Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Riepilogo

Per riproducibile contare i numeri dei mRNAs in singoli ovociti, in situ di fluorescenza di singola molecola del RNA (RNA-pesce) l'ibridazione è stato ottimizzato per cellule non aderenti. Gli ovociti sono stati raccolti, ibridata con le sonde specifiche di trascrizione e quantificati tramite un software di quantificazione di immagine.

Abstract

Attuali metodi abitualmente utilizzati per quantificare il mRNA di ovociti ed embrioni includono reazione a catena della polimerasi d'inversione-trascrizione digitale (dPCR), quantitativa, Real-Time RT-PCR (RT-qPCR) e sequenziamento di RNA. Quando queste tecniche vengono eseguite utilizzando un singolo oocita o embrione, basso-copia mRNA non vengono rilevati in modo affidabile. Per ovviare a questo problema, gli ovociti o embrioni possono essere riuniti insieme per analisi; Tuttavia, questo porta spesso a un'elevata variabilità tra i campioni. In questo protocollo, descriviamo l'uso di ibridazione fluorescente in situ (FISH) utilizzando la chimica del DNA ramificato. Questa tecnica identifica il pattern spazio dei mRNAs in singole celle. Quando la tecnica è accoppiata con ricerca di Spot e software di monitoraggio computer, l'abbondanza del mRNA nella cellula anche può essere quantificato. Utilizzando questa tecnica, c'è ridotta variabilità all'interno di un gruppo sperimentale e un minor numero di ovociti ed embrioni sono necessarie per rilevare differenze significative tra i gruppi sperimentali. Commercialmente disponibile DNA ramificato SM-Kit di pesce sono stati ottimizzati per rilevare mRNAs in sezionato tessuti o cellule aderenti sulle diapositive. Tuttavia, gli ovociti non aderiscono in modo efficace alle diapositive e alcuni reagenti contenuti nel kit erano troppo duri con conseguente lisi degli ovociti. Per evitare questo Lisi, diverse modifiche sono state fatte per il kit di pesce. In particolare, il buffer di permeabilizzazione e lavaggio di ovocita progettato per l'immunofluorescenza di ovociti ed embrioni sostituito i buffer proprietari. La permeabilizzazione, lavaggi e le incubazioni con sonde e amplificatore sono state eseguite in piastre da 6 pozzetti e ovociti sono stati collocati sulle diapositive alla fine del protocollo utilizzando mezzi di montaggio. Queste modifiche sono state in grado di superare le limitazioni del kit disponibili in commercio, in particolare, la lisi dell'ovocita. Per accurato e riproducibile contare il numero dei mRNAs in singoli ovociti, software per computer è stato utilizzato. Insieme, questo protocollo rappresenta un'alternativa alla PCR e sequenziamento per confrontare l'espressione di specifici trascritti in singole cellule.

Introduzione

Reazione a catena d'inversione-transcriptase della polimerasi (PCR) è stato il gold standard per la quantificazione di mRNA. Due saggi, digitale PCR (dPCR)¹ e quantitativa in tempo reale PCR (qPCR)² sono attualmente utilizzati. Le due tecniche di PCR, dPCR ha una maggiore sensibilità rispetto qPCR suggerendo che potrebbe essere utilizzato per misurare l'abbondanza del mRNA in singole cellule. Tuttavia, nelle nostre mani, dPCR analisi dei mRNAs abbondanza bassa nelle piscine di ovociti di 5 a 10 per ogni campione sperimentale ha prodotto dati con scarsa riproducibilità e variazione alta³. Ciò è probabilmente dovuto l'errore sperimentale associata con estrazione del RNA e l'efficienza di trascrizione inversa. Sequenziamento di RNA è stata eseguita anche utilizzando un unico mouse e ovociti umani^4,5. Questa tecnica richiede passaggi di amplificazione del cDNA necessari per la generazione della libreria che probabilmente aumenta la variabilità all'interno di un gruppo sperimentale. Inoltre, trascrizioni di abbondanza bassa possono non essere rilevabile. Anche se i prezzi di sequenziamento sono scesi di ultimi anni, può ancora essere costi proibitivi a causa del costo elevato di analisi bioinformatica. Infine, la localizzazione di mRNA è un processo dinamico con cambiamenti spaziali contribuendo alla proteina funzione⁶. Pertanto, abbiamo deciso di adottare una tecnica che avrebbe prodotto accurate e riproducibile misure quantitative e localizzazione di singoli mRNA in singoli ovociti.

DNA ramificato accoppiato all'ibridazione fluorescente in situ amplifica il segnale di fluorescenza piuttosto che amplificazione RNA/cDNA abilitazione individuazione dei singoli mRNAs in singole celle ^7,8,9. Il dosaggio è effettuato attraverso una serie di ibridazione, amplificazione (usando il DNA ramificato) e fluorescenza etichettatura passi al fine di amplificare il segnale di fluorescenza⁷. La tecnica comincia con l'associazione di coppie di sonda di 18 - 25-base del oligonucleotide che sono complementari a un specifico mRNA^3,8,10. Quindici-venti coppie di sonda sono progettate per ogni specificità assicurando di trascrizione per la trascrizione di destinazione. L'ibridazione di specifici mRNA è seguita dalle sonde preamplificatore e amplificatore che formano una configurazione ramificata. Circa, 400 etichetta fluorofori associare a ciascun amplificatore, conseguente 8000-fold aumento in fluorescenza permettendo la rilevazione di singoli mRNA (Figura 1)¹¹.

Figura 1: schema del protocollo SM-pesce. Sequenza ibridazione della sonda specifica trascrizione, ramificata amplificatore DNA e fluoroforo ad un target di mRNA viene mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli studi precedenti usando la singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione (SM-pesce) localizzato β-actina mRNA in singoli neuroni¹² e papillomavirus umano DNA nel cancro cervicale delle cellule linee⁷. Il software per computer trovare posto e programma di controllo identifica singolo segnale fluorescente punctato ed è stato usato con successo per quantificare il numero dei mRNAs in ogni cella^3,13.

Sulla base dei risultati della rilevazione di mRNA in neuroni¹², abbiamo supposto che SM-pesce si sarebbe rivelato un utile strumento per quantificare i livelli di trascrizione in murini ovociti ed embrioni tra cui abbondanza bassa mRNAs. Tuttavia, la tecnica è ottimizzata per l'utilizzo con celle fisse aderenti e formaldeide fissata paraffina embedded sezioni di tessuto (FFPE). Gli ovociti non possono aderire a una diapositiva, anche quando essi sono rivestiti con poli-L-lisina. Inoltre, essi sono più fragili di cellule somatiche e sezioni di tessuto con conseguente lisi cellulare quando sottoposto ad alcuni dei buffer proprietarie in kit commercialmente disponibili³. Per superare queste sfide, ovociti erano fissi e trasferiti manualmente tra gocce dei buffer. Inoltre, la permeabilizzazione e wash buffer nei kit sono stati sostituiti per ridurre la lisi delle cellule. Sonde predefiniti vengono acquistati a fianco il kit di pesce o possono essere richiesti specifici trascritti. Ogni set di sonde proprietarie è disponibile in uno dei tre canali di fluorescenza (C1, C2 e C3) per consentire per multiplexing. Nell'esperimento attuale, ovociti murini sono stati doppia colorazione e quantificati mediante una sonda di C2 Nanog e una sonda di C3 Pou5f1 . Queste sonde sono state selezionate basato sull'espressione di Nanog e Pou5f1 segnalato di ovociti ed embrioni. A conclusione delle operazioni di ibridazione, gli ovociti sono stati collocati in gocce di mezzi di montaggio anti-dissolvenza per vetrini istologici dell'applicazione. Immagini confocal sono stati utilizzati per quantificare il numero di segnali fluorescenti punctati che rappresentano singoli mRNA. Oltre a quantificare i mRNAs, formazione immagine ha mostrato anche la distribuzione spaziale di specifici mRNA nella cellula, quali altri metodi di quantificazione di RNA sono in grado di raggiungere. Questa tecnica ha dimostrato di avere bassa variabilità all'interno di un gruppo sperimentale che consente di utilizzare numeri più piccoli degli ovociti in ogni gruppo sperimentale per identificare differenze significative tra i gruppi sperimentali³.

Protocollo

Procedure di animali sono stata esaminate e approvate dal comitato di impiego presso l'Università di Nebraska-Lincoln e istituzionali Animal Care e tutti i metodi sono stati effettuati conformemente alle norme e linee guida pertinenti. Per questo studio, CD-1 esogami topi ha avuto accesso ad libitum di chow roditore normale e acqua; sono stati mantenuti in un 12:12 scuri: ciclo di luce.

1. preparazione del supporto richiesto

1. Per i supporti di base (OMM), aggiungere 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH₂PO₄e 1,7 mM CaCl₂-2 H₂O a 100 mL di acqua sterile.
   Nota: Medio OMM possa essere memorizzato fino ad 1 mese.
2. Per i media completi (OMOPS), aggiungere 20 mM 3-morpholinopropane-1-solfonico acido (MOPS), 1,2 mM MgSO₄-7 H₂O, glucosio di 0,5 mM, 6 mM L-lattato, 1mm ala-gln, 0,1 mM della taurina, 1 x aminoacidi non essenziali (NEAA), (acido etilendiamminotetracetico di 0,01 mM EDTA), l'acido alfa lipoico 10 µM, gentamicina di 10 µ g/mL non diluito, 21 mM 1 M NaOH, 5mm NaHCO₃, 0,2 mM piruvato, 0,5 millimetri di citrato, FAF 4 mg/mL BSA per un 01:10 diluizione di OMM in acqua sterile per un volume totale di 100 mL. Sterilizzare il mezzo con un filtro da 0,22 µM.
   Nota: OMOPS possono essere memorizzati fino a 1 settimana.
3. Per il mezzo di supporto (HM) aggiungere 5% di siero fetale bovino OMOPS. Fare 2 mL HM per topo.
4. Per la soluzione di ialuronidasi aggiungere 0,1 mg/mL di ialuronidasi derivato dai testicoli bovini, a 1 mL HM.
5. Per il buffer di fissazione combinare paraformaldeide al 4% in 10 mL di 1X PBS con 0,1% embrione grado polivinilpirrolidone (PVP)¹⁴.
6. Per preparare 50 mL di tampone di lavaggio (WB), aggiungere 0,1% tensioattivi non ionici e 0.1% PVP a 1X PBS¹⁴.
7. Per preparare 10 mL di tampone di permeabilizzazione, aggiungere 1% tensioattivo non - ionico a 1X PBS¹⁴.
   Nota: I buffer di lavaggio e permeabilizzazione descritti sopra sostituiscono i buffer proprietari nei kit disponibile in commercio.

2. raccolta di ovociti ovulati da topi femmine

1. Preparazione:
   1. Stimolare i topi femmina a 5-8 settimane di età tramite l'iniezione intraperitoneale (IP) di 5 IU gonadotropina corionica equina (eCG) seguita da 5 UI gonadotropina corionica umana (hCG) 44-48 h successive^15,16.
   2. Mantenere il 35mm di Petri contenente 2 mL di HM su una piastra riscaldante a 37 ° C. Pipettare uno, goccia 100-µ l di HM contenente ialuronidasi diluito seguita da tre, gocce di 50 µ l di HM senza ialuronidasi in una capsula Petri 60 mm. Posizionare le piastre contenenti gocce sul 37 ° C riscaldamento piastra prima dell'uso.
      Nota: Le gocce di ialuronidasi devono essere effettuate appena prima la dissezione di ciascuna coppia di ovidotto per evitare l'evaporazione e concentrazione dei componenti del HM con o senza ialuronidasi.
2. Eutanasia di topi, 16 h dopo l'iniezione di IP di hCG, utilizzando isoflurano sovradosaggio seguita da dislocazione cervicale.
3. Pulire il mouse utilizzando etanolo al 70%. Esporre la cavità addominale e visualizzare il tratto riproduttivo femminile. Tenere l'ovaio con il forcipe e togliere i legamenti uterini e del tessuto adiposo in eccesso da intorno l'ovaia. Tagliare ovidotto dall'utero e la coppia di ovaia-ovidotto in HM caldo nel piatto di 35 mm.
4. Rimuovere l'ovaio e qualsiasi tessuto adiposo circostante. Tear ampulla gonfio dell'ovidotto utilizzando un ago calibro 27 ½ pollice. Spingere l'ovidotto presso il sito dello strappo e i complessi di celle-ovocita cumulus (COC) saranno espulsi. Trasferire gli ovociti ovulated, che si presumono essere in metafase II (MII) di meiosi, per il calo di 100 μL contenente supporto HM con ialuronidasi usando una pipetta di bocca (Figura 2).

Figura 2 : Parti del pipettatore bocca utilizzato per trasferire gli ovociti. (A) bocca pezzo (B) 0.22 um, 4 mm (C) aspiratore tubo (D) 1000 μL dispensare punta del filtro (E) 9" pipetta Pasteur. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Pipettare i complessi di cellula ovocita-cumulus MII su e giù nell'ialuronidasi contenente HM con la pipetta di bocca per sloggiare le cellule del cumulo. Trasferire ogni ovocita, una volta che essi sono privi di cellule del cumulo ad un lavaggio drop HM contenente solo usando la pipetta di bocca. Ripetere questa operazione per ogni goccia di lavaggio. Non trasferire gli ovociti frammentati o trasparente¹⁵.
   Nota: È importante trasferire gli ovociti da ogni goccia nel piatto 35 mm con come piccolo HM come possibile. Questo è vero per ogni trasferimento nel protocollo. Gli ovociti MII non devono rimanere nell'ialuronidasi contenenti HM mezzo per più di un minuto.

3. SM-pesce colorazione degli ovociti

1. Difficoltà ovociti in un singolo pozzo di una piastra a 6 pozzetti contenenti 500 µ l di tampone di fissazione. Immergere 20 ovociti o meno nel pozzo. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   Nota: Ogni passo colorazione SM-pesce si verifica all'interno di un singolo pozzo in un piatto conico 6 pozzetti. Garantire che gli ovociti sono completamente sommerse nei buffer e non galleggianti in cima il buffer. Ogni passaggio deve essere eseguita con 20 ovociti o meno in ciascun pozzetto.
2. Trasferire gli ovociti fissi a 500 μL di tampone di lavaggio (WB descritto al punto 1.6) per 10 minuti ciascuno. Ripetere 2 volte.
3. Incubare gli ovociti nel buffer di permeabilizzazione per 30 min a temperatura ambiente.
   Nota: Il buffer di permeabilizzazione descritto al punto 1.7 sostituisce il buffer di permeabilizzazione di correttezza.
   1. Raccogliere set di sonda e ruota velocemente verso il basso in una microcentrifuga. Riscaldare ogni sonda impostata per 10 min in un bagno d'acqua 40 ° C o in un incubatore. Raffreddare a temperatura ambiente.
      Nota: Questo passaggio deve essere eseguito durante l'incubazione di permeabilizzazione
4. Lavare gli ovociti in 500 µ l di WB per 10 min a temperatura ambiente.
5. Trasferire gli ovociti alle 80 μL di proteasi III Buffer (disponibile dal kit), che è diluito 1:8 in 1X PBS, per 30 min a temperatura ambiente.
   Nota: Il volume di 80 µ l copre adeguatamente il fondo di un pozzo individuo in una piastra a 6 pozzetti.
6. Lavare gli ovociti in 500 µ l di WB per 10 min a temperatura ambiente.
7. Diluire i set sonda riscaldata per Nanog, Pou5f1 e DapB (un gene di controllo negativo), 01:50 in diluente di sonda. Incubare gli ovociti in 80 μL della sonda trascrizione specifici per 2 ore a 40° C.
   Nota: Ogni set di sonde proprietarie è disponibile in uno dei tre canali di fluorescenza (C1, C2 e C3). Le sonde Nanog e Pou5f1 erano etichettate come C2 e C3, rispettivamente.
8. Scaldare la proprietaria, 1 amplificatore (AMP 1), amplificatore 2 (AMP2), amplificatore 3 (AMP3) e amplificatore 4-fluorescenza (AMP 4-FL) a temperatura ambiente.
   Nota: Questo passaggio deve essere eseguito durante l'incubazione di sonda di trascrizione-specific di 2 ore.
9. Trasferire gli ovociti a 500 μL di WB e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
10. Incubare gli ovociti in sequenza nei buffer di amplificazione.
    1. Incubare gli ovociti in 80 µ l di AMP1 per 30 min a ovociti di trasferimento di 40° c a 500 µ l di WB per 10 min a temperatura ambiente.
    2. Incubare gli ovociti in 80 µ l di AMP2 per 15 min a 40 ° C. Trasferire gli ovociti a 500 µ l di WB per 10 min a temperatura ambiente.
    3. Incubare gli ovociti in 80 µ l di AMP3 per 30 min a 40 ° C. Trasferire gli ovociti a 500 µ l di WB per 10 min a temperatura ambiente.
       Nota: Il resto del protocollo viene eseguito al buio perché AMP-FL contiene il fluoroforo. Quando si lavora sotto il microscopio per dissezione, ridurre quanto più possibile la luce.
    4. Aggiungere gli ovociti a 80 μL di AMP4-FL per 15 min a 40° C.
       Nota: AMP4-FL viene fornito come alternativa tampone-A (Alt-A), Alt-B o Alt-C. Selezionare il dipendente buffer AMP4-FL su quale emissione lunghezza d'onda è desiderato.
11. Lavare gli ovociti in 500 µ l di WB per 10 min a temperatura ambiente. Incubare gli ovociti in 80 µ l di DAPI per 20 min a temperatura ambiente. Lavare gli ovociti in 500 µ l di WB per 5 min a temperatura ambiente.
12. Pipettare 12 µ l di mezzi di montaggio anti-affievolimento al centro di una diapositiva senza aggiunta di bolle per il reagente. Trasferire gli ovociti con WB piccolo come possibile nel supporto di montaggio e di applicare un vetrino coprioggetti.
    1. Il coprioggetto ad un angolo di inclinazione e lentamente e delicatamente posto sopra il liquido sulla diapositiva. Evitare di premere troppo duro per evitare la distorsione del ovociti e introduzione di bolle il vetrino coprioggetti.
    2. Conservare i vetrini in una scatola scura per asciugare durante la notte a temperatura ambiente. Rivestire i bordi delle diapositive in smalto trasparente per sigillare il vetrino coprioggetti.
13. Utilizzare un microscopio standard per trovare ovociti sulla diapositiva e cerchio con un pennarello indelebile.
    Nota: Questo passaggio non è obbligatorio ma migliora posizionamento ovociti sulla diapositiva. Per risultati ottimali, diapositive di immagini all'interno di 1 a 5 giorni come il segnale fluorescente inizierà a svanire.

4. image Processing

1. Immagine 3-dimensionale ovociti, usando la microscopia confocal di z passo.
   Nota: Per analizzare con precisione le immagini, ogni passaggio di z deve essere 1,0 µm/fetta.
2. Salvare immagini confocal come un nd2 compresso o individuali. File TIFF per ogni ovocita. Entrambi i tipi di immagine sono compatibili con il programma di elaborazione di immagine di open source, Fiji.
3. Scaricare e installare il software di accesso aperto Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   1. Trascinare i file nd2 nelle Fiji e scegliere hyperstack. Se immagini confocal sono stati salvati come. I file TIFF e passare al punto 4.4.
      Nota: Quando il file nd2 è caduto in Fiji l'elenco a discesa hyperstack dovrebbe apparire automaticamente.
   2. Fare clic sulla scheda immagine , selezionare coloree fare clic su Canali Split per separare i canali fluorescenti del file nd2.
   3. Generare singoli. File TIFF per ogni fetta z dell'ovocita in ciascun canale fluorescente. Fare clic sulla scheda immagine , selezionare stacke fare clic su Stack di immagini. Fare clic sulla scheda immagine , selezionare tipoe fare clic su Colore RGB per convertire ogni fetta z in una singola immagine di colore RGB.
      Nota: Il colore RGB è artificiale e può essere scelto come desiderato per ogni lunghezza d'onda di emissione.
   4. Salvare ogni immagine convertita come. File TIFF. Inserire immagini da un singolo oocita per ogni canale fluorescente in una nuova cartella per evitare confusione durante la cucitura (punto 4.3).
4. Normalizzare ciascuno. Immagine TIFF per Pou5f1 e Nanog utilizzando immagini di controllo negativo (DapB).
   Nota: La normalizzazione viene eseguita utilizzando un programma di fotoritocco. Assicurarsi di rimuovere gli stessi livelli di fluorescenza di fondo da ogni immagine di controllo.
5. Aperto ogni normalizzato. File TIFF in Fiji per cucire insieme tutte le z-fette per ogni ovocita in ogni lunghezza d'onda.
   1. Fare clic sulla scheda plugin , selezionare impunturee fare clic su Griglia/raccolta (Figura 3A). Selezionare Immagini sequenziali dal menu a discesa e fare clic su OK (Figura 3B).
   2. Individuare la directory e selezionare la cartella contenente tutte le immagini di fetta z per un ovocita individuale ad una lunghezza d'onda (Vedi punto 4.3.4). Fare clic su OK.
   3. Spostare il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dell'immagine cucita sul canale di colore appropriato per la lunghezza d'onda utilizzata e creare l'immagine finale di cucito RGB facendo clic su immagine, selezionando il tipoe fare clic su Colore RGB.
      Nota: Questa immagine verrà essere utilizzata per la quantificazione di fluorescenza descritta al punto 4.6 qui sotto.
6. Convertire l'immagine cucita a 32-bit massima immagine proiettata. Fare clic su immagine, selezionare tipoe scegliere a 32-bit (Figura 3). Salva l'immagine come nuova. File TIFF.

Figura 3 : Cucendo insieme di immagini confocal z-serie di ovociti. (A) Screenshot che mostra lo strumento griglia/raccolta di plug-in Fiji che fu usato per produrre immagini composite dell'ovocita. (B) immagini sequenziali utilizza fluorescenza sovrapposizione tra sequenziale. File TIFF per generare un'immagine composita. (C) l'immagine composita è stato salvato come un 32-bit. File TIFF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Scaricare e installare la ricerca di Spot e programma di controllo¹³, che è disponibile sul sito Web per D.R. Larson, un ricercatore presso il National Institutes di salute National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Scaricare e installare la macchina virtuale di accesso aperto per il sistema operativo in lingua (IDL) interattiva dei dati che è necessario per eseguire la ricerca di Spot e programma di controllo (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
8. Aprire l'immagine a 32-bit, cucita, che è stato generato nel passaggio 4.6 (Figura 4A), nella ricerca di Spot e programma di controllo. Selezionare l' elenco a discesa Localize e scegliere Localize (Figura 4B), che consente di calcolare il numero macchie presenti nell'immagine.
   Nota: Ogni spot contato rappresenta un singolo mRNA. Le impostazioni di soglia band pass e fotone sono mostrate nella schermata (Figura 4B). Per questo protocollo, è stato utilizzato il valore predefinito per ogni impostazione di soglia. Rappresentante positivo e macchie di sfondo vengono visualizzate (Figura 4).

Figura 4 : Quantificazione del mRNA usando Spot Finder e Tracking. (A) immagini individuali z-serie sono stati cuciti insieme come descritto nella Figura 3 e salvati come un massimo di 32 bit proiettato. File TIFF. (B) immagine composita è stato aperto in Spot Finder e rilevamento. Localizzare è stato usato per contare le macchie fluorescenti (riquadro rosso). Soglia di banda pass e fotone sono indicati da blue box. (C) la freccia blu indica un segnale positivo (sopra soglia). La freccia bianca indica una fluorescente posto sotto la soglia e, pertanto, non conteggiati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

A completamento del protocollo, il risultato sarà singole immagini da confocale z-series (Figura 4A e Figura 5), immagini unite (Figura 4), e conta di mRNA (Figura 4B). Quando viene eseguita la multiplazione, ci sarà anche Unite immagini che mostrano l'etichetta per due differenti mRNA (Fig...

Discussione

Una serie di passaggi minore durante il protocollo garantirà successo fluorescenza e conteggi precisi dei mRNAs. In primo luogo, il protocollo deve essere eseguito immediatamente dopo la raccolta e la fissazione degli ovociti. Si noti che il PVP viene aggiunto nel buffer di fissazione del paraformaldeide al 4% per impedire che gli ovociti attaccare a vicenda. Abbiamo trovato che è necessario eseguire l'esperimento immediatamente dopo la raccolta e la fissazione degli ovociti. Qualsiasi ritardo si traduce in un segnale ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-α-Lipoic acid	Sigma-Aldrich	T1395	Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid	MP Biomedicals, LLC	199899	FAF BSA
BD 10mL TB Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659	10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Company	305109	27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	CaCl2-2H2O
Citric acid	Sigma-Aldrich	C2404	Citrate
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Glucose
Disodium phosphate			Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish	Falcon Corning	351008	35 mm dish
Edetate Disodium	Avantor	8994-01	EDTA
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum	Atlanta biologicals	S10250	FBS
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15710-064	Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)	gibco	35050-061	Glutamax
Gold Seal Micro Slides	Gold Seal	3039	25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum	Sigma	G4877	eCG
hCG recombinant	NHPP	AFP8456A	hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes	Sigma-Aldrich	H3884	Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps	Integra	17-305X	Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid	MP Biomedicals, LLC	190228	L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773	MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids	Corning	25-025-Cl	NEAA
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-C	25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501891-C2	Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501611-C3	Pou5f1 Probe
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile	Millex-GP	SLGP033RS	0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P0930	PVP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60128	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	60218	KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent	invitrogen	P36934	Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI	Advanced Cell Diagnostics	320858	DAPI
RNAscope FL AMP 1	Advanced Cell Diagnostics	320852	Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2	Advanced Cell Diagnostics	320853	Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3	Advanced Cell Diagnostics	320854	Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A	Advanced Cell Diagnostics	320855	Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B	Advanced Cell Diagnostics	320856	Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C	Advanced Cell Diagnostics	320857	Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit	Advanced Cell Diagnostics	320851	FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe	Advanced Cell Diagnostics	320871	Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control	Advanced Cell Diagnostics	320881	Positive Control
RNAscope Probe Diluent	Advanced Cell Diagnostics	300041	Probe Diluent
RNAscope Protease III	Advanced Cell Diagnositics	322337	Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit	Advanced Cell Diagnostics	322340	FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV	Advanced Cell Diagnostics	322336	Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G	Component Supply Co.	NE-301PL-50	blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S6191	NaCl
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	306576	NaOH
Sodium pyruvate, >= 99%	Sigma-Aldrich	P5280	Pyruvate
Solution 6 Well Dish	Agtechinc	D18	6 well dish
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691	Taurine
Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002	60 mm dish
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Triton X-100