زراعه وقياس الجنين والوليد العظام الطويلة Murine

Veronica Uribe; Alberto Rosello-Diez

doi:10.3791/59509

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هنا ، نقدم طريقه للثقافة المجرية السابقة للعظام طويلة murine في مرحلتي الجنين وحديثي الولادة ، ومناسبه لتحليل العظام والغضروف التنمية والتوازن في الظروف التي تسيطر عليها في حين تلخيص عمليه في الجسم المجري.

Abstract

العظام الطويلة هي هياكل معقده وديناميكية ، والتي تنشا من تعظم داخل التحجر عن طريق الغضروف المتوسط. الوصول المحدود إلى العظام البشرية السليمة يجعل استخدام نماذج الثدييات ، مثل الفار والفئران ، قيمه خاصه للنظر في جوانب مختلفه من نمو العظام والتوازن. بالاضافه إلى ذلك ، فان تطوير الاداات الوراثية المتطورة في الفئران يسمح باجراء دراسات أكثر تعقيدا لنمو العظام الطويل ويطلب التوسع في التقنيات المستخدمة لدراسة نمو العظام. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لثقافة العظام السابقة الجسم الفيفو ، والذي يسمح بدراسة العظام والغضروف بطريقه تسيطر عليها باحكام بينما يلخص معظم عمليه في الجسم المجري. الطريقة الموصوفة تسمح بثقافة مجموعه من العظام ، بما في ذلك عظم الساق ، عظم الفخذ ، وعظام المشط ، ولكننا نركز بشكل رئيسي علي الثقافة الظنبوبيه هنا. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدامه بالاقتران مع التقنيات الأخرى ، مثل التصوير الحي الفاصل الزمني أو العلاج بالعقاقير.

Introduction

نمو الجهاز يجب ان يتم ضبطها باحكام لمنع ظهور اضطرابات النمو, وينطوي علي تنظيم أنواع متعددة من الخلايا, المسارات الجزيئية والمتقاطعة بين أجزاء مختلفه من الجسم. تقنيات التصوير ضرورية لمعالجه التغيرات التي تحدث مع مرور الوقت في الاجنه المتنامية ، في الظروف العادية ، وكذلك بعد الاضطراب المستحث في النظام. الاجنه مع النمو في الرحم ، مثل نماذج القوارض المستخدمة علي نطاق واسع ، تشكل تحديا إضافيا للتصوير الحي والعلاج من المخدرات ، والتي يمكن التغلب عليها جزئيا عن طريق استخدام تقنيات الثقافة المجرية السابقة. لتلخيص بنجاح في العمليات المجرية والحصول علي نتائج ذات مغزى ، يصبح من الضروري العثور علي الظروف المناسبة لزراعه لكل عضو أو الانسجه.

تنمو معظم عظام الهيكل العظمي الثدييات من خلال تعظم داخل التحجر ، حيث الغضروف الجنيني (تتالف من خلايا تسمي غضروفي) محركات النمو الطولي ويتم استبدال تدريجيا بالعظم. تحدث هذه العملية في لوحات النمو ، وتقع في نهاية العظام الطويلة ، حيث يمكن تمييز ثلاث مناطق: يستريح ، التكاثري ، وفرط التغذية¹^،². أولا ، غضروفي الطليعة المستديرة في الانتقال إلى منطقه الراحة في الغضروفي عمودي الدراجات في المنطقة التكاثرية. خلال المرحلة التالية من التمايز ، وهذه غضروفي تصبح فرط التغذية والبدء في إفراز نوع X الكولاجين. الغضروفي المفرطة تنسق الخطوات التالية من التحجر: انها تفرز جزيئات الإشارات الرئيسية ، مثل عامل نمو النسيج الضام ، والبروتينات العظمية والقنفذ الهندي ، وتوجيه المعادن من المصفوفة ، وتجنيد الاوعيه الدموية إلى الجزء الأوسط من العظم ، وعند موت الخلايا المبرمج ، والسماح عظم (العظام تشكيل الخلية) لغزو المصفوفة لتشكيل مركز التحجر الابتدائي³^،⁴. المصفوفة المعدنية تسهل تغلغل الاوعيه الدموية التي من خلالها عظم تهاجر لتحل محل هذا الغضروف المتدهور مع مصفوفة العظام⁵. معظم عظم تغزو مصفوفة الغضروف من البيريتشوندريوم ، طبقه ليفية التي يلتف الغضروف⁶. بدلا من ذلك ، فان نسبه من فرط الغضروفي قادره علي البقاء علي قيد الحياة والتفريق إلى عظم⁷^،⁸^،⁹. ويرجع الطول النهائي للعظام إلى النمو المتراكم للغضروف العابر ، الذي يعتمد معدل نموه بدوره علي عدد وحجم الغضروفي التضخمية ، وإنتاج مصفوفة¹⁰. بالاضافه إلى ذلك, وقد تبين مؤخرا ان مده المرحلة الاخيره تضخم يرتبط مع الطول النهائي للعظام¹¹. ولذلك ، فان التنظيم المحكم لانتشار وتمايز هذه الخلايا مطلوب لضمان الحجم السليم للعظام.

علي الرغم من المعرفة الكبيرة التي اكتسبت علي مر السنتين علي تنظيم وتطوير لوحات النمو ، وتستند معظم هذه الاستنتاجات علي مراقبه الأقسام النسيجية الثابتة. يوفر المناديل الورقية معلومات قيمه حول هذه العملية ، ولكن يمكن ان تكون مليئه التحف الفنية ، لذلك لا يمكن ان تكون دائما تستخدم بشكل موثوق لتقدير التغيرات المورفولوجية أو حجم بين مراحل مختلفه. بالاضافه إلى ذلك ، مع نمو العظام هو عمليه ديناميكية ، والصور الثابتة ثنائيه الابعاد (2D) تقدم نظره محدوده في حركه الخلايا في لوحه النمو ، في حين ان التصوير الفاصل الزمني علي الانسجه الحية يمكن ان توفر معلومات قيمه عن سلوك غضروفي في لوحه النمو.

كل هذه القيود يمكن حلها باستخدام ثقافات العظام الجسم السابق. في حين تم تطوير بروتوكولات ثقافة العظام منذ بعض الوقت ، فقد تم تطبيقها بشكل محدود علي العظام الطويلة للمونين. معظم الدراسات استخدام العظام الفرخ بسبب المزايا التقنية التي تقدمها الفرخ نموذج¹²^,¹³. طبقت ثقافات [ارغميك] (هواء/سائله واجهه) كان إلى فرخ [فيورس] جنينيه, اي كان حافظت في ثقافة ل 10 أيام¹⁴. الاداات الوراثية المتطورة المتاحة في الماوس جعل هذا النموذج جذابة جدا لاستخدامها في ثقافة العظام الجسم السابق. الدراسات التي استخدمت الفئران للنظر في نمو العظام عملت في الغالب مع عظام المشط¹⁵, ربما بسبب صغر حجمها والحصول علي اعداد أكبر لكل جنين¹⁶. علي الرغم من ان تعتبر تقليديا العظام الطويلة ، والمشط دخول الشيخوخة (تتميز بانخفاض الانتشار والتفاف من لوحه النمو¹⁷) في وقت سابق من العظام الطويلة الأخرى في الجسم الآخر ، التالي نموها المستمر السابق الفيفو لا تلخيص حقا في عمليه الجسم المجري. لأغراض هذه المادة ، وسوف نستخدم مصطلح عظام طويلة للعظام من مناطق الأطراف القريبة والمتوسطة. استخدمت العديد من الدراسات السابقة العظام murine طويلة ، مثل الساق ، في الثقافات السابقة المجرية ولاحظت نموا كبيرا في الغضروف ولكن التحجر قليلا¹⁸. كما استخدمنا الظنبوبي الثقافات مؤخرا ، أساسا لدراسة ديناميات غضروفي¹⁹. دراسات أخرى استخدمت رؤوس الفخذ من الفئران الصغيرة²⁰ أو فقط الجزء البعيد من عظم الفخذ للثقافة²¹. بعض أكثر الاعمال الاخيره بنجاح الجمع بين الثقافة الحية السابقة من العظام الكامل مع التصوير الفاصل الزمني للحصول علي ثلاثه ابعاد (3d) الأفلام من غضروفي في انسجه الفار المعيشة²²^,²³. وتمكن المؤلفون من مراقبه الاحداث التي لم يلاحظها أحد في السابق في أعاده ترتيب الغضروفي إلى المنطقة التكاثرية²³ في مثال جيد للتطبيق المحتمل لثقافة العظام السابقة المجرية. والبديل ، اي تحليل الصور الثابتة ، يتطلب تقنيات غير مباشره ومعقده. وقد تجسد ذلك في دراسة أجريت مؤخرا لتقييم اهميه المستنسخات الموجهة عبر الطريق لنمو الغضروف ، حيث استخدمت التتبع الجيني مع سلالات الفئران متعددة ألوان المراسلة مع النمذجة الرياضية²⁴. ولذلك ، فان ثقافة الجسم الحي السابق قد تساعد في اكتساب نظره ثاقبه علي العمليات الديناميكية بطريقه أسرع وأكثر وضوحا.

هنا ، نقدم طريقه للثقافة العظام الطويلة murine ، والتي يمكن الجمع بينها مع العلاجات الجزيئية المختلفة و/أو مع التصوير الحي الفاصل الزمني. يتكيف هذا البروتوكول مع الأساليب المستخدمة في التقارير السابقة¹⁵^،¹⁸^،²⁵، ولكنه يعالج بعض القضايا الاضافيه ويركز علي عظام طويلة مثل عظم الساق ، بدلا من عظام المشط. وأخيرا ، فانه يستكشف إمكانات استخدام المقارنات المزدوجة القوية إحصائيا عن طريق ذبح العظام اليمني واليسرى بشكل منفصل في وجود مواد مختلفه.

Protocol

وينبغي تنفيذ جميع التجارب بعد المبادئ التوجيهية الحكومية والمؤسسية المحلية للتعامل الأخلاقي مع الماشية المختبرية.

1. التحضيرات قبل يوم ثقافة العظام

اعداد تزاوج الماوس موقوتة للحصول علي الاجنه والجراء من اليوم الجنيني 14.5 (ه 14.5) فصاعدا.
ملاحظه: ثقافة العظام الطويلة يمكن تطبيقها بنجاح علي سلالات الماوس مختلفه. في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام الفئران البرية السويسرية ويبستر من النوع.
اعداد تشريح المتوسطة (مقتبسه من هيوستن وآخرون¹⁵): تمييع α الحد الأدنى الاساسيه (α-ميم) أو دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (dmem) 1/13 في الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) و 2 ملغ/مل الزلال مصل البقري (جيش الصرب البوسني) وتعقيم فلتر من خلال 0.22 μm ، 33 مم القطر حقنه فلتر. تخزين الارصفه عند-20 درجه مئوية.
في اليوم السابق لاستخراج الاجنه ، واعداد المصل خاليه من العظام ثقافة المتوسطة تتالف من DMEM التي تحتوي علي 0.2 ٪ بوسنيا ، 0.5 mM L-الجلوتامين ، 40 U/mL البنسلين/ستربتوميسين ، 0.05 ملغ/مل حمض الاسكوربيك ، و 1 مم betaglycerophosphate. تصفيه تعقيم من خلال 0.22 μm ، 33 مم القطر حقنه فلتر وتخزين في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 1 شهر.
في يوم الثقافة وقبل الإعدام الماوس ، واعداد لوحات 24 جيدا واطباق 60 مم مع تشريح المتوسطة والحفاظ عليها الجليد الباردة. يسخن الوسط ثقافة العظام في 37 درجه مئوية حمام المياه. رذاذ 80 ٪ (v/v) الايثانول علي الاداات (ملاقط ومقص صغير) لاستخدامها في التعامل مع الجنين. نقل نطاق المجهر إلى مجلس السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.

2. ثقافة الجنين والساق الوليد وعظم الفخذ

Cull الماوس الحامل من خلال خلع عنق الرحم في مرحله الحمل المطلوب (تتراوح من E 14.5 إلى E 18.5). إذا تم استخدام الجراء الوليد ، وأزالها من الام واحدا تلو الآخر والإعدام عن طريق قطع الراس.
ضع الماوس علي ظهرها وتعقيم منطقه البطن عن طريق رش 80 ٪ (v/v) الايثانول علي سطحه.
قطع الجلد وعضله البطن مع مقص صغير للوصول إلى قرون الرحم.
استخراج الرحم من تجويف البطن مع مساعده من ملاقط ومقص صغير ، وأزاله ميسوميريوم وقطع قاعده من القرون. ضع الرحم في طبق بيتري 60 ملم مع الجليد الباردة تشريح المتوسطة والحفاظ علي طبق الثقافة علي الجليد خلال العملية برمتها.
نقل طبق بيتري مع الرحم إلى مجلس السلامة البيولوجية والعمل هناك من الآن فصاعدا.
منفصلة الاجنه الفردية مع مقص عن طريق القطع بين الحويصلات.
نقل الكيس الفردية تحت تشريح مجسمه في طبق 60 mm نظيفه مع تشريح المتوسطة وفتح لهم مع ملاقط لفصل الاجنه من مشيمة وتنظيفها من الاغشيه.
ملاحظه: العمل مع جنين واحد في كل مره ، مع الحفاظ علي بقية علي الجليد.
قطع الاجنه ونقل الجسم إلى طبق جديد نظيف 60 ملم مع 1 مل من الماصة المعقمة.
أزاله الجلد من الاجنه أو الجراء مع ملاقط بدءا من الظهر وتقشير بها حتى أصابع القدم.
فصل الأطراف السفلية من الجسم عن طريق قطع مع ملاقط قريبه من العمود الفقري ونقلها إلى طبق نظيف مع الجليد الباردة تشريح المتوسطة.
فصل الساق من عظم الفخذ مع ملاقط بإدخالها بعناية بين الغضروف السطحي من عظم الفخذ البعيدة والقصبة القريبة.
أزاله عظام الورك من عظم الفخذ القريب والعظام عقبي والشظية من الساق.
بعناية أزاله الانسجه الرخوة من عظم الفخذ والساق عن طريق واد وسحب قباله.
ملاحظه: من المهم أزاله أكبر قدر ممكن من الانسجه الرخوة ، مع إيلاء عناية خاصه في أزاله الانسجه التي تربط قطبي الغضروف ، ولكن تجنب اتلاف الغضروف ، والبيريتشوندريوم ، والعظام.
ضع العظام الاربعه (الانحياز الأيمن والأيمن والانوثه) في البئر الأول من الصفيحة التي تحتوي علي 24 بئر مع ماصه معقمه 1 مل من البلاستيك. بدلا من ذلك ، لمقارنه تاثير العلاجات المختلفة علي الأطراف اليسرى واليمني ، ضع أطراف المقابل في الآبار المختلفة.
ملاحظه: وينبغي إيلاء عناية اضافيه عندما يتم نقل العظام إلى الآبار ، لأنها يمكن ان تلتصق بسهوله إلى الماصة.
المضي قدما بنفس الطريقة مع العديد من الاجنه حسب الضرورة.
ملاحظه: تغيير الطبق مع المتوسطة تشريح بمجرد ان يحصل بظلالها جدا ، كما انه من المهم ان نري بوضوح العظام تشريحها.
عندما يتم نقل جميع العظام المطلوبة إلى الآبار ، وأزاله المتوسطة تشريح مع ماصه 1 مل من البلاستيك المعقمة واتخاذ المزيد من الرعاية لا يستنشق العظام.
1. اعتمادا علي الغرض من التجربة ، يمكن ان تؤخذ الصور من العظام قبل أزاله المتوسطة تشريح ، كما النقطة الزمنيه صفر من التجربة. التقط الصور باستخدام المجهر المرفق بكاميرا رقميه والتعليق علي التعرض والمقياس المستخدم. لضمان القياسات سهله وموثوق بها ، والتقاط الصور مع تباين جيد للتمييز بين الجزء المعدني.
أضف 1 مل من الثقافة المتوسطة إلى كل بئر. إذا كان المقصود اي علاج علي العظام (الدوكسيسيكلين ، تاموكسيفين ، وعوامل النمو ، وما إلى ذلك) ، ينبغي ان تضاف الآن.
لمراقبه تاثير تثبيط النمو في ظروف الثقافة ، وعلاج الانحياز اليسار مع حمض الريتينويك (RA ، 500 nM) ، في حين احتضان الانحياز الحق مع حجم مكافئ من المركبات (ثنائي ميثيل سولفوكسيد [DMSO] ، التركيز النهائي 0.1 ٪) كعنصر تحكم.
ترك العظام تنمو لمده يومين أو أكثر في حاضنه ثقافة الخلية تحت ظروف ثقافة الخلية القياسية (عند 37 درجه مئوية في 5% CO₂ حاضنه).
لتقييم الانتشار ، أضافه 5-ethynyl-2 '-ديوكسيريدين (ايدو) أو 5-برومو-2 '-ديوكسيريدين (BrdU) إلى الوسط في تركيز نهائي من 10 μM 1 − 2 h قبل التثبيت.
ملاحظه: تركيز المخزون من ايدو هو 20 ملم.
تحذير: EdU و brdu هي نظائرها ثيميدين ويمكن ان تكون سامه والطفرات.
ذوبان 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) وإصلاح العظام عن طريق الغمر في PFA في أنابيب الفردية 2 مل.
تحذير: PFA هو السامة والمحددة كمسرطن الإنسان المحتمل. تجنب التنفس مسحوق بارافورمالدهيد والابخره. EdU و brdu هي نظائرها ثيميدين ويمكن ان تكون سامه والطفرات.
بعد فتره وجيزة 10 دقيقه التثبيت في PFA في درجه حرارة الغرفة ، نقل العظام إلى الخدمات التلفزيونية للحصول علي صوره في الوقت النهائي. ثم وضع العظام مره أخرى في PFA لتثبيت بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
بعد تثبيت العظام يمكن معالجتها للتطبيقات المتلقية للمعلومات المطلوبة.

3. قياس وتحليل الطول الكامل للعظام والمنطقة المعدنية

استخدام برنامج تحرير الصور لقياس طول العظام ، مع الأخذ بعين الاعتبار حجم الصورة. قياس الطول الكلي للعظام والمنطقة المعدنية. بدء القياسات من الخلايا المظلمة الاولي في نهاية واحده حتى تلك الاخيره في الطرف الآخر.
ملاحظه: تتميز المنطقة المعدنية بلون أغمق وتتميز بسهوله من الغضروف.
لحساب معدل النمو ، الذي يعرف بأنه متوسط الزيادة في الطول في اليوم الواحد ، يقسم الفرق بين الطول النهائي للعظام والمدة الاوليه بعدد الأيام في الثقافة.

النتائج

يمكن اجراء ثقافة العظام بدءا من مراحل مختلفه. في الشكل 1A-D، يتم عرض مقارنه بين الساق مثقف والمستخرجة حديثا في مراحل مماثله. الملاحظة الاولي هي ان ما يصل إلى يومين من الثقافة الحجم الذي حققه هو مماثل لنمو العظام في الجسم المادي لكل من الغضروف والعظ?...

Discussion

وقد استخدمت العظام السابقين الجسم الحيوي أساليب الثقافة لبعض الوقت لتقييم بيولوجيا نمو العظام²⁸, ولكن نادرا ما طبقت علي العظام الطويلة murine. مع تطوير تقنيات التصوير ، تقدم ثقافة العظام السابقة الفيفو طريقه جذابة لدراسة نمو العظام في الوقت الحقيقي في وضع يشبه بشكل وثيق في ظروف ?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ونود ان نشكر الكسندرا جوينر علي دعمها عندما تم إنشاء هذا البروتوكول ، Edwina McGlinn ويي تشنغ تشانغ لتقاسم حمض الريتينويك. ويدعم المعهد الأسترالي للطب التجديدي بمنح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الاستراليه.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO₂ incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T

References

Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).
Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. The control of chondrogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).
Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
Erben, R. G. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).
Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: