليب القياس الكمي الحمض النووي الريبي أخرى غير قادر على تحقيق. وتبين هذه التقنية قد تقلب منخفض داخل مجموعة تجريبية تسمح باستخدام عدد أقل من بويضات في كل مجموعة تجريبية لتحديد وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية³.

Protocol

إجراءات الحيوان تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة نبراسكا-لينكولن وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة. لهذه الدراسة، أووتبريد مؤتمر نزع السلاح-1 الفئران كانت متواصلة للوصول إلى تشو القوارض العادية والمياه؛ أنها استمرت في 12:12 الظلام: الضوء على دورة.

1-إعداد الوسائط المطلوبة

1. قاعدة الوسائط (OMM)، إضافة 100 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 0.5 مم خ₂ص₄، ومم 1.7 كاكل₂-2 ح₂س إلى 100 مل من الماء المعقم.
   ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة أم لمدة تصل إلى شهر واحد.
2. للإعلام (أوموبس)، كاملة وإضافة 20 مم 3-مورفولينوبروباني-1-سولفونيك حمض (والمماسح)، 1.2 مم مجسو₄-7 ح₂س، جلوكوز 0.5 مم، 6 مم L-لاكتات، علاء 1 مم-جلن، 0.1 مم التاورين، 1 x الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، مم 0.01 الإيثيلين (حمض يدتا)، حمض ألفا يبويتش ميكرومتر 10، 10 ميكروغرام/مل مخفف الجنتاميسين، 21 ملم م 1 هيدروكسيد الصوديوم، 5 مم NaHCO₃، 0.2 مم بيروفات، 0.5 مم سترات، جيش صرب البوسنة 4 مغ/مل الفاف 01:10 إضعاف أم في الماء المعقم لإجمالي حجم 100 مل. تعقيم في المتوسط مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
   ملاحظة: يمكن تخزين أوموبس لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. للمتوسط القابضة (جلالة) إضافة 5% مصل بقرى الجنين إلى أوموبس. جعل 2 مل جلالة الملكة في الماوس.
4. للبروتين السكري المثبط الحل إضافة 0.1 مغ/مل من البروتين السكري المثبط المستمدة من الأبقار الخصيتين، إلى 1 مل صاحبة الجلالة.
5. بالنسبة للمخزن المؤقت التثبيت دمج بارافورمالدهيد 4 ٪ في 10 مل من 1 x PBS جنبا إلى جنب مع 0.1% الجنين الصف بوفيدون (حماية الأصناف النباتية)¹⁴.
6. إضافة إلى إعداد 50 مل أغسل المخزن المؤقت (البنك الدولي)، الفاعل غير الأيونية 0.1% و 0.1% حماية الأصناف النباتية إلى 1 ×¹⁴من برنامج تلفزيوني.
7. لإعداد 10 مل بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت، إضافة 1% غير الأيونية الفاعل ل برنامج تلفزيوني 1 x¹⁴.
   ملاحظة: استبدال مخازن المياه والصرف الصحي و permeabilization الموصوفة أعلاه في مخازن الملكية في مجموعات المتاحة تجارياً.

2-جمع بويضات أوفولاتيد من الفئران الإناث

1. إعداد:
   1. حفز الفئران الإناث في 5-8 أسابيع عمر عن طريق الحقن (الملكية الفكرية) داخل تروج 5 وحدات دولية المشيمة الخيلي (eCG) تليها 5 وحدات دولية تروج المشيمية البشرية (hCG) ح 44-48 بعد^15،16.
   2. تبقى تحتوي على أطباق بتري 35 مم 2 مل من جلالة الملكة على طبق الاحترار 37 درجة مئوية. "الماصة؛" واحدة، قطره 100 ميليلتر من جلالة الملكة التي تحتوي على البروتين السكري المثبط المخفف تليها ثلاثة، قطرات 50 ميليلتر من جلالة دون البروتين السكري المثبط في طبق بتري 60 ملم. وضع لوحات لوحة قطرات تحتوي على 37 درجة مئوية درجة حرارة الأرض قبل الاستخدام.
      ملاحظة: ينبغي قطرات البروتين السكري المثبط فقط قبل التشريح لكل زوج قناة لمنع التبخر وتركيز العناصر لجلالة الملكة مع أو بدون البروتين السكري المثبط.
2. Euthanize الفئران، ح 16 بعد حقن IP من قوات حرس السواحل الهايتية، واستخدام جرعة isoflurane متبوعاً بخلع عنق الرحم.
3. قم بتنظيف الماوس باستخدام الإيثانول 70%. كشف تجويف البطن ووضع تصور للأنثى التناسلي. عقد المبيض مع الملقط وإزالة الأربطة الرحم والأنسجة الدهنية الزائدة من حول المبيض. قطع قناة من الرحم وقناة المبيض الزوج في HM الحارة في الطبق 35 ملم.
4. إزالة المبيض وأي الأنسجة الدهنية المحيطة بها. المسيل للدموع ampulla منتفخة من قناة استخدام إبرة 27-مقياس نصف بوصة. دفع قناة في موقع المسيل للدموع، وسوف يطرد مجمعات الخلايا البويضيه cumulus (COCs). نقل بويضات أوفولاتيد، التي يفترض أن تكون في الطورية الثاني (MII) الانقسام الاختزالي، بانخفاض 100 ميكروليتر التي تحتوي على وسائط الإعلام جلالة مع البروتين السكري المثبط استخدام ماصة فم (الشكل 2).

الشكل 2 : أجزاء من بيبيتور الفم تستخدم لنقل بويضات. (أ) قطعة الفم (ب) 0.22 أم، 4 مم (ج) المضخة الأنابيب (د) 1000 ميكروليتر بيبيت الفلتر (ﻫ) بيبيت باستور 9 ". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5. "الماصة؛" مجمعات الخلايا البويضيه الركام الذااره صعودا وهبوطاً في البروتين السكري المثبط المحتوية على جلالة السلطان مع ماصة الفم لإزاحة الخلايا الركام. نقل كل البويضات، حين تكون خالية من الخلايا الركام ليغسل إسقاط جلالة الملكة التي تحتوي على فقط باستخدام ماصة الفم. كرر هذه العملية لكل قطره من المياه والصرف الصحي. لا يتم نقل¹⁵من بويضات مجزأة أو شفافة.
   ملاحظة: من المهم لنقل بويضات من كل قطره في الطبق 35 مم مع كجلالة صغيرة قدر الإمكان. وهذا صحيح بالنسبة لكل عملية نقل في البروتوكول. لا يجب أن تظل بويضات صناعة المعلومات في البروتين السكري المثبط تتضمن المتوسطة HM لأكثر من دقيقة واحدة.

3-SM الأسماك تلطيخ من بويضات

1. إصلاح بويضات في بئر فردية من لوحة 6-كذلك يتضمن 500 ميليلتر من "المخزن المؤقت للتثبيت". غمر بويضات 20 أو أقل في البئر. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: كل خطوة المصبوغة SM-السمك يحدث داخل بئر فردية في صفيحة مخروطية 6-جيدا. التأكد من وجود بويضات مغمورة تماما في المخازن المؤقتة ولا عائمة فوق المخزن المؤقت. يجب أن تكون كل خطوة المؤداة مع بويضات 20 أو أقل في كل بئر.
2. نقل بويضات الثابتة إلى 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (البنك الدولي هو موضح في الخطوة 1، 6) لمدة 10 دقائق. كرر 2 مرات أكثر.
3. احتضان بويضات في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يستبدل permeabilization المخزن المؤقت هو موضح في الخطوة 1، 7 المخزن المؤقت permeabilization الملاءمة.
   1. جمع مجموعات التحقيق وتدور بسرعة منهم إلى أسفل في ميكروسينتريفوجي. الحارة المسبار كل تعيين لمدة 10 دقائق في حمام الماء 40 درجة مئوية أو حاضنة. باردة لدرجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة أثناء حضانة بيرميبيليزيشن
4. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. نقل بويضات إلى 80 ميكروليتر من "المخزن الثالث مبطلات" (متاح من kit)، الذي هو المخفف 1:8 في برنامج تلفزيوني X 1، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: حجم ميليلتر 80 كاف يغطي الجزء السفلي من بئر منفردة في لوحة 6-جيدا.
6. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. تمييع مجموعات مسبار حرارة نانج، Pou5f1، و دابب (جين مراقبة سلبية)، 01:50 في التحقيق مخفف. احتضان بويضات في 80 ميكروليتر من التحقيقات الخاصة بنسخة لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية.
   ملاحظة: يتوفر كل مجموعة التحقيق الملكية في واحدة من ثلاث قنوات الفلورية (C1 و C2 و C3). كانت المعلمة المسابير نانج و Pou5f1 مع C2 و C3، على التوالي.
8. الحارة الملكية، 1 مكبر للصوت (1 أمبير)، مكبر للصوت 2 (AMP2)، 3 (AMP3) من مكبر للصوت ومكبر للصوت 4-الأسفار (أمبير 4-فلوريدا) في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة أثناء الاحتضان 2 ساعة خاصة بمحضر التحقيق.
9. نقل بويضات إلى 500 ميكروليتر من البنك الدولي، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. احتضان بويضات التتابع في المخازن المؤقتة للتضخيم.
    1. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من AMP1 مدة 30 دقيقة في 40° C. نقل بويضات إلى 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من AMP2 لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. نقل بويضات إلى 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من AMP3 لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. نقل بويضات إلى 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
       ملاحظة: يتم تنفيذ ما تبقى البروتوكول في الظلام لامبير-فلوريدا يحتوي فلوروفوري. عندما تعمل تحت مجهر تشريح، تقليل الضوء قدر الإمكان.
    4. إضافة بويضات إلى 80 ميكروليتر من فلوريدا AMP4 لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
       ملاحظة: يتوفر كبديل فلوريدا AMP4 المخزن المؤقت-أ (Alt-أ)، ب Alt أو Alt-جيم. حدد فلوريدا AMP4 المخزن المؤقت تعتمد على الانبعاثات الطول الموجي هو المطلوب.
11. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من DAPI لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
12. "الماصة؛" 12 ميليلتر لوسائل الإعلام يتلاشى لمكافحة تصاعد في وسط الشريحة دون إضافة فقاعات للكاشف. نقل بويضات مع البنك الدولي صغيرة قدر الإمكان في وسائل الإعلام المتزايدة وتطبيق ساترة.
    1. إمالة ساترة في زاوية ومكان ببطء لطف عبر السائل على الشريحة. تجنب الضغط ساترة من الصعب جداً لمنع التشويه من بويضات ومقدمة من الفقاعات.
    2. تخزين الشرائح في مربع الظلام للمبيت جاف في درجة حرارة الغرفة. معطف حواف الشرائح في طلاء الأظافر واضحة لختم ساترة.
13. استخدام مجهر قياسية للبحث عن بويضات على الشريحة والدائرة مع علامة دائمة.
    ملاحظة: هذه الخطوة غير مطلوبة، لكن يحسن بويضات تحديد موقع على الشريحة. للحصول على أفضل النتائج، سوف تبدأ شرائح الصورة 1 إلى 5 أيام كإشارة الفلورسنت تتلاشى.

4. معالجة الصورة

1. صورة بويضات ثلاثي الأبعاد، باستخدام z خطوة الفحص المجهري [كنفوكل].
   ملاحظة: لدقة تحليل الصور، يجب أن تكون كل خطوة ض 1.0 ميكرومتر/شريحة.
2. حفظ الصور [كنفوكل] nd2 مضغوطة أو الفردية. ملفات TIFF لكل البويضات. كل أنواع الصور متوافقة مع برنامج معالجة الصورة المصدر المفتوح، فيجي.
3. تنزيل وتثبيت البرنامج فيجي الوصول المفتوح (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   1. اسحب الملفات nd2 في فيجي واختر هايبرستاك. إذا تم حفظ الصور [كنفوكل]. ملفات TIFF قم بالتخطي إلى الخطوة 4، 4.
      ملاحظة: عندما يتم إسقاط الملف nd2 في فيجي القائمة المنسدلة هايبرستاك يجب أن تظهر تلقائياً.
   2. انقر فوق علامة التبويب صورة ، حدد اللون، وانقر فوق تقسيم القنوات لفصل القنوات الفلورسنت من الملف nd2.
   3. توليد الفردية. ملفات TIFF لكل شريحة ض من البويضات في كل قناة الفلورسنت. انقر فوق علامة التبويب صورة وحدد مكدساتانقر فوق مكدس للصور. انقر فوق علامة التبويب صورة ، حدد نوع، وانقر فوق لون RGB لتحويل كل شريحة z إلى صورة لون RGB فردية.
      ملاحظة: لون RGB مصطنع ويمكن أن يكون تم اختيارها كالمطلوب لكل طول موجي الانبعاثات.
   4. حفظ كل صورة تم تحويلها. ملف TIFF. ضع الصور من البويضيه واحد لكل قناة الفلورسنت في مجلد جديد لتجنب الارتباك أثناء خياطة (الخطوة 4، 3).
4. تطبيع كل منهما. صورة TIFF Pou5f1 و نانج استخدام الصور السلبية التحكم (دابب).
   ملاحظة: يتم التطبيع باستخدام برنامج تحرير صور. تأكد من إزالة نفس مستويات الخلفية الفلورية من كل عنصر تحكم الصورة.
5. فتح كل تطبيع. ملف TIFF في فيجي لغرزة معا جميع z-شرائح لكل البويضات في كل طول موجي.
   1. انقر فوق علامة التبويب ملحقات ، حدد ستيتشينج، وانقر فوق الشبكة/جمع (الشكل 3A). حدد صور متسلسلة من القائمة المنسدلة و انقر فوق موافق (الشكل 3B).
   2. استعراض الدليل وحدد المجلد الذي يحتوي على جميع الصور z-شرائح البويضيه فردية في طول موجي واحد (راجع الخطوة 4.3.4). انقر فوق "موافق".
   3. حرك مربع التمرير في الجزء السفلي من الصورة مخيط في قناة اللون المناسب لطول الموجه المستخدمة وخلق صورة RGB مخيط النهائية بواسطة النقر فوق الصورة، وتحديد نوع، وانقر فوق لون RGB.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه الصورة للأسفار كوانتيتيشن هو موضح في الخطوة 4، 6 أدناه.
6. تحويل الصورة مخيط بالصورة المتوقعة الحد الأقصى 32-بت. انقر فوق الصورة، حدد نوع، وانقر فوق 32 بت (الشكل 3). حفظ هذه الصورة الجديدة. ملف TIFF.

الشكل 3 : خياطة معا الصور [كنفوكل] ض سلسلة من بويضات. (أ) لقطة شاشة عرض أداة جمع "المكونات في" الشبكة في فيجي الذي تم استخدامه لإنتاج الصور المركبة للبويضات. (ب) يستخدم "صور متسلسلة" fluorescence التداخل بين متسلسلة. ملفات TIFF لتوليد صورة مركبة. (ج) تم حفظ صورة مركبة 32-بت. ملف TIFF. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

7. تنزيل وتثبيت العثور على الفور وتتبع البرنامج¹³، الذي يتوفر من موقع د. لارسون، محقق في المعاهد من معهد الصحة الوطني الوطني السرطان (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). تنزيل وتثبيت الجهاز الظاهري الوصول المفتوح لنظام التشغيل واللغة (IDL) البيانات التفاعلية التي مطلوب لتشغيل العثور على الفور وتتبع البرنامج (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
8. قم بفتح الصورة 32-بت، مخيط، والتي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 6 (الشكل 4 أ)، في العثور على الفور وتتبع البرنامج. حدد Localize القائمة المنسدلة ثم انقر فوق Localize (الشكل 4 باء)، التي تقوم بحساب عدد البقع الموجودة في الصورة.
   ملاحظة: كل بقعة عد يمثل مرناً فردية. يتم عرض إعدادات عتبة تمرير وفوتون الفرقة في الصورة (الشكل 4 باء). لهذا البروتوكول، تم استخدام الإعداد الافتراضي لكل إعداد عتبة. ويرد الممثل إيجابية والبقع الخلفية (الشكل 4).

الشكل 4 : التحديد الكمي مرناس استخدام "مكتشف البقعة" وتتبع. (أ) الصور الفردية ض سلسلة مخيط معا كما هو موضح في الشكل 3 وحفظها كحد أقصى 32 بت المتوقعة. ملف TIFF. (ب) فتح الصورة المركبة في الباحث عن بقعة وتتبع. تعريب استخدمت لحساب عدد البقع الفلورسنت (المربع الأحمر). يتم الإشارة إلى عتبة النجاح وفوتون الفرقة بالمربع الأزرق. (ج) السهم الأزرق يشير إلى إشارة إيجابية (العتبة). السهم الأبيض يظهر الفلورسنت بقعة تحت العتبة و، ولذلك لا تحسب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

النتائج

عند انتهاء البروتوكول، وسوف تكون النتيجة صور منفردة من سلسلة z [كنفوكل] (4A الشكل و الشكل 5)، مخيط الصور (الشكل 4)، وتحسب مرناً (الشكل 4)- عندما يتم إجراء الإرسال المتعدد، سيكون هناك أ?...

Discussion

سوف تضمن سلسلة من الخطوات البسيطة خلال البروتوكول fluorescence ناجحة ودقيقة تهم مرناس. أولاً، يجب إجراء البروتوكول فورا بعد جمع والتثبيت لبويضات. لاحظ أن تتم إضافة حماية الأصناف النباتية إلى المخزن المؤقت التثبيت بارافورمالدهيد 4% لمنع بويضات من الالتصاق ببعضها البعض. وجدنا أنه من الضروري إجرا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-α-Lipoic acid	Sigma-Aldrich	T1395	Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid	MP Biomedicals, LLC	199899	FAF BSA
BD 10mL TB Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659	10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Company	305109	27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	CaCl2-2H2O
Citric acid	Sigma-Aldrich	C2404	Citrate
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Glucose
Disodium phosphate			Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish	Falcon Corning	351008	35 mm dish
Edetate Disodium	Avantor	8994-01	EDTA
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum	Atlanta biologicals	S10250	FBS
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15710-064	Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)	gibco	35050-061	Glutamax
Gold Seal Micro Slides	Gold Seal	3039	25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum	Sigma	G4877	eCG
hCG recombinant	NHPP	AFP8456A	hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes	Sigma-Aldrich	H3884	Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps	Integra	17-305X	Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid	MP Biomedicals, LLC	190228	L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773	MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids	Corning	25-025-Cl	NEAA
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-C	25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501891-C2	Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501611-C3	Pou5f1 Probe
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile	Millex-GP	SLGP033RS	0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P0930	PVP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60128	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	60218	KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent	invitrogen	P36934	Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI	Advanced Cell Diagnostics	320858	DAPI
RNAscope FL AMP 1	Advanced Cell Diagnostics	320852	Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2	Advanced Cell Diagnostics	320853	Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3	Advanced Cell Diagnostics	320854	Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A	Advanced Cell Diagnostics	320855	Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B	Advanced Cell Diagnostics	320856	Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C	Advanced Cell Diagnostics	320857	Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit	Advanced Cell Diagnostics	320851	FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe	Advanced Cell Diagnostics	320871	Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control	Advanced Cell Diagnostics	320881	Positive Control
RNAscope Probe Diluent	Advanced Cell Diagnostics	300041	Probe Diluent
RNAscope Protease III	Advanced Cell Diagnositics	322337	Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit	Advanced Cell Diagnostics	322340	FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV	Advanced Cell Diagnostics	322336	Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G	Component Supply Co.	NE-301PL-50	blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S6191	NaCl
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	306576	NaOH
Sodium pyruvate, >= 99%	Sigma-Aldrich	P5280	Pyruvate
Solution 6 Well Dish	Agtechinc	D18	6 well dish
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691	Taurine
Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002	60 mm dish
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Triton X-100