胎児と新生児のネズミの長骨の培養と測定

要約

ここでは、胎児および新生児の両方の段階での長いネズミ骨の元インビボ培養のための方法を提示し、生体内プロセスを概説しながら制御された条件下で骨および軟骨の発達およびホメオスタシスを分析するのに適している。

要約

長骨は複雑で動的な構造であり、軟骨中間体を介して endochondral 骨化から生じる。健康な人間の骨への限られたアクセスは、マウスやラットなどの哺乳動物モデルの使用は、骨の成長と恒常性の異なる側面を調べるために特に貴重になります。さらに, マウスの洗練された遺伝的ツールの開発は、長い骨の成長のより複雑な研究を可能にし、骨の成長を研究するために使用される技術の拡大を求めます.ここでは、概説のほとんどの in vivo プロセスを使用しながら、厳密に制御された方法で骨と軟骨の研究を可能にする ex vivo ネズミ骨培養の詳細なプロトコルを紹介します。記載された方法は、脛骨、大腿骨、および中足骨を含む骨の範囲の培養を可能にするが、ここでは主に脛骨培養に焦点を当てている。また、タイムラプスライブイメージングや薬物治療などの他の技術と組み合わせて使用することができる。

概要

臓器の成長は、成長障害の出現を防ぐために厳密に調整されなければならない、と体の異なる部分間の複数の細胞型、分子経路およびクロストークの調節を伴う。イメージング技術は、成長している胚において経時的に起こる変化に対処するために不可欠であり、正常な状態においても、またシステムにおいて摂動が誘発された後も同様である。子宮内発育を伴う胚は、広く使用されているげっ歯類モデルのような、生きた画像化および薬物治療のための追加の課題を提示し、これは ex vivo 培養技術を使用して部分的に克服することができる。インビボプロセスを正常に不在し、有意義な結果を得るためには、各器官または組織に対して適切な培養条件を見つけることが重要となる。

哺乳類の骨格のほとんどの骨は endochondral 骨化を通じて成長し、そこでは胚性軟骨 (軟骨細胞と呼ばれるセルで構成される) が長手方向の成長を駆動し、徐々に骨に置換される。このプロセスは、長い骨の末端に位置する成長プレートで発生します, 3 つのゾーンを区別することができます: 安静, 増殖性, 肥大と^1,2.第1に、安静域における丸い前駆軟骨は、増殖性ゾーンにおいて循環柱状軟骨細胞へと移行する。分化の次の段階では、これらの軟骨細胞は肥厚性になり、タイプ X コラーゲンを分泌し始めます。肥大性軟骨細胞は骨化の後続のステップを調整します: 結合組織成長因子、骨形態形成タンパク質、インドヘッジホッグなどの主要なシグナル伝達分子を分泌し、マトリックスの無機化を誘導し、血管は、骨の中央部分に、そして、アポトーシスの際に、骨芽細胞 (骨形成セル) が一次骨化中心^3,4を形成するマトリックスに浸潤することを可能にする。無機化されたマトリックスは、骨芽細胞がこの劣化した軟骨を骨格⁵に置き換えて移行する血管の浸透を促進する。ほとんどの骨芽細胞は、軟骨膜から軟骨基質に浸潤し、軟骨⁶を包み込む繊維層である。あるいは、肥厚性軟骨細胞の割合は、骨芽細胞^7、8、9に生存し、transdifferentiate することができます。骨の最終的な長さは、一時的な軟骨の蓄積された成長によるものであり、その成長速度は、肥大性軟骨細胞の数およびサイズ、およびそれらのマトリックス産生¹⁰に依存する。さらに、最後の肥大期の持続時間が骨¹¹の最終的な長さと相関することが最近示された。したがって、これらの細胞の増殖および分化の厳密な調節は、正しい骨サイズを確保するために必要である。

組織や成長プレートの開発に長年にわたって得られたかなりの知識にもかかわらず、これらの結論のほとんどは、固定組織学的セクションの観察に基づいています。ティッシュの区分はこのプロセスに関する貴重な情報を提供するが、技術的なアーティファクトと乗ることができる従って異なった段階間の形態的なかサイズの変更を推定するのに常に確実に使用することができない。さらに、骨の成長は動的なプロセスであるため、静的二次元 (2D) 画像は成長板の細胞の動きに限られた洞察を与え、生きた組織に対するタイムラプス撮影は、その行動に関する貴重な情報を提供することができます。成長プレート内の軟骨細胞。

これらすべての制限は、ex vivo の骨培養を使用して潜在的に解決することができます。骨培養プロトコルは、いくつかの時間前に開発されているが、彼らは限定マウスの長い骨に適用されました。研究のほとんどは、ひよこモデル^12,13によって提供される技術的な利点のためにひよこの骨を使用しています。Organotypic 培養物 (空気/液体界面) を、10日間¹⁴の培養で維持したひよこ胚大腿骨に適用した。マウスで利用可能な洗練された遺伝学的ツールは、このモデルは、ex vivo の骨の培養で使用されることが非常に魅力的にする。骨の成長を調べるためにマウスを使用した研究は、ほとんど中足骨¹⁵で働いていましたが、おそらくその小さなサイズと胚¹⁶あたりのより大きな数に起因します。伝統的に長い骨と考えられていたが、metatarsi は、インビボで他の長骨よりも早く (成長プレート¹⁷の増殖および退縮を減少させることを特徴とする) 老化を入力し、したがってそれらの連続的な増殖は実際に in vivo プロセスを不在ます。この記事の目的のために、近位および中間肢領域からの骨のための長い骨という用語を使用します。以前のいくつかの研究では、脛骨のような長いネズミ骨を、ex vivo 培養で使用し、軟骨の実質的な成長を観察したが、少し骨化¹⁸.我々はまた、最近、主に軟骨ダイナミクス¹⁹を研究するために脛骨培養物を使用しました。他の研究は、若年マウス²⁰または培養物²¹のための大腿骨の遠位部分のみから大腿骨頭を使用した。いくつかのより最近の作品では、正常な骨の ex 培養とタイムラプス撮影を組み合わせることで、生きているマウス組織^22,23における軟骨細胞の三次元 (3d) 映画を得ることができます。著者らは、骨 ex インビボ培養の潜在的適用の良い例において、増殖性ゾーン²³への軟骨細胞の再配置において以前気付かれなかった事象を観察することを管理した。静的な画像を分析する代替手段として、間接的で複雑になる手法が必要です。これは、軟骨成長のための横断的指向クローンの重要性を評価する最近の研究によって例示された、数学的モデリングと結合した多色レポーターマウス系統を用いた遺伝的トレースは²⁴を使用した。したがって、ex vivo カルチャは、動的なプロセスについてより迅速かつ簡単に洞察を得るのに役立つ可能性があります。

ここでは、マウス長骨培養のための方法を提示し、これを異なる分子処理および/またはタイムラプスライブイメージングと組み合わせることができる。このプロトコルは、以前のレポート^15、18、25で使用される方法を適応するが、いくつかの追加の問題に対処し、中足の骨ではなく、脛骨などの長骨に焦点を当てています。最後に、異なる物質の存在下で左右の骨を別々に培養することによって、統計的に強力な対比較を使用する可能性を探ります。

プロトコル

すべての実験は、実験動物の倫理的取扱いに関する地方の政府および制度のガイドラインに従って行われるべきである。

1. 骨培養日前の準備

1. Matings の日 14.5 (E 14.5) 以降から胎児と仔を得るために、時限マウスを設定します。
   注:長い骨の文化は、正常に異なるマウス系統に適用することができます。本プロトコールにおいて、outbred スイスウェブスター野生型マウスが用いられる。
2. 解離培地の調製 (ヒューストン et al.¹⁵): 希釈α-最小エッセンシャル培地 (α-MEM) またはダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 1/13 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) および 2Mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) およびフィルター滅菌0.22 μ m、33 mm 直径のスポイトフィルターを通して。アリコートを-20 ° c に保管してください。
3. 胎児の抽出の前日に、0.2% BSA を含む DMEM、0.5 mM L-グルタミン、40 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、0.05 mg/mL アスコルビン酸、および1mm の betaglycerophosphate からなる無血清骨培養培地を準備する。フィルター滅菌は、0.22 μ m、33 mm 径のシリンジフィルターを通して、4° c で最大1ヶ月間保存します。
4. 文化の日とマウスのカリングの前に、解剖培地で24ウェルプレートと 60 mm の料理を準備し、氷冷してください。37° c の水浴中で骨培養培地を外。胎児の取り扱いに使用する工具 (ピンセットと小さなはさみ) に 80% (v/v) エタノールを噴霧する。双眼スコープをクラス II バイオセーフティキャビネットに移します。

2. 胎児・新生児の培養脛骨と大腿骨

1. 所望の妊娠の段階 (E 14.5 から E 18.5 までの範囲) での頚部脱臼を通して妊娠中のマウスをカリングする。新生児が使用されている場合は、1つずつ母からそれらを削除し、斬首によってカリングします。
2. 彼女の背中にマウスを置き、その表面に 80% (v/v) エタノールを噴霧することにより、腹部領域を滅菌します。
3. 皮膚と腹部の筋肉を小さなはさみで切り、子宮の角にアクセスします。
4. ピンセットと小さなはさみの助けを借りて腹腔から子宮を抽出し、mesometrium を取り除き、角の基部を切断する。氷冷解剖培地で 60 mm ペトリ皿に子宮を置き、全体の手順の間に氷の上に培養皿を保つ。
5. ペトリ皿を子宮と一緒にバイオセーフティキャビネットに移し、これから作業を行います。
6. 嚢間を切断することにより、個々の胎児をはさみで分離する。
7. 解剖培地を備えた清潔な 60 mm ディッシュの実体顕微鏡で個々の嚢を移し、ピンセットで開き、胎児を胎盤から分離し、膜から拭きます。
   注:氷の上に残りを維持しながら、一度に1つの胚で動作します。
8. 胎児を斬るし、1つの mL の切られた生殖不能のピペットが付いているきれいで新しい 60 mm の皿にボディを移す。
9. ピンセットで胎児や仔の皮膚を取り除き、つま先まで剥がします。
10. 脊椎に近いピンセットで切断して体から四足獣を分離し、氷冷解剖培地できれいな皿に移します。
11. 遠位大腿骨および近位脛骨の表面の軟骨の間で慎重にそれらを導入することによってピンセットが付いている腿骨からの脛骨を分けなさい。
12. 近位腿骨および踵骨からの股関節骨および脛骨からの腓骨を除去する。
13. 慎重にニッピングし、それを引っ張ることによって大腿骨と脛骨から軟部組織を除去します。
    注:2つの軟骨極を接続する組織を除去するのに特別な注意を取って、できるだけ多くの軟部組織を除去することが重要ですが、軟骨、軟骨膜、骨を損傷するのを避けてください。
14. 4本の骨 (左右脛骨と大腿骨) を24ウェルプレートの最初の井戸に入れ、プラスチック製の1ml の滅菌ピペットで置きます。あるいは、左右の手足の異なる治療の効果を比較するために、対の四肢を異なる井戸に置く。
    注:彼らは簡単にピペットに固執することができますように、骨がウェルに転送されたときに余分なケアを取る必要があります。
15. 必要な数の胎児と同じように進行してください。
    注:切開した骨をはっきりと見ることが重要なので、それが曇ってしまうとすぐに、解剖培地で皿を変えてください。
16. すべての所望の骨がウェルに転送されると、プラスチック1ml の滅菌ピペットで解剖培地を除去し、骨を吸引しないように余分な注意を取ります。
    1. 実験の目的に応じて、実験の timepoint ゼロとして、解剖培地を除去する前に骨の写真を撮ることができる。デジタルカメラに取り付けられた顕微鏡で写真を撮り、使用する露出とスケールに注釈を付けます。簡単で信頼性の高い測定を行うには、無機化された部分を区別するためにコントラストの良い写真を撮影します。
17. 各ウェルに培養液 1 mL を加えます。任意の治療は、骨 (ドキシサイクリン、タモキシフェン、成長因子など) に意図されている場合、それは今追加する必要があります。
18. 培養条件における増殖阻害の影響を観察するには、左脛骨をレチノイン酸 (RA, 500 nM) で治療し、同等量のビヒクルで右脛骨をインキュベートしながら (ジメチルスルホキシド [DMSO]、最終濃度 0.1%)コントロールとして。
19. 標準的な細胞培養条件 (5% CO2 インキュベーターで37° c で) で細胞培養インキュベーター内で2日間以上成長するように骨を残します。
20. 増殖を評価するには、固定の前に 5-ethynyl-2'-デオキシウリジン (EdU) または 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU) を10μ m 1 − 2 h の最終濃度で培地に加える。
    注:EdU のストック濃度は20mm です。
    注意:EdU および BrdU は、チミジン類似体であり、毒性および変異原性であり得る。
21. 解凍 4% パラホルムアルデヒド (PFA) と個々の2ml の管の PFA に浸漬することによって骨を固定します。
    注意:PFA は有毒であり、潜在的なヒト発癌物質として指定されています。パラホルムアルデヒド粉末および蒸気を呼吸することは避けてください。EdU および BrdU は、チミジン類似体であり、毒性および変異原性であり得る。
22. 室温で PFA の短い10分の固定の後、最終的な timepoint で写真の取得のための PBS に骨を転送します。その後、4° c で一晩固定するための PFA に戻って骨を置きます。
23. 固定骨は望ましい下流の適用のために処理することができる後。

3. 骨および無機化された領域の全長の測定と分析

1. イメージ編集ソフトウェアを使用して、イメージのスケールを考慮して、ボーンの長さを測定します。骨の全長と無機化された領域の両方を測定します。一端の最初の暗いセルからもう一方の端にある最後のものまで測定を開始します。
   注:無機化された領域は、より暗い色を特徴とし、軟骨と容易に区別される。
2. 一日あたりの平均の長さの増加として定義された成長率を計算するには、骨の最終的な長さと最初のものの差を培養日数で割ります。

結果

骨培養は、異なる段階から開始して行うことができる。図 1a− Dにおいて、同一の段階での培養した脛骨と抽出したものとの比較が示されている。第1の観察は、達成された最大2日間の培養が、軟骨および無機骨の両方についてインビボ骨成長に匹敵することである (図 1a、B、D)。培養期間が長いと...

ディスカッション

骨 ex インビボ培養法は、骨成長²⁸の生物学を評価するためにしばらくの間使用されてきたが、マウス長骨にはめったに適用されていない。画像化技術の発達により、ex vivo の骨培養は、インビボ条件に近い設定でリアルタイムで骨成長を研究する魅力的な方法を提供する。このシナリオでは、長い骨の成長がインビボでの成長に匹敵する条件を定義することが重要である。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2 incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T