Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

Resumo

Aqui, nós apresentamos um método para a cultura ex vivo de ossos murino longos em estágios fetal e recém-nascido, apropriados para analisar o desenvolvimento do osso e da cartilagem e o homeostase em circunstâncias controladas ao recapitulando o processo in vivo.

Resumo

Os ossos longos são estruturas complexas e dinâmicas, que surgem da ossificação endocondral através de um intermediário de cartilagem. O acesso limitado aos ossos humanos saudáveis torna particularmente valioso o uso de modelos de mamíferos, como rato e rato, para olhar em diferentes aspectos do crescimento ósseo e homeostase. Além disso, o desenvolvimento de ferramentas genéticas sofisticadas em camundongos permite estudos mais complexos de crescimento ósseo longo e pede uma expansão das técnicas utilizadas para estudar o crescimento ósseo. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para a cultura de osso murino ex vivo, que permite o estudo do osso e da cartilagem em uma maneira firmemente controlada ao recapitulando a maioria do processo in vivo. O método descrito permite a cultura de uma gama de ossos, incluindo tíbia, fêmur e ossos metatársicos, mas temos focado principalmente na cultura tibial aqui. Além disso, pode ser usado em combinação com outras técnicas, tais como a imagem latente viva do tempo-lapso ou o tratamento da droga.

Introdução

O crescimento de órgãos tem de ser firmemente afinado para evitar o aparecimento de distúrbios de crescimento, e envolve a regulação de vários tipos de células, vias moleculares e conversa cruzada entre diferentes partes do corpo. Técnicas de imagem são essenciais para abordar as mudanças que ocorrem ao longo do tempo em um embrião em crescimento, tanto em condições normais, bem como após uma perturbação é induzida no sistema. Embriões com desenvolvimento intrauterino, como os modelos de roedores amplamente utilizados, apresentam um desafio adicional para a imagem ao vivo e tratamento medicamentoso, que pode ser parcialmente superado pelo uso de técnicas de cultura ex vivo. Para recapitular com sucesso os processos in vivo e obter resultados significativos, torna-se crucial encontrar as condições de cultivo certas para cada órgão ou tecido.

A maioria dos ossos do esqueleto de mamíferos cresce através da ossificação endocondral, onde a cartilagem embrionária (composta de células denominadas condrócitos) impulsiona o crescimento longitudinal e é gradualmente substituída pelo osso. Esse processo ocorre nas placas de crescimento, localizadas no final dos ossos longos, onde três zonas podem ser distinguidas: repouso, proliferativa e hipertrófica^1,2. Primeiramente, os condrócitos redondos do progenitoras na transição da zona descansando nos condrócitos colunar de ciclagem na zona proliferative. Durante a fase seguinte da diferenciação, estes condrócitos tornam-se hipertrófica e começam secretoras o tipo colagénio de X. Os condrócitos hipertróficos orquestram as etapas subsequentes da ossificação: secretam moléculas-chave de sinalização, como fator de crescimento do tecido conjuntivo, proteínas morfogenéticas ósseas e ouriço indiano, e dirigem a mineralização da matriz, recrutam os vasos sanguíneos para a parte central do osso, e, após a apoptose, permitem osteoblastos (células formadoras de osso) para invadir a matriz para formar o centro de ossificação primária^3,4. A matriz mineralizada facilita a penetração dos vasos sanguíneos através dos quais os osteoblastos migram para substituir esta cartilagem degradada por uma matriz óssea⁵. A maioria dos osteoblastos invade a matriz cartilaginosa do pericôndrio, uma camada fibrosa que envolve a cartilagem⁶. Alternativamente, uma proporção de condrócitos hipertróficos é capaz de sobreviver e transdiferenciar a osteoblastos^7,8,9. O comprimento final do osso é devido ao crescimento acumulado da cartilagem transitória, cuja taxa de crescimento por sua vez depende do número e tamanho dos condrócitos hipertróficos, e sua produção matricial¹⁰. Adicionalmente, foi demonstrado recentemente que a duração da última fase de hipertrofia correlaciona-se com o comprimento final do osso¹¹. Conseqüentemente, a regulação apertada da proliferação e da diferenciação destas pilhas é exigida para assegurar o tamanho apropriado do osso.

Apesar do conhecimento substancial adquirido ao longo dos anos sobre a organização e o desenvolvimento das placas de crescimento, a maioria destas conclusões baseiam-se na observação de secções histológicas fixas. O corte de tecidos fornece informações valiosas sobre esse processo, mas pode ser montado com artefatos técnicos, por isso não pode ser sempre confiável usado para estimar alterações morfológicas ou de tamanho entre diferentes estágios. Adicionalmente, porque o crescimento do osso é um processo dinâmico, as imagens bidimensionais (2D) estáticas oferecem uma introspecção limitada no movimento das pilhas na placa do crescimento, quando a imagem latente do tempo-lapso no tecido vivo poderia oferecer a informação valiosa no comportamento do condrócitos na placa de crescimento.

Todas essas limitações podem ser potencialmente resolvidas usando culturas ósseas ex vivo. Quando os protocolos da cultura do osso forem desenvolvidos alguma hora há, foram aplicados limitadamente aos ossos longos murino. A maioria dos estudos utiliza ossos de pintinhos devido às vantagens técnicas oferecidas pelo modelo de pintainho^12,13. Culturas organotípicas (interface ar/líquido) foram aplicadas a fêmures embrionárias de pintinhos, mantidas em cultura por 10 dias¹⁴. As sofisticadas ferramentas genéticas disponíveis no mouse tornam este modelo muito atraente para ser usado na cultura óssea ex vivo. Os estudos que utilizaram camundongos para olhar para o crescimento ósseo trabalharam principalmente com os ossos do metatarso¹⁵, provavelmente devido ao seu tamanho pequeno e maiores números obtidos por embrião¹⁶. Embora tradicionalmente considerados ossos longos, metatarsos entram em senescência (caracterizada pela redução da proliferação e involução da placa de crescimento¹⁷) mais cedo do que outros ossos longos in vivo, e, portanto, o seu crescimento contínuo ex vivo não realmente recapitular o processo in vivo. Para os propósitos deste artigo, usaremos o termo ossos longos para ossos das regiões proximal e intermediária do membro. Vários estudos prévios utilizaram ossos murinos longos, como a tíbia, em culturas ex vivo e observaram um crescimento substancial da cartilagem, mas pouca ossificação¹⁸. Também utilizamos culturas tibiais recentemente, principalmente para estudar a dinâmica do condrócitos¹⁹. Outros estudos utilizaram cabeças femorais de camundongos jovens²⁰ ou apenas a parte distal do fêmur para cultura²¹. Alguns trabalhos mais recentes combinam com sucesso a cultura ex vivo de ossos cheios com imagens de lapso temporal para adquirir filmes tridimensionais (3D) de condrócitos em tecido vivo de camundongo^22,23. Os autores conseguiram observar eventos previamente despercebidos no rearranjo de condrócitos para a zona proliferativa²³ em um bom exemplo da potencial aplicação da cultura óssea ex vivo. A alternativa, ou seja, analisando imagens estáticas, requer técnicas indiretas e complexas. Isto foi exemplificado por um estudo recente avaliando a importância de clones transgénicos orientados para o crescimento da cartilagem, onde o traçado genético com cepas multicolor do rato do repórter acoplados com modelagem matemática foi usado²⁴. Portanto, a cultura ex vivo pode ajudar a obter insights sobre processos dinâmicos de forma mais rápida e direta.

Aqui, nós apresentamos um método para a cultura longa dos ossos murino, que pode ser combinada com os tratamentos moleculars diferentes e/ou com imagem latente viva do tempo-lapso. Este protocolo adapta os métodos utilizados nos relatórios anteriores^15,18,²⁵, mas aborda alguns problemas adicionais e se concentra em ossos longos, como a tíbia, ao invés de ossos metatarsais. Por fim, explora o potencial do uso de comparações pareadas estatisticamente poderosas, cultivando ossos esquerdos e direitos separadamente na presença de diferentes substâncias.

Protocolo

Todos os experimentos devem ser realizados seguindo as diretrizes governamentais e institucionais locais de manejo ético de animais de laboratório.

1. preparações antes do dia da cultura óssea

1. Configurar temporizações cronometradas do rato para obter fetos e filhotes de 14,5 do dia embrionário (E 14.5) e avante.
   Nota: A cultura de ossos longos pode ser aplicada com sucesso a diferentes cepas de camundongo; no presente protocolo, são usados ratos suíços de tipo selvagem da raça Webster.
2. Prepare o meio de dissecção (adaptado de Houston et al.¹⁵): diluir α-meio essencial mínimo (α-mem) ou o meio de águia modificado de Dulbecco (dmem) 1/13 em soro fisiológico com tampão fosfato (PBS) e 2 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) e esterilizar filtro através de um 0,22 μm, filtro de seringa de 33 mm de diâmetro. Armazene alíquotas a-20 ° c.
3. O dia antes da extração dos fetos, prepare o meio de cultura óssea livre de soro composto por DMEM contendo 0,2% de BSA, 0,5 mM L-glutamina, 40 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0, 5 mg/mL de ácido ascórbico e 1 mM de betaglicerofosfato. Filtre esterilize através de um 0,22 μm, filtro da seringa do diâmetro de 33 milímetros e armazene em 4 ° c por até 1 mês.
4. No dia da cultura e antes do abate do rato, prepare placas de 24 poços e pratos de 60 mm com meio de dissecção e mantenha-os gelados. Pré-aqueça o meio de cultura óssea em um banho de água de 37 ° c. Spray de 80% (v/v) etanol nas ferramentas (pinças e pequenas tesouras) para ser usado para a manipulação do feto. Transfira um espaço binocular a um armário da Biossegurança da classe II.

2. cultura do feto e tíbia e fêmur recém-nascidos

1. Cull o rato grávido através da deslocação cervical na fase gestacional desejada (variando de E 14.5 a E 18.5). Se os filhotes recém-nascidos são usados, removê-los da mãe um por um e cull por decapitação.
2. Coloque o mouse sobre as costas e esterilizar a região abdominal por pulverização 80% (v/v) etanol em sua superfície.
3. Corte a pele e o músculo abdominal com pequenas tesouras para acessar os chifres uterinos.
4. Extraia o útero da cavidade abdominal com a ajuda de pinças e pequenas tesouras, removendo o mesométrio e cortando a base dos chifres. Coloque o útero em uma placa de Petri de 60 mm com meio de dissecção gelada e mantenha o prato de cultura no gelo durante todo o procedimento.
5. Transfira a placa de Petri com o útero para o gabinete de biossegurança e trabalhe lá a partir de agora.
6. Separe os fetos individuais com tesouras cortando entre as SACs.
7. Transfira o saco individual um estereomicroscópio da dissecção em um prato limpo de 60 milímetros com meio da dissecção e abra-os acima com pinças para separar os feto das placentas e para limpá-los das membranas.
   Nota: Trabalhe com um embrião de cada vez, mantendo o resto no gelo.
8. Decapitar os fetos e transferir o corpo para um novo prato limpo de 60 mm com uma pipeta estéril cortada em 1 mL.
9. Retire a pele dos fetos ou filhotes com pinças a partir da parte de trás e descascando-o para fora até os dedos do pé.
10. Separe os membros posteriores do corpo cortando com as pinças próximas da coluna vertebral e transfira-as para um prato limpo com meio de dissecção gelada.
11. Separe a tíbia do fêmur com pinças, introduzindo-as cuidadosamente entre a cartilagem superficial do fêmur distal e a tíbia proximal.
12. Retire os ossos da anca do fêmur proximal e do osso calcâneo e a fíbula da tíbia.
13. Retire cuidadosamente o tecido mole do fêmur e da tíbia por beliscando e puxando-o.
    Nota: É importante remover o máximo de tecido mole possível, tomando cuidado especial na remoção do tecido que conecta os dois pólos de cartilagem, mas evitando danificar a cartilagem, o pericôndrio, e os ossos.
14. Coloque os quatro ossos (tíbias esquerda e direita e fêmures) no primeiro poço da placa de 24 poços com uma pipeta estéril de plástico de 1 ml. Alternativamente, para comparar o efeito de diferentes tratamentos em Membros esquerdos e direitos, coloque Membros contralaterais em diferentes poços.
    Nota: O cuidado extra deve ser tomado quando os ossos são transferidos aos poços, porque podem facilmente furar à pipeta.
15. Proceda da mesma forma com o número de fetos que for necessário.
    Nota: Mude o prato com o meio da dissecção assim que começ demasiado clouded, porque é importante ver claramente os ossos dissecados.
16. Quando todos os ossos desejados forem transferidos para os poços, retire o meio de dissecção com uma pipeta estéril de 1 mL de plástico e tome cuidado extra para não aspirar os ossos.
    1. Dependendo da finalidade do experimento, fotos podem ser tiradas dos ossos antes de remover o meio de dissecção, como ponto de tempo zero do experimento. Tire fotografias com um microscópio ligado a uma câmara digital e anote a exposição e a escala utilizadas. Para garantir medições fáceis e confiáveis, tire fotos com bom contraste para distinguir a parte mineralizada.
17. Adicione 1 mL de meio de cultura a cada poço. Se qualquer tratamento é destinado aos ossos (doxiciclina, tamoxifeno, fatores de crescimento, etc.), ele deve ser adicionado agora.
18. Para observar o efeito da inibição do crescimento nas condições de cultura, tratar a tíbias esquerda com ácido retinóico (ra, 500 nm), enquanto incubando a tíbias direita com um volume equivalente de veículo (dimetil sulfóxido [DMSO], concentração final 0,1%) como um controle.
19. Deixe os ossos crescer por dois dias ou mais em uma incubadora da cultura de pilha condições padrão da cultura de pilha (em 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂ ).
20. Para avaliar a proliferação, adicione 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) ou 5-bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) ao meio em uma concentração final de 10 μM 1 − 2 h antes da fixação.
    Nota: A concentração conservada em estoque de EdU é 20 milímetros.
    Cuidado: EdU e BrdU são análogos da timidina e podem ser tóxicos e mutagênicos.
21. Descongelar 4% paraformaldeído (PFA) e fixar os ossos por imersão em PFA em tubos individuais de 2 mL.
    Cuidado: A PFA é tóxica e designada como um provável carcinógeno humano. Evite respirar paraformaldeído em pó e vapores. EdU e BrdU são análogos da timidina e podem ser tóxicos e mutagênicos.
22. Após uma breve fixação de 10 min em PFA à temperatura ambiente, transfira os ossos para PBS para aquisição de imagens no ponto temporal final. Em seguida, coloque os ossos de volta na PFA para fixar durante a noite a 4 ° c.
23. Depois que os ossos da fixação podem ser processados para aplicações a jusante desejadas.

3. mensuração e análise do comprimento total do osso e da região mineralizada

1. Use um software de edição de imagem para medir o comprimento dos ossos, levando em conta a escala da imagem. Meça tanto o comprimento total do osso quanto a região mineralizada. Comece as medições das primeiras células escuras em uma extremidade até os últimos na outra extremidade.
   Nota: A região mineralizada é caracterizada pela cor mais escura e é facilmente distinguida da cartilagem.
2. Para calcular a taxa de crescimento, definida como o aumento médio de comprimento por dia, divida a diferença entre o comprimento final do osso e o inicial pelo número de dias na cultura.

Resultados

A cultura óssea pode ser realizada a partir de diferentes estágios. Na Figura 1a-D, é mostrada uma comparação entre a tíbia cultivada e as recém-extraídas em estágios equivalentes. A primeira observação é que até dois dias de cultura o tamanho alcançado é comparável ao crescimento ósseo in vivo para cartilagem e osso mineralizado (Figura 1a, B, D). Períodos de cultura mais longo...

Discussão

Os métodos de cultura óssea ex vivo têm sido usados há algum tempo para avaliar a biologia do crescimento ósseo²⁸, mas raramente foram aplicados aos ossos longos murinos. Com o desenvolvimento de técnicas de imagem, a cultura óssea ex vivo oferece uma maneira atrativa de estudar o crescimento ósseo em tempo real em um cenário que se assemelha às condições in vivo. Neste cenário, é importante definir as condições em que o crescimento dos ossos longos é comparável ao seu cresciment...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2 incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T