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요약

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

초록

정기적으로 oocytes에서 배아 mRNA를 측정 하는 데 사용 하는 현재 방법 디지털 역 전사 연쇄 반응 (dPCR), 양적, 실시간 RT-PCR (RT-정량) 및 RNA 시퀀싱 포함 됩니다. 이러한 기술은 단일 oocyte 또는 배아를 사용 하 여 수행 됩니다, 낮은 복사 mRNAs 안정적으로 검색 되지 않습니다. 이 문제를 해결 하려면 oocytes 또는 배아 수 수 풀링된 함께 분석; 그러나,이 종종 샘플 중 높은 가변성에 이어집니다. 이 프로토콜에서 우리 형광 제자리 교 잡 (물고기) 분기 DNA 화학을 사용 하 여의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 개별 셀에서 mRNAs의 공간적 패턴을 식별합니다. 기술은 자리 찾아서 추적 컴퓨터 소프트웨어와 결합 되어 때 셀에서 mRNAs의 풍부도 측정할 수 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 실험적인 그룹에서 감소 변화 이며 적은 oocytes 및 배아 실험 그룹 간의 중요 한 차이 검출 해야. 상업적으로 사용 가능한 분기 DNA SM-물고기 키트 sectioned 조직 또는 슬라이드에 부착 세포 mRNAs를 검색에 최적화 되었습니다. 그러나, oocytes 효과적으로 슬라이드에 고착 하지 않는다 고 일부 시 약 키트에 oocyte 세포의 결과로 너무 가혹 했다. 이 세포의 용이 해를 방지 하기 위해, 물고기 키트 여러 수정 되었다. 특히, oocyte permeabilization 및 워시 버퍼를 oocytes와 태아의 면역 형광을 위한 독점 버퍼를 교체 했습니다. Permeabilization, 세척, 그리고 프로브와 앰프 외피 6 잘 플레이트에서 수행한 고 oocytes 슬라이드 설치 미디어를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 배치 했다. 이러한 수정 상용 키트, 특히, oocyte 세포의 한계를 극복할 수 있었다. 정확 하 게 그리고 reproducibly 개별 oocytes에서 mRNAs의 수를 계산, 컴퓨터 소프트웨어 사용 되었다. 함께,이 프로토콜 PCR 및 시퀀싱을 비교할 단일 셀에 특정 성적 표현 하는 대안을 나타냅니다.

서문

역전사 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) mRNA 정량에 대 한 황금 표준 되었습니다. 2 분석 실험, 디지털 PCR (dPCR)1 과 양적, 리얼 타임 PCR (정량)2 현재 사용 됩니다. 두 개의 PCR 기법, dPCR 그것은 단일 세포에서 mRNA 풍부를 측정 하는 데 사용할 수 제안 하는 정량 보다 더 큰 감도 있다. 그러나, 우리 손에 각 실험 샘플 당 5 ~ 10 oocytes의 수영장에서 낮은 풍부 mRNAs의 dPCR 분석은 생산 데이터 낮은 재현성 및 높은 변화3. 이 RNA 추출 및 반전 녹음 방송 효율성과 관련 된 실험적인 오류로 인해 높습니다. RNA 시퀀싱도 하나의 마우스와 인간의 oocytes4,5를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 기술은 가능성이 실험적인 그룹 내의 다양성을 증가 하는 라이브러리 생성에 필요한 cDNA 증폭 단계를 해야 합니다. 또한, 낮은 풍부 성적표 감지 하지 않을 수 있습니다. 시퀀싱 가격은 지난 몇 년 동안 추락, 비록 그것은 여전히 비용 생물 정보학 분석의 높은 비용 때문에 금지 수 있습니다. 마지막으로, mRNA 지역화 단백질 기능6에 기여 하는 공간 변경 동적 과정 이다. 따라서, 우리는 정확 하 고 재현 가능한 정량적 측정 및 단일 oocytes에서 개별 mRNAs의 지역화 생성 하는 기술 채택에 밖으로 설정.

분기 DNA 형광 제자리 교 잡에서에 결합 된 개별 셀 7,,89단일 mRNAs의 증폭 RNA/cDNA 활성화 탐지 보다는 형광 신호를 증폭 한다. 분석 결과 교 잡, 증폭 (분기 DNA를 사용 하 여), 및 형광 형광 신호7증폭 하기 위하여 단계를 라벨의 시리즈를 통해 수행 됩니다. 기술은 특정 mRNA3,,810를 보완 하는 18-25 베이스 oligonucleotide 조사 쌍의 바인딩으로 시작 합니다. 15 ~ 20 프로브 쌍 대상 성적에 대 한 각 사본 보장 특이성에 대 한 설계 되었습니다. MRNA 전용 하이브리드 프리 앰프 및 증폭기 프로브 분기 구성 구성 하 옵니다. 약, 400 라벨 fluorophores 개별 mRNAs (그림 1)11의 탐지를 허용 하는 형광에 8000-fold 증가 결과로 각 증폭기에 바인딩합니다.

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그림 1: SM 물고기 프로토콜의 도식. 대 본 특정 조사의 순차적 교 잡 DNA 증폭기 및 mRNA 표시 대상에 fluorophore 분기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

개별 뉴런12 에 인간 유 두 종 바이러스 DNA에 자 궁 경부 암 제자리 교 잡 (SM-물고기) 지역화 된 β-말라 mRNAs에 있는 단일 분자 형광을 사용 하 여 이전 연구 라인7세포. 자리 찾기는 컴퓨터 소프트웨어 및 추적 프로그램 개별 punctate 형광 신호를 식별 하 고 각 셀3,13mRNAs의 수 척도를 성공적으로 사용 되었습니다.

신경12mRNA 검색의 결과 바탕으로, 우리 SM 물고기 quantitate murine oocytes에서 배아 낮은 풍부 mRNAs를 포함 한 성적 수준에 유용한 도구를 증명할 것을 가정 했다. 그러나, 기술은 부착 고정된 셀과 함께 사용 하기 위해 최적화와 포름알데히드 파라핀 고정 임베디드 (FFPE) 조직 단면도. Oocytes 그들은 폴 리-L-리 신을 코팅 하는 경우에 슬라이드를 준수 수 없습니다. 또한, 그들은 체세포와 직물 단면도 세포 세포의 용 해 상용 키트3독점 버퍼의 일부를 받게 될 때의 결과 보다 더 약 합니다. 이러한 과제를 극복 하기 위해 oocytes는 고정 되었고 수동으로 버퍼의 방울 사이 전송. 또한, 키트에 permeabilization 및 워시 버퍼 세포 세포의 용 해를 감소 시키기 위하여 대체 되었다. 미리 디자인 된 프로브 물고기 키트와 함께 구입 또는 특정 성적 증명서를 요청할 수 있습니다. 각 독자적인 프로브 세트는 3 개의 형광 채널 (C1, C2, 및 C3) 다중화 허용 중 하나에. 현재 실험에 murine oocytes 듀얼 스테인드과 C2 Nanog 프로브와 C3 Pou5f1 프로브를 사용 하 여 계량 했다. 이 프로브 oocytes에서 배아 Nanog 와 Pou5f1 의 보고 된 식에 따라 선정 됐다. 교 잡 단계의 결론에 oocytes 조직학 슬라이드에 응용 프로그램에 대 한 방지 페이드 설치 미디어의 방울에 배치 했다. 공초점 이미지 개별 mRNAs를 대표 하는 punctate 형광 신호 수 계량에 사용 되었다. 영상 또한 셀에 특정 mRNA의 공간적 분포를 보였다는 mRNAs를 측정 이외에 다른 RNA 정량화 방법 달성할 수 없습니다. 이 기술은 실험 그룹3사이의 중요 한 차이점을 식별 하기 위해 각 실험 그룹에 oocytes의 작은 숫자의 사용을 허용 하는 실험적인 그룹 내에서 낮은 다양성을 입증 했다.

프로토콜

동물 절차 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 네브래스카 링컨의 대학에 의해 승인 했다 그리고 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 이 연구에 대 한 CD-1 outbred 쥐 정상적 설치류 차 우와 물; ad libitum 접근 했다 그들은 어두운 12시 12분에 유지 되었다: 빛을 주기.

1입니다. 필요한 미디어의 준비

  1. 기본 미디어 (OMM), 살 균 물 100 mL를 100 mM NaCl, KCl 5mm, 0.5 m m KH2포4및 1.7 m m CaCl2-2 H2O를 추가 합니다.
    참고: OMM 매체는 1 개월까지 저장할 수 있습니다.
  2. 완전 한 미디어 (OMOPS)에 대 한 추가 20 m m 3-morpholinopropane-1-sulfonic 산 (MOPS), 1.2 m m MgSO4-7 H2O, 포도 당 0.5 m m, 6mm L-젖 산, 1mm ala-gln, 황소자리, 0.1 m m 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 0.01 m m ethylenediaminetetraacetic 산 ( EDTA), 10 µ M 알파 리 포 산, 10 µ g/mL undiluted gentamicin, 21 m m 1 M NaOH, 5mm NaHCO3, 0.2 m m Pyruvate, 0.5 m m 구 연산, 1시 10분을 4 mg/mL FAF BSA OMM 100 mL의 전체 볼륨에 대 한 살 균 물에 희석. 0.22 μ M 필터 매체를 소독.
    참고: OMOPS 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.
  3. 보유 매체 (HM)에 대 한 OMOPS를 5% 태아 둔감 한 혈 청을 추가 합니다. 마우스 당 2 mL HM을 확인 합니다.
  4. Hyaluronidase 솔루션 1 ml 흠 소 고환에서 파생 된 hyaluronidase의 0.1 mg/mL를 추가 합니다.
  5. 고정 버퍼에 대 한 4% paraformaldehyde 0.1% 태아 학년 polyvinylpyrrolidone (PVP)14함께 1 x PBS의 10 ml에서을 결합 합니다.
  6. 50ml 워시 버퍼 (WB)를 준비 하려면 0.1% 비 이온 계면 활성 제 및 0.1% 추가 PBS14x 1로 PVP.
  7. 준비 10 mL permeabilization 버퍼에 1 x PBS141% 비 이온 계면 활성 제를 추가 합니다.
    참고: 위에서 설명한 세척 및 permeabilization 버퍼 상용 키트에서 독점 버퍼를 교체 합니다.

2. 여성 쥐에서 ovulated oocytes의 수집

  1. 준비:
    1. 나이의 5-8 주에 5 IU 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG) 5 IU 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 44-48 h 뒤의 복 (IP) 주입에 의해 자극 하는 여성 쥐 나중15,16.
    2. 35 mm 접시 포함 하는 37 ° C 온난 화 접시에 HM의 2 개 mL를 유지. 하나 플라스틱, 흠 있는 100 µ L 방울 희석 hyaluronidase 3, 60 mm 페 트리 접시에 hyaluronidase 없이 HM의 50 µ L 상품 이어서. 37 ° C 온난 화 포함 상품 사용 전에 접시는 접시를 놓습니다.
      참고: hyaluronidase 방울 여야 한다 각 수 란 관 쌍의 해 부 직전 증발 및 또는 hyaluronidase 없이 HM의 구성의 집중을 방지 하기 위해.
  2. 마우스, hCG의 IP 주사 후 16 h를 안락사, 자 궁 경부 전위 뒤 isoflurane 과량을 사용 하 여.
  3. 70% 에탄올을 사용 하 여 마우스를 청소 하십시오. 복 부 구멍을 노출 하 고 여성 생식 관을 시각화. 집게와 난소를 누른 자 궁 인 대 및 난소 주위에서 과잉 지방 조직을 제거 합니다. 자 궁에서 수 란 관 고 35 mm 접시에 따뜻한 HM에 난소 수 란 관 쌍을 놓습니다.
  4. 난소와 모든 주변의 지방 조직을 제거 합니다. ½ 인치 27 게이지 주사 바늘을 사용 하 여 수 란 관의 부 ampulla 눈물. 눈물의 사이트에는 수 란 관을 밀어 하 고 적 운 세포 oocyte 단지 (COCs) 퇴 학 될 것입니다. II (MII) HM 미디어 hyaluronidase 입 피 펫 (그림 2)를 사용 하 여 포함 하는 100 μ를 감수 분열의 분열에서 것으로 추정 되는 ovulated oocytes를 전송 합니다.

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그림 2 : Oocytes를 전송 하는 데 사용 하는 입 pipettor의 부분. (A) 입 음, (B) 0.22 조각 4 m m 필터 (C) 흡 인기 튜브 (D) 1000 μ 피펫으로 팁 (E) 9"파스퇴르 피펫으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 적 운 세포를 꺼내 려 입 피 펫과 HM를 포함 hyaluronidase에서 MII oocyte-적 운 세포 복합물을 아래로 플라스틱. 각 oocyte 전송, 일단 그들은 세척을 적 운 세포 없는 드롭 포함 HM만 입 피 펫을 사용 하 여. 각 세척 물방울에 대해 이것을 반복 합니다. 조각난 또는 투명 한 oocytes15를 전송 하지 않습니다.
    참고: 그것은 가능한 작은 흠으로 함께 35 mm 접시에 각 드롭에서는 oocytes를 전송 하는 것이 중요입니다. 이것은 모든 전송 프로토콜에 대 한 사실입니다. MII oocytes hyaluronidase HM 매체를 포함 하는 1 분 이상에 남아 있지 해야 합니다.

3. SM-물고기 Oocytes의 얼룩

  1. 고정 버퍼의 500 µ L을 포함 하는 6 잘 플레이트의 개별 잘에서 oocytes를 수정. 20 oocytes 잠수함 또는 우물에서 더 적은. 실 온에서 20 분 동안 품 어.
    참고: 각 SM 물고기 착 단계 6-잘 원뿔 접시에 개별 잘 내에서 발생합니다. Oocytes 버퍼에 완전히 침수 및 버퍼 위에 하지 부동 인지 확인 합니다. 각 단계는 20 oocytes 함께 이하의 각 잘에서 해야 합니다.
  2. 워시 버퍼 (WB 단계 1.6에서에서 설명)의 500 μ 하 고정된 oocytes를 전송 10 분. 2 번 더 반복 합니다.
  3. 실 온에서 30 분 동안 permeabilization 버퍼에 oocytes를 품 어.
    참고: 단계 1.7에서에서 설명한 permeabilization 버퍼 예 permeabilization 버퍼를 대체 합니다.
    1. 프로브 세트를 수집 하 고 신속 하 게는 microcentrifuge에서 그들을 아래로 회전. 각 프로브는 40 ° C 물 목욕 이나 인큐베이터에 10 분 동안 설정 따뜻한. 실내 온도에 냉각 하십시오.
      참고:이 단계는 permeabilization 외피 동안에 수행 해야
  4. 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어.
  5. 프로 테아 제 III 버퍼 (키트에서 사용 가능)를 실 온에서 30 분 동안 1 X PBS에 희석된 1: 8의 80 μ에 oocytes를 전송.
    참고: 80 µ L 볼륨 6 잘 플레이트에는 개별의 하단에 적절 하 게 다루고 있습니다.
  6. 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어.
  7. 따뜻하게 프로브 세트 Nanog, Pou5f1, 및 DapB (부정적인 제어 유전자)에 대 한 희석, 프로브 희석제에 1시 50분. 40 ° c.에서 2 시간 동안 대 본 특정 조사의 80 μ에 oocytes를 품 어
    참고: 각 독점 프로브 세트는 3 개의 형광 채널 (C1, C2, C3) 중 하나에. Nanog 및 Pou5f1 프로브 C2 및 C3, 각각 태그 했다.
  8. 독점, 앰프 1 (앰프 1), 증폭기 2 (AMP2), 증폭기 3 (AMP3)와 증폭기 4-형광 (앰프 4-플로리다) 실내 온도 따뜻하게.
    참고:이 단계는 2-시간 대 본 특정 조사 인큐베이션 기간 동안 수행 되어야 합니다.
  9. WB의 500 μ 하 여 oocytes를 전송 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
  10. 증폭 버퍼에 순차적으로 oocytes를 품 어.
    1. 80 µ L AMP1의 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 40 ° C. 전송 oocytes에서 30 분 동안에 oocytes를 품 어.
    2. 40 ° c.에서 15 분 동안 AMP2의 80 µ L에 oocytes를 품 어 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 전송.
    3. 40 ° c.에 30 분 동안 AMP3의 80 µ L에 oocytes를 품 어 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 전송.
      참고: 프로토콜의 나머지 부분에서에서 수행 됩니다 어둠 앰프-플로리다에 fluorophore를 포함 하기 때문에. 작업할 때 해 현미경, 빛을 최대한으로 줄일 수 있습니다.
    4. 40 ° c.에서 15 분의 AMP4 80 μ에 oocytes를 추가
      참고: AMP4 층 버퍼 A 대체로 제공 됩니다 (Alt-A), Alt-B 또는 Alt-C 파장은 원하는 어떤 방출에 따라 AMP4 층 버퍼를 선택 합니다.
  11. 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어. 80 µ L DAPI의 실 온에서 20 분 동안에 oocytes를 품 어. 실 온에서 5 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어.
  12. 시에 거품을 추가 하지 않고도 슬라이드의 중심에 안티-페이딩 설치 미디어의 12 µ L 플라스틱. 설치 미디어에 가능한 작은 WB로와 oocytes를 전송 하 고는 coverslip 적용.
    1. 기울기 각도에 coverslip와 천천히 그리고 부드럽게 슬라이드에 액체 위에 놓습니다. 너무 열심히 oocytes 그리고 거품의 소개의 왜곡을 방지 하는 coverslip 눌러 하지 마십시오.
    2. 실 온에서 건조 하룻밤 어두운 상자에 슬라이드를 저장 합니다. Coverslip 인감 투명 매니큐어의 슬라이드의 가장자리 코트.
  13. 표준 현미경을 사용 하 여 영구 표시와 함께 슬라이드에 동그라미 oocytes를 찾을.
    참고:이 단계는 필요 하지 않습니다 하지만 슬라이드 찾기 oocytes를 향상 시킵니다. 최상의 결과 얻으려면 이미지 슬라이드 형광 신호 1 ~ 5 일 이내 페이드 시작 됩니다.

4. 이미지 처리

  1. 3 차원 oocytes, z 단계 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지.
    참고: 이미지를 정확 하 게 분석 하려면 각 z 단계는 1.0 µ m/조각 이어야 한다.
  2. 압축된 nd2 또는 개별 confocal 이미지를 저장 합니다. 각 oocyte의 TIFF 파일입니다. 두 이미지 유형 오픈 소스 이미지 처리 프로그램, 피지와 호환 됩니다.
  3. 다운로드 및 오픈 액세스 피지 소프트웨어 (https://imagej.net/Fiji/Downloads)를 설치.
    1. 피지에 nd2 파일을 드래그 하 고 hyperstack을 선택 합니다. 만약 confocal 이미지로 저장 했다. TIFF 파일 4.4 단계로 건너뜁니다.
      참고: 피지에 nd2 파일은 삭제 하는 때 hyperstack 드롭다운 표시 됩니다 자동으로.
    2. 이미지 탭을 클릭 하 고 색상을 선택한 분할 채널 nd2 파일의 형광 채널 분리를 클릭 합니다.
    3. 개별 생성 합니다. 각 z 슬라이스 각 형광 채널에서 oocyte의에 대 한 TIFF 파일. 이미지 탭을 클릭 하 고 선택한 스택, 이미지 스택을클릭 합니다. 이미지 탭을 클릭 하 고 선택한 형식, 각 z 슬라이스 개별 RGB 컬러 이미지를 변환 하려면 RGB 색상 을 클릭 합니다.
      참고: RGB 색상 인공 이며 각 방출 파장에 대 한 선택으로 원하는 될 수 있습니다.
    4. 각 변환 된 이미지를 저장 합니다. TIFF 파일입니다. 단계 바느질 (4.3) 혼동을 피하기 위해 새 폴더에 각 형광 채널에 대 한 단일 oocyte에서 이미지를 배치 합니다.
  4. 각 정규화. Pou5f1 및 Nanog 부정적인 제어 이미지 (DapB)를 사용 하 여 TIFF 이미지.
    참고: 정규화는 사진 편집 프로그램을 사용 하 여 수행 됩니다. 각 컨트롤 이미지에서 배경 형광의 동일한 수준을 제거 되었는지 확인 합니다.
  5. 각 정규화 오픈. 함께 각 oocyte 각 파장에 대 한 모든 z 슬라이스를 피지에 TIFF 파일.
    1. 플러그인 탭을 클릭 하 고 선택한 바느질, 그리드/컬렉션 (그림 3A) 클릭. 드롭 다운 메뉴에서 확인을 클릭 합니다 (그림 3B) 순차적인 이미지 를 선택 합니다.
    2. 디렉터리를 검색 하 고 포함 하는 하나의 파장에서 개별 oocyte의 z 슬라이스 이미지의 모든 폴더를 선택 (단계 4.3.4 참조). 확인을 클릭 합니다.
    3. 사용 파장에 대 한 적절 한 색상 채널에 맞춘된 이미지의 하단에서 슬라이더를 이동 하 고 최종 RGB 맞춘된 이미지 이미지, 종류, 선택을 클릭 하 여 만들고 RGB 색상을 클릭 합니다.
      참고:이 이미지는 4.6 아래 단계에서 설명 하는 형광 정량에 사용 됩니다.
  6. 32 비트 최대 예상된 그림에 맞춘된 이미지를 변환 합니다. 이미지를 클릭, 종류, 선택 하 고 32 비트 (그림 3C)을 클릭 합니다. 새로운로이 이미지를 저장 합니다. TIFF 파일입니다.

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그림 3 : 함께 oocytes의 confocal z-시리즈 이미지의 바느질. (A) 는 oocyte의 합성 이미지를 생산 하는 데 사용 된 피지에 플러그 인 그리드/컬렉션 도구를 보여주는 스크린샷. (B) 연속 이미지 형광 겹치는 순차를 사용합니다. 합성 이미지를 생성 하기 위해 TIFF 파일입니다. (C) 복합 이미지 32 비트로 저장 되었습니다. TIFF 파일입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 다운로드 및 설치는 자리 찾기 및 추적 프로그램13, 라 슨 박사, 국립 연구소의 건강 국립 암 연구소 (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson)에 수 사관에 대 한 웹 사이트에서 사용할 수 있는. 다운로드 및 설치는 자리 찾기 및 추적 프로그램 (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf)를 실행 하는 데 필요한 대화형 데이터 언어 (IDL) 운영 체제에 대 한 오픈 액세스 가상 컴퓨터.
  2. 자리 찾기 및 추적 프로그램에서 단계 4.6 (그림 4A)에서 생성 된 32 비트, 물 렸 다 이미지를 엽니다. Localize 드롭다운 을 선택 하 고 지 방화 (그림 4B), 이미지에 숫자 명소 계산을 클릭 합니다.
    참고: 계산 각 자리는 개별 mRNA를 나타냅니다. 밴드 패스와 광자 임계값 설정 화면 (그림 4B)에 표시 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 각 임계값 설정에 대 한 기본 사용 되었다. 긍정적인 대표 및 배경 명소 (그림 4C) 표시 됩니다.

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그림 4 : 자리 Finder를 사용 하 여 mRNAs의 정량화 및 추적. (A) 개별 z-시리즈 이미지 그림 3 에 설명 된 대로 함께 봉합 되었고 예상 32 비트 최대로 저장. TIFF 파일입니다. (B) 합성 이미지 스팟 파인더와 추적에 오픈 했습니다. 지역화 형광 명소 (빨간색 상자)을 계산 하는 데 사용 했다. 밴드 패스와 광자 임계값 파란색 상자에 의해 표시 됩니다. (C) 파란색 화살표 (임계값) 긍정적인 신호를 가리킵니다. 흰색 화살표는 형광 임계값 아래 자리 표시 하 고, 따라서 계산 되지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

결과

프로토콜 완료 되 면 결과 (그림 4A , 그림 5), 맞춘된 이미지 (그림 4C), confocal z 시리즈에서 개별 이미지를 있을 것입니다 그리고 mRNA 계산 (그림 4B). 다중화를 수행 하는 경우 또한 병합 된 이미지를 보여주는 두 개의 다른 mRNAs (

토론

일련의 작은 단계 프로토콜 동안 mRNAs의 성공적인 형광 및 정확한 보장 합니다. 첫째, 프로토콜 수집과 oocytes의 고정 후에 즉시 수행 되어야 합니다. Note PVP oocytes 서로에 집착 하지 않도록 4 %paraformaldehyde 고정 버퍼에 추가 됩니다. 우리 컬렉션은 oocytes의 고정 후 즉시 실험을 수행 하는 데 필요한 발견. 어떤 지연 결과 훨씬 낮은 형광 신호를 녹취 록의 undercounting 귀 착될 것입니다. 이것은 때문에 RNA ...

공개

저자는 아무것도 선언 하

감사의 말

설치 및 사용 자리 찾아서 추적 프로그램 13 의 confocal 현미경 이미징에 대 한 대학 네브라스카 링컨 현미경 코어의 기술 지원 그의 관대 한 도움에 감사 박사 다니엘 R. 라 슨 하 고. 이 연구는 네브라스카 농업 연구 부문, 링컨, 네브라스카 대학에의 기여도 나타냅니다과 UNL 해치 자금 (코-26-206/가입 번호-232435 및 코-26-231/승인 번호-1013511)에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-α-Lipoic acidSigma-AldrichT1395Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty AcidMP Biomedicals, LLC199899FAF BSA
BD 10mL TB SyringeBecton, Dickinson and Company30965910 mL syringe
BD PrecisionGlide NeedleBecton, Dickinson and Company30510927 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC7902CaCl2-2H2O
Citric acidSigma-AldrichC2404Citrate
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG6152Glucose
Disodium phosphateNa2HPO4
Easy Grip Petri DishFalcon Corning35100835 mm dish
Edetate DisodiumAvantor8994-01EDTA
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine SerumAtlanta biologicalsS10250FBS
Gentamicin Reagent Solutiongibco15710-064Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)gibco35050-061Glutamax
Gold Seal Micro SlidesGold Seal303925 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' SerumSigmaG4877eCG
hCG recombinantNHPPAFP8456AhCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine TestesSigma-AldrichH3884Hyaluronidase
Jewelers Style ForcepsIntegra17-305XForceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid MP Biomedicals, LLC190228L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM2773MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino AcidsCorning 25-025-ClNEAA
Microscope Cover GlassFisher Scientific12-542-C25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501891-C2Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501611-C3Pou5f1 Probe
MOPSSigma-AldrichM3183
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterileMillex-GPSLGP033RS0.22 um filters
PolyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP0930PVP
Potassium chlorideSigma-Aldrich60128KCl
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich60218KH2PO4
Prolong Gold antifade reagentinvitrogenP36934Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPIAdvanced Cell Diagnostics320858DAPI
RNAscope FL AMP 1Advanced Cell Diagnostics320852Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2Advanced Cell Diagnostics320853Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3Advanced Cell Diagnostics320854Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT AAdvanced Cell Diagnostics320855Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT BAdvanced Cell Diagnostics320856Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT CAdvanced Cell Diagnostics320857Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents KitAdvanced Cell Diagnostics320851FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics320871Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive ControlAdvanced Cell Diagnostics320881Positive Control
RNAscope Probe DiluentAdvanced Cell Diagnostics300041Probe Diluent
RNAscope Protease IIIAdvanced Cell Diagnositics322337Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics322340FISH Protease Kit
RNAscope Protease IVAdvanced Cell Diagnostics322336Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30GComponent Supply Co.NE-301PL-50blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6297NaHCO3
Sodium chlorideSigma-AldrichS6191NaCl
Sodium hydroxideSigma-Aldrich306576NaOH
Sodium pyruvate, >= 99%Sigma-AldrichP5280Pyruvate
Solution 6 Well DishAgtechincD186 well dish
TaurineSigma-AldrichT8691Taurine
Tissue Culture DishFalcon Corning35300260 mm dish
Triton X-100Sigma-AldrichX100Triton X-100

참고문헌

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. . Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).

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