Die Kultivierung und Messung von Fetalen und Neugeborenen Murine Long Bones

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode für die ex vivo-Kultur der langen Murinknochen in den Phasen des Fetales und Neugeborenen vor, die für die Analyse der Knochen-und Knorpelentwicklung und der Homöostase unter kontrollierten Bedingungen geeignet ist, während der In-vivo-Prozess rekapituliert wird.

Zusammenfassung

Lange Knochen sind komplexe und dynamische Strukturen, die sich aus der endochondralen Verknöcherung über ein Knorpel-Zwischenprodukt ergeben. Der eingeschränkte Zugang zu gesunden menschlichen Knochen macht den Einsatz von Säugetiermodellen wie Maus und Ratte besonders wertvoll, um verschiedene Aspekte des Knochenwachstums und der Homöostase zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung ausgeklügelter genetischer Werkzeuge bei Mäusen komplexere Studien über langes Knochenwachstum und fordert eine Ausweitung der Techniken, die zur Untersuchung des Knochenwachstums verwendet werden. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die ex vivo Murinknochenkultur vor, das es ermöglicht, Knochen und Knorpel streng kontrolliert zu untersuchen und den größten Teil des In-vivo-Prozesses zu rekapitulieren. Die beschriebene Methode ermöglicht die Kultur einer Reihe von Knochen, darunter Tibia, Femur und Metatarsal-Knochen, aber wir haben uns hier hauptsächlich auf die tibiale Kultur konzentriert. Darüber hinaus kann es in Kombination mit anderen Techniken, wie Zeitraffer-Live-Bildgebung oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Einleitung

Das Organwachstum muss eng abgestimmt werden, um das Auftreten von Wachstumsstörungen zu verhindern, und beinhaltet die Regulierung mehrerer Zelltypen, molekularer Wege und Kreuzungen zwischen verschiedenen Körperteilen. Bildgebende Techniken sind unerlässlich, um die Veränderungen zu bewältigen, die im Laufe der Zeit in einem wachsenden Embryo auftreten, sowohl unter normalen Bedingungen, als auch nach einer Störung, die im System induziert wird. Embryonen mit intrauterinischer Entwicklung, wie die weit verbreiteten Nagetiermodelle, stellen eine zusätzliche Herausforderung für die Live-Bildgebung und die medikamentöse Behandlung dar, die teilweise durch den Einsatz von Ex-vivo-Kulturtechniken bewältigt werden kann. Um die In-vivo-Prozesse erfolgreich zu rekapitulieren und aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, ist es entscheidend, die richtigen kultivierenden Bedingungen für jedes Organ oder Gewebe zu finden.

Die meisten Knochen des Säugetierskeletts wachsen durch endochondrale Verknöcherung, wo der embryonale Knorpel (bestehend aus Zellen, die Chondrozyten genannt werden) das Längswachstum antreibt und nach und nach durch Knochen ersetzt wird. Dieser Prozess geschieht an den Wachstumsplatten, die sich am Ende der langen Knochen befinden, wo drei Zonen unterschieden werden können: Ruht, proliferativ und hypertrophisch^1,2. Zunächst die runden Vorläuferchchen in der Ruhezone Übergang in die Radspalnar chondrozyten in der proliferativen Zone. In der nächsten Phase der Differenzierung werden diese Chondrozyten hypertrophisch und beginnen, Typ X Kollagen zu spülen. Hypertrophe Chondrozyten orchestrieren die folgenden Schritte der Verknöcherung: Sie scheiden Schlüsselsignalmoleküle aus, wie Bindegewebswachstumsfaktor, Knochenmorphogenetische Proteine und indischer Igel, und lenken die Mineralisierung der Matrix, rekrutieren Die Blutgefäße bis zum zentralen Teil des Knochens, und nach der Apoptose,^erlaubenOsteoblasten (Knochenbildende Zellen), in die Matrix einzudringen, umdie primäre Verknöcherung Zentrum 3,4^zubilden. Die mineralisierte Matrix erleichtert das Eindringen von Blutgefäßen, durch die Osteoblasten wandern, um diesen abgebauten Knorpel durch eine Knochenmatrix⁵zu ersetzen. Die meisten Osteoblasten dringen in die Knorpelmatrix aus dem Perichondrium ein, einer Faserschicht, die den Knorpel 6 umhüllt. Alternativ kann ein Anteil hypertrophischer Chondrozyten überleben und sich zu Osteoblasten7,8,9 transdifferenzieren. Die endgültige Länge des Knochens ist auf das angesammelte Wachstum des flüchtigen Knorpels zurückzuführen, dessen Wachstumsrate wiederum von der Anzahl und Größe der hypertrophen Chondrozyten und ihrer Matrixproduktion10 abhängt. Darüber hinaus wurde vor kurzem gezeigt, dass die Dauer der letzten Hypertrophie-Phase mit der letzten Länge des Knochens 11korreliert. Daher ist eine strenge Regulierung der Proliferation und Differenzierung dieser Zellen erforderlich, um die richtige Knochengröße zu gewährleisten.

Trotz des umfangreichen Wissens, das im Laufe der Jahre über die Organisation und Entwicklung der Wachstumsplatten erworben wurde, basieren die meisten dieser Schlussfolgerungen auf der Beobachtung von festen histologischen Abschnitten. Die Abtrennung von Gewebeabschnitten liefert wertvolle Informationen über diesen Prozess, kann aber mit technischen Artefakten geritten werden, so dass es nicht immer zuverlässig verwendet werden kann, um morphologische oder Größenänderungen zwischen verschiedenen Stadien zu schätzen. Da das Knochenwachstum ein dynamischer Prozess ist, bieten die statischen zweidimensionalen (2D) Bilder einen begrenzten Einblick in die Bewegung der Zellen in der Wachstumsplatte, während Zeitraffer-Abbildungen auf lebendem Gewebe wertvolle Informationen über das Verhalten der Chondrozyten in der Wachstumsplatte.

All diese Einschränkungen können mit Ex-vivo-Knochenkulturen gelöst werden. Während die Knochenkulturprotokolle schon vor einiger Zeit entwickelt wurden, wurden sie auf Murine-lange Knochen limitiert. Die meisten Studien verwenden die Kichererbse aufgrund der technischen Vorteile, die das Kickmodell 12^,13bietet. Organotypische Kulturen (air/liquide Schnittstelle) wurden auf schicke embryonale Oberschenkel angewendet, die 10 Tage lang in der Kulturgepflegt wurden 14. Die ausgeklügelten genetischen Werkzeuge, die in der Maus zur Verfügung stehen, machen dieses Modell sehr attraktiv, um in der ex vivo Knochenkultur verwendet werden. Die Studien, die Mäuse benutzten, um das Knochenwachstum^zuuntersuchen, arbeiteten hauptsächlich mit Metatarsal-Knochen 15, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Größeund größeren Anzahl pro Embryo 16. Obwohl traditionell als lange Knochen betrachtet, Metatarsi in die Seneszenz (gekennzeichnet durch reduzierte Vermehrung und Involvierung der Wachstumsplatte 17) früher als andere lange Knochen in vivo, und daher ihr kontinuierliches Wachstum ex vivo nicht Rechreibe der In-vivo-Prozess wirklich. Für die Zwecke dieses Artikels werden wir den Begriff lange Knochen für Knochen aus den Regionen der proximalen und mittleren Gliedmaßen verwenden. Mehrere frühere Studien verwendeten lange Murinknochen, wie Tibia, in Ex-vivo-Kulturen und beobachteten ein erhebliches Wachstum des Knorpels, aber wenig Verknöcherung 18. Wir haben in letzter Zeit auch tibiale Kulturen verwendet, vor allem, um die Chondrozyten-Dynamik^{zu studieren 19}. Andere Studien verwendeten Oberschenkelköpfe von jungen Mäusen 20 oder nur den distalen Teil des Oberschenkels für Kultur²¹. Einige neuere Arbeiten verbinden erfolgreich die ex vivo-Kultur der vollen Knochen mit Zeitraffer-Bildgebung, um dreidimensionale (3D) Filme von Chondrozyten im lebendenMausgewebe 22,23^zuerwerben. Den Autoren gelang es, bisher unbemerkte Ereignisse bei der Neuordnung der Chondrozyten in die proliferative Zone²³ zu beobachten, in einem guten Beispiel für die mögliche Anwendung der Knochen-Ex-vivo-Kultur. Die Alternative, also die Analyse statischer Bilder, erfordert indirekte und komplexe Techniken. Dies wurde durch eine aktuelle Studie veranschaulicht, die die Bedeutung von transversal orientierten Klonen für das Knorpelwachstum bewertet, bei der die genetische Verfolgung mit mehrfarbigen Reporter-Mausstämmen in Verbindung mit mathematischer Modellierung 24 verwendet wurde^. Daher könnte die ex vivo-Kultur dazu beitragen, schneller und unkomplizierter Einblicke in dynamische Prozesse zu gewinnen.

Hier stellen wir eine Methode zur Murine-Langknoch-Kultur vor, die mit verschiedenen molekularen Behandlungen und/oder mit Zeitraffer-Live-Bildgebung kombiniert werden kann. Dieses Protokoll passt die Methoden an, die in früheren Berichten^15,18,25verwendet werden, spricht aber einige zusätzliche Probleme an und konzentriert sich auf lange Knochen wie die Tibia und nicht auf metatarsale Knochen. Schließlich untersucht sie das Potenzial, statistisch starke Paßvergleiche zu verwenden, indem sie linke und rechte Knochen getrennt in Anwesenheit verschiedener Substanzen kultiviert.

Protokoll

Alle Experimente sollten nach den lokalen staatlichen und institutionellen Richtlinien des ethischen Umgangs mit Labortieren durchgeführt werden.

1. Vorbereitungen vor dem Tag der Knochenkultur

1. Richten Sie zeitliche Maus-Matratzen ein, um Föten und Welpen ab dem embryonalen Tag 14.5 (E14.5) und weiter zu erhalten.
   NOTE: Die Kultur der langen Knochen kann erfolgreich auf verschiedene Mausstämme angewendet werden; Im vorliegenden Protokoll werden übergezüchtete Schweizer Webster-Wildmäusen verwendet.
2. Bereiten Sie das Sektionsmedium vor (angepasst von Houston et al.¹⁵): Verdünnung des minimalen essenziellen Mediums (α-MEM) oder Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) in Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und 2 mg/mL Rinder-Serum Albumin (BSA) und Filtersterilize Durch einen Spritzfilter mit einem Durchmesser von 0,22 μm mit 33 mm. Aliquots bei-20 ° C aufbewahren.
3. Am Tag vor der Gewinnung der Föten, Bereiten Sie das serumfreie Knochenkulturmedium vor, das sich aus DMEM zusammensetzt, das 0,2% BSA, 0,5 mM L-Glutamin, 40 U/mL penicillin/streptomycin, 0,05 mg/mL Ascorbinsäure und 1 mM betaglycerophosphat enthält. Filtern Sie sterilisieren Sie durch einen 0,22 μm großen Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 33 mm und lagern Sie bis zu einem Monat bei 4 ° C.
4. Am Tag der Kultur und vor der Mäusekäge, bereiten 24-Brunnen-Teller und 60 mm Geschirr mit Sektionsmittel und halten sie eiskalt. Das Knochenkulturmedium in einem 37 ° C-Wasserbad vorwärmen. Spray 80% (v/v) Ethanol (Pinzette und kleine Schere), die für die Fötus-Handhabung verwendet werden. Übertragen Sie ein binokulares Geltungsbereich auf einen Biosicherheitsschrank der Klasse II.

2. Kultur von Fetus und Neugeborenen Tibia und Femur

1. Die schwangere Maus durch Gebärmutterhalskrebs in der gewünschten Gestationsphase (von E14.5 bis E18.5) kultivieren. Wenn neugeborene Welpen verwendet werden, entfernen Sie sie von der Mutter eine nach der anderen und keulen durch Enthauptungen.
2. Legen Sie die Maus auf ihren Rücken und sterilisieren Sie den Bauchbereich, indem Sie 80% (v/v) Ethanol auf ihre Oberfläche sprühen.
3. Schneiden Sie die Haut und den Bauchmuskel mit einer kleinen Schere, um auf die Gebärmutterhorne zuzugreifen.
4. Mit Pinzette und kleiner Schere die Gebärmutter aus der Bauchhöhle ziehen, das Mesometrium entfernen und die Basis der Hörner schneiden. Legen Sie die Gebärmutter in eine 60 mm Petrischale mit eiskaltem Trennmittel und halten Sie die Kulturschale während der gesamten Prozedur auf Eis.
5. Die Petrischale mit der Gebärmutter in den Biosicherheitsschrank übertragen und dort ab sofort arbeiten.
6. Trennen Sie einzelne Föten mit einer Schere, indem Sie zwischen den Säcken schneiden.
7. Übertragen Sie einzelne Sack unter einem Trennsteremikroskop in einer sauberen 60-mm-Schale mit Trennmittel und öffnen Sie sie mit Pinzetten, um die Föten von den Plazenta zu trennen und von Membranen zu reinigen.
   NOTE: Arbeiten Sie mit einem Embryo nach dem anderen, während Sie den Rest auf Eis halten.
8. Die Föten verdappen und den Körper auf eine saubere, neue 60-mm-Schale mit einer 1 ml geschnittenen Sterilpipette übertragen.
9. Entfernen Sie die Haut der Föten oder Welpen mit Pinzetten von hinten und schälen Sie sie bis zu den Zehen.
10. Die Hinterbeine vom Körper trennen, indem sie mit der Pinzette in der Nähe der Wirbelsäule schneiden und auf eine saubere Schüssel mit eiskaltem Trennmittel übertragen.
11. Trennen Sie die Tibia vom Oberschenkel mit Pinzette, indem Sie sie sorgfältig zwischen den Oberflächenknorpel von distalem Oberschenkel und proximaler Tibia einführen.
12. Entfernen Sie die Hüftknochen vom proximalen Oberschenkel und den Kalcaneus-Knochen und die Fibel aus der Tibia.
13. Entfernen Sie das weiche Gewebe vorsichtig aus dem Oberschenkel und der Tibia, indem Sie es abknacken und abziehen.
    NOTE: Es ist wichtig, so viel Weichteilgewebe wie möglich zu entfernen, wobei besonders darauf geachtet wird, das Gewebe zu entfernen, das die beiden Knorpelstmasten verbindet, aber die Beschädigung des Knorpels, des Perichondriums und der Knochen zu vermeiden.
14. Die vier Knochen (links und rechts Tibias und Oberschenkel) in den ersten Brunnen der 24-Brunnen-Platte mit einer Kunststoff-1 mL sterilen Pipette legen. Alternativ, um die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf den linken und rechten Gliedmaßen zu vergleichen, legen Sie kontralaterale Gliedmaßen in verschiedenen Brunnen.
    NOTE: Bei der Übergabe der Knochen auf die Brunnen sollte besonders darauf geachtet werden, da sie leicht an der Pipette haften können.
15. Gehen Sie mit so vielen Föten wie nötig auf die gleiche Weise vor.
    NOTE: Ändern Sie die Schüssel mit dem zertrennlichen Medium, sobald es zu bewölkt wird, da es wichtig ist, die zerschnittenen Knochen klar zu sehen.
16. Wenn alle gewünschten Knochen auf die Brunnen übertragen werden, entfernen Sie das Trennmedium mit einer Kunststoff-1 mL sterile Pipette und achten Sie besonders darauf, die Knochen nicht zu saugen.
    1. Je nach Zweck des Experiments können Bilder von den Knochen aufgenommen werden, bevor das Trennmedium entfernt wird, als Zeiterpunkt Null des Experiments. Machen Sie Fotos mit einem Mikroskop, das an einer Digitalkamera befestigt ist, und kommentieren Sie die Belichtung und die verwendete Skala. Um einfache und zuverlässige Messungen zu gewährleisten, fotografieren Sie mit gutem Kontrast, um den mineralisierten Teil zu unterscheiden.
17. Fügen Sie jedem Brunnen 1 ml Kulturmedium hinzu. Wenn eine Behandlung auf den Knochen (Doxycyclin, Tamoxifen, Wachstumsfaktoren, etc.) beabsichtigt ist, sollte sie jetzt hinzugefügt werden.
18. Um die Wirkung der Wachstumshemmung in den Kulturbedingungen zu beobachten, behandeln Sie die linken Tibien mit Retinosäure (RA, 500 nM), während Sie die rechte Tibien mit einem entsprechenden Fahrzeugvolumen inkubieren (Dimethylsulfoxid [DMSO], Endkonzentration 0,1%) Als Kontrolle.
19. Lassen Sie die Knochen für zwei Tage oder länger in einem Zellkultur-Inkubator unter normalen Bedingungen der Zellkultur wachsen (bei 37 ° C in einem 5% CO₂ Inkubator).
20. Um die Proliferation zu beurteilen, fügen Sie 5-Ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) oder 5-Bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) bei einer Endkonzentration von 10 μM 1 − 2 h vor der Fixierung in das Medium ein.
    NOTE: Die Lagerkonzentration der EdU beträgt 20 mM.
    CAUTION: EdU und BrdU sind thymidine Analoga und können giftig und mutagene sein.
21. Tauen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) und fixieren Sie die Knochen durch Eintauchen in PFA in einzelnen 2 mL Röhren.
    CAUTION: PFA ist giftig und als wahrscheinlicher menschlicher Karzinogen bezeichnet. Vermeiden Sie das Atmen von Paraformaldehyd-Pulver und Dämpfen. EdU und BrdU sind thymidine Analoga und können giftig und mutagene sein.
22. Nach einer kurzen 10-minütigen Fixierung in PFA bei Raumtemperatur, übertragen Sie Knochen an PBS für die Bildaufnahme zum Endzeitpunkt. Dann die Knochen wieder in den PFA legen, um sie über Nacht bei 4 ° C zu befestigen.
23. Nach der Fixierung können Knochen für gewünschte nachgelagerte Anwendungen verarbeitet werden.

3. Messung und Analyse der vollen Länge des Beinen und der Mineralienregion

1. Verwenden Sie eine Bildbearbeitungssoftware, um die Länge der Knochen zu messen, unter Berücksichtigung der Größe des Bildes. Messen Sie sowohl die Gesamtlänge des Knochens als auch die mineralisierte Region. Starten Sie die Messungen von den ersten dunklen Zellen an einem Ende bis zu den letzten am anderen Ende.
   NOTE: Die mineralisierte Region zeichnet sich durch die dunklere Farbe aus und unterscheidet sich leicht vom Knorpel.
2. Um die Wachstumsrate zu berechnen, die als durchschnittliche Zunahme der Länge pro Tag definiert wird, teilen Sie die Differenz zwischen der endgültigen Länge des Knochens und der ursprünglichen, durch die Anzahl der Tage in der Kultur.

Ergebnisse

Die Knochenkultur kann von verschiedenen Stufen aus durchgeführt werden. In Abbildung 1A-Dwird ein Vergleich zwischen kultivierter Tibia und frisch extrahierten in entsprechenden Stadien gezeigt. Die erste Beobachtung ist, dass bis zu zwei Tage Kultur die erreichte Größe mit dem in vivo Knochenwachstum sowohl für Knorpel als auch für mineralisierte Knochen vergleichbar ist (Abbildung 1A, B, D)

Diskussion

Die Methoden der Knochenkultur werden seit einiger Zeit verwendet, um die Biologie des Knochenwachstums 28zu beurteilen, wurden aber nur selten auf Murine-Langknochen angewendet. Mit der Entwicklung von bildgebenden Techniken bietet ex vivo Knochenkultur eine attraktive Möglichkeit, das Knochenwachstum in Echtzeit zu untersuchen, in einem Umfeld, das den In-vivo-Bedingungen sehr ähnlich ist. In diesem Szenario ist es wichtig, die Bedingungen zu definieren, unter denen das Wachstum der langen Kno...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2 incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T