Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler

Özet

Burada, hem fetal hem de yenidoğan aşamalarında uzun duvar kemiklerinin ex vivo kültürü için bir yöntem sunuyoruz, kontrollü koşullarda kemik ve kıkırdak gelişimini ve homeostazisini analiz etmek için uygun ve in vivo sürecini yeniden özetlemekteyiz.

Özet

Uzun kemikler karmaşık ve dinamik yapıları, bir kıkırdak ara yoluyla endokondral ossifikasyon ortaya çıkar. Sağlıklı insan kemiklerine sınırlı erişim, özellikle kemik büyümesi ve homeostasis farklı yönlerini bakmak için, fare ve sıçan gibi memeliler modellerinin kullanımı değerli hale getirir. Ayrıca, fareler içinde sofistike genetik araçların geliştirilmesi uzun kemik büyümesi daha karmaşık çalışmalar sağlar ve kemik büyümesini incelemek için kullanılan tekniklerin bir genişleme ister. Burada, ex vivo murine kemik kültürü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, bu da kemik ve kıkırdak araştırmasına sıkı kontrollü bir şekilde izin verirken, in vivo sürecinin çoğunu yeniden özetleyin. Tarif edilen yöntem, Tibia, femur ve Metatarsal kemikler de dahil olmak üzere bir dizi kemik kültürünü sağlar, ancak burada esas olarak tibial kültüre odaklanıyoruz. Dahası, zaman aşımı canlı görüntüleme veya ilaç tedavisi gibi diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir.

Giriş

Organ büyümesi, büyüme bozukluklarının görünümünü önlemek için sıkı bir şekilde ayarlanmalıdır ve vücudun farklı bölgelerinde birden fazla hücre tipi, moleküler yol ve Crosstalk düzenlenmesi içerir. Görüntüleme teknikleri, zaman içinde büyüyen bir embriyo içinde meydana gelen değişiklikleri ele almak için esastır, hem normal koşullarda, hem de bir pertürasyon sonra sistemde indüklenir. Yaygın olarak kullanılan kemirgen modelleri gibi intrauterin gelişimi ile embriyolar, ex vivo kültür tekniklerini kullanarak kısmen üstesinden gelebilmek için canlı görüntüleme ve ilaç tedavisi için ek bir zorluk sunar. İn vivo süreçlerin başarıyla reapitasyon ve anlamlı sonuçlar elde etmek için, her organ veya doku için doğru kültür koşullarını bulmak için çok önemli olur.

Memelinin iskelet çoğu kemikleri endokondral ossifikasyon ile büyür, burada embriyonik kıkırdak (kondrositler denilen hücrelerden oluşan) uzunlamasına büyüme sürücü ve kademeli olarak kemik değiştirilir. Bu süreç, üç bölge ayırt edilebilir uzun kemikler, sonunda bulunan büyüme plakaları, olur: dinlenme, proliferatif ve hipertrofik^1,2. İlk olarak, dinlenme bölgesinde yuvarlak progenitör kondositler proliferatif bölgede bisiklet sütunlu kondositler içine geçiş. Farklılaşma bir sonraki aşamasında, bu kondrositler hipertrofik haline gelir ve tip X kollajen salgıcı başlar. Hipertrofik kondrositler ossifikasyon sonraki adımlarını düzenler: Bunlar bağlantı dokusu büyüme faktörü, kemik morfogenetik proteinler ve Hint kirpi gibi anahtar sinyalizasyon moleküllerini salgılaştırır ve matrisin mineralizasyonu doğrudan, işe kemiğin orta kısmına kan damarlarının, ve, apoptozis üzerine, osteoblastlar izin (kemik şekillendirme hücreleri) Primer ossifikasyon merkezi oluşturmak için matris istila etmek^3,4. Mineralize matris, Osteoblastların bir kemik matrisiyle bu bozulmuş kıkırdak yerine göç ettiği kan damarlarının nüfuz etmesini kolaylaştırır⁵. Çoğu osteoblastlar perikhondrium kıkırdak matris istila, kıkırdak sarar fibröz bir tabaka⁶. Alternatif olarak, hipertrofik kondrositlerin bir oranı, osteoblastlar^7,8,9' a karşı hayatta kalabilecektir. Kemiğin son uzunluğu, büyüme oranı hipertrofik kondrositlerin sayısına ve boyutuna ve matris üretimini¹⁰' a bağlı olan geçici kıkırdak birikiminin kaynaklanmaktadır. Ayrıca, son hipertrofisi aşamasının süresinin, kemik¹¹' in son uzunluğu ile ilişkili olduğu son zamanlarda gösterildi. Bu nedenle, uygun kemik boyutunu sağlamak için bu hücrelerin proliferasyonu ve farklılaşma sıkı düzenleme gereklidir.

Büyüme plakalarının örgütlenmesi ve geliştirilmesi konusunda yıl içinde elde edilen önemli bilgiye rağmen, bu sonuçların çoğu sabit histolojik bölümlerin gözlemlenmesi üzerine kuruludur. Doku bölümleme bu süreç hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak teknik eserler ile basılabilir, bu nedenle her zaman güvenilir farklı aşamaları arasında morfolojik veya boyutu değişiklikleri tahmin etmek için kullanılamaz. Ayrıca, kemik büyümesi dinamik bir süreçtir, statik iki boyutlu (2D) görüntüler büyüme plakasında hücrelerin hareketi içine sınırlı bir anlayış sunar, canlı doku zaman atlamalı görüntüleme davranışı hakkında değerli bilgiler sunabilir iken kondrocytes büyüme plakası.

Tüm bu sınırlamalar ex vivo kemik kültürlerini kullanarak potansiyel olarak çözülebilir. Kemik kültürü protokolleri bir süre önce geliştirilirken, duvar uzun kemiklere sınırsız olarak uygulanmıştır. Çalışmaların çoğu Chick modeli^12,13tarafından sunulan teknik avantajları nedeniyle civciv kemikleri kullanın. Organotypic kültürler (hava/sıvı arayüz), 10 gün¹⁴için kültürde tutulan Chick embriyonik femurs, uygulandı. Mouse 'ta bulunan sofistike genetik araçlar bu modeli ex vivo kemik kültüründe kullanılmak üzere çok cazip hale getirmek. Fareler kemik büyümesi bakmak için kullanılan çalışmalar Metatarsal kemikler ile çoğunlukla çalıştı¹⁵, muhtemelen küçük boyutu ve daha büyük sayılar embriyo başına elde nedeniyle¹⁶. Geleneksel olarak uzun kemikler olarak kabul rağmen, metatarsi (azalan proliferasyon ve büyüme plakası¹⁷) daha önce diğer uzun kemikler içinde vivo ile karakterize ve bu nedenle sürekli büyüme ex vivo değil, yaşlanma girin Gerçekten in vivo süreci özetlemek. Bu makalenin amaçları için, proksimal ve ara ekstremite bölgelerden kemikler için uzun kemikler terimi kullanacağız. Birkaç önceki çalışmalar, Tibia gibi uzun murine kemikleri, ex vivo kültürlerde kullanılan ve kıkırdak ama küçük ossifikasyon önemli bir büyüme gözlenen¹⁸. Ayrıca son zamanlarda, özellikle kondrosit dinamikleri¹⁹çalışma tibial kültürler kullanılır. Diğer çalışmalar genç fareler²⁰ ya da sadece kültür²¹için femur distal kısmı femoral kafaları kullandı. Bazı daha yeni eserler başarıyla üç boyutlu (3D) kondrocytes filmleri canlı fare dokusu^22,23elde etmek için zaman atlamalı görüntüleme ile tam kemik ex vivo kültürü birleştirir. Yazarlar, kemik ex vivo kültürünün potansiyel uygulama iyi bir örnek proliferatif bölge²³ kondrositlerin yeniden düzenlenmesi daha önce fark edilmemiş olayları gözlemlemek başardı. Alternatif, yani, statik görüntüleri analiz, dolaylı ve karmaşık teknikler gerektirir. Bu kıkırdak büyüme için transversally odaklı klonlar önemini değerlendirmek son bir çalışma tarafından örneklenmiştir, matematiksel modelleme ile birleştiğinde çok renkli muhabir fare suşları ile genetik izleme kullanıldı²⁴. Bu nedenle, ex vivo kültür daha hızlı ve daha basit bir şekilde dinamik süreçlere anlayış elde etmenize yardımcı olabilir.

Burada, farklı moleküler tedaviler ve/veya zaman aşımı canlı görüntüleme ile kombine edilebilir murine uzun kemikler kültürü için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol^15,18,25önceki raporlarda kullanılan yöntemleri uyarlar, ancak bazı ek sorunları giderir ve uzun kemikler gibi Tibia, Metatarsal kemikler yerine odaklanır. Son olarak, farklı maddelerin varlığını ayrı olarak sol ve sağ kemikler kültür tarafından istatistiksel olarak güçlü eşleştirilmiş karşılaştırmalar kullanma potansiyelini araştırıyor.

Protokol

Tüm deneyler, Laboratuvar hayvanlarının etik olarak işlenmesi için yerel hükümet ve kurumsal yönergelerin ardından yapılmalıdır.

1. kemik kültürü gününden önce preparatlar

1. Embriyonik gün 14,5 (E 14.5) ve daha sonra fetus ve pups elde etmek için zamanlanmış fare matings ayarlayın.
   Not: Uzun kemikler kültürü farklı fare suşları için başarıyla uygulanabilir; Mevcut protokolde, Isviçre Webster vahşi tip fareler dışarı kullanılır.
2. Diseksiyon ortamını hazırlayın (Houston ve al.¹⁵' ten uyarlanmıştır): seyreltmeli α-asgari esansiyel Orta (α-mem) veya Dulbecco 'Nun modifiye kartal Orta (dmem) 1/13 fosfat-tamponlu tuz (PBS) ve 2 mg/ml Sığır serum albümin (BSA) ve filtre sterilize 0,22 μm, 33 mm çapında şırınga filtresi ile. Alquots-20 °C ' de saklayın.
3. Fetüsleri çıkarmadan önceki gün, 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutamin, 40 U/mL penisilin/streptomisin, 0,05 mg/mL askorbik asit ve 1 mM betaglycerophosphate içeren DMEM 'den oluşan serum içermeyen kemik kültürü ortamını hazırlayın. 0,22 μm, 33 mm çapında şırınga filtresi ve 1 aya kadar 4 °C ' de muhafaza edilen filtre sterilize edilir.
4. Kültür günü ve fare dağılmadan önce, 24-kuyu plakaları hazırlamak ve 60 mm yemek diseksiyon orta ve onları buz soğuk tutmak. 37 °C ' lik su banyosunda kemik kültürü ortamını ısıtın. Sprey 80% (v/v) etanol (cımbız ve küçük makas), fetus işleme için kullanılacak araçlar üzerinde. Bir sınıf II Biyogüvenlik kabinine dürbün kapsamını aktarın.

2. fetus ve yenidoğan Tibia ve femur kültürü

1. İstenen Gestasyonel aşamada servikal çıkığı ile hamile fare Cull (e 14.5 den e 18.5 kadar). Eğer yenidoğan yavruları kullanılırsa, onları annenden tek tek çıkarın ve deptitasyon ile itlaf.
2. Fareyi arkasına yerleştirin ve yüzeyinde% 80 (v/v) etanol püskürterek abdominal bölgeyi sterilize edin.
3. Uterin boynuzları erişmek için küçük makas ile cilt ve karın kası kes.
4. Rahim, cımbız ve küçük makas yardımıyla Karın boşluğundan ayıklayın, mezometriumu kaldırarak ve boynuzların tabanı kesme. Rahim bir 60 mm Petri çanak buz-soğuk diseksiyon orta ile yerleştirin ve tüm prosedür sırasında buz üzerinde kültür çanak tutmak.
5. Biyolojik güvenlik kabinine rahim ile Petri tabağı aktarın ve şu andan itibaren orada çalışın.
6. Saclar arasında kesim yaparak bireysel fetüsleri makas ile ayırın.
7. Diseksiyon orta ile temiz bir 60 mm çanak bir diseksiyon mikroskoptan altında bireysel sac transfer ve plasentas fetüsleri ayırmak ve membranlar onları temizlemek için cımbız ile açın.
   Not: Geri kalanı buzda tutarken, bir defada bir embriyo ile çalışın.
8. Fetüsleri kesip temizleyin ve vücudu 1 mL kesilmiş steril pipet ile temiz yeni 60 mm tabak ile aktarın.
9. Geri başlayarak cımbız ile fetüslerin veya pups cilt çıkarın ve ayak parmakları kadar soyulmuş.
10. Omurgaya yakın cımbız ile kesme ve buz-soğuk diseksiyon orta ile temiz bir çanak onları aktarmak bedeninden hindekstremite ayırın.
11. Distal femur ve proksimal tibia yüzey kıkırdağı arasında dikkatle tanıtmak tarafından cımbız ile femur gelen Tibia ayırın.
12. Proksimal femur ve kalkaneus kemik ve Tibia gelen fibula kalça kemikleri çıkarın.
13. Dikkatlice femur ve Tibia dan kıstırma ve çekerek yumuşak doku çıkarın.
    Not: Mümkün olduğunca çok yumuşak doku kaldırmak için önemlidir, iki kıkırdak direkleri bağlayan doku kaldırma özel bakım alarak, ama kıkırdak zarar kaçınarak, perichondrium, ve kemikler.
14. Plastik 1 ml steril pipet ile 24 kuyu plakasının ilk kuyusu içinde dört kemiği (sol ve sağ kaval ve femurs) yerleştirin. Alternatif olarak, sol ve sağ ekstremitelerde farklı tedavilerin etkisini karşılaştırmak için, farklı kuyularda kontralateral ekstremite yerleştirin.
    Not: Kemikleri kuyulara aktarıldığında ekstra bakım alınmalıdır, böylece pipet kolayca yapışabilir.
15. Gerektiğinde birçok Fetüslerle aynı şekilde devam edin.
    Not: Açıkça disseke kemikler görmek önemli olduğu gibi, çok bulutlu alır en kısa sürede diseksiyon orta ile çanak değiştirin.
16. İstenilen tüm kemikler kuyulara aktarıldığında, diseksiyon ortamını plastik 1 ml steril pipet ile çıkarın ve kemikleri Aspire değil, ekstra özen yapın.
    1. Deneme amacına bağlı olarak, denemenin timepoint sıfır olarak diseksiyon orta çıkarmadan önce resimler kemikler alınabilir. Dijital kameraya bağlı bir mikroskop ile fotoğraf çekin ve kullanılan pozlama ve ölçek ek açıklama ekleyin. Kolay ve güvenilir ölçümler sağlamak için, mineralize parçayı ayırt etmek için iyi kontrast içeren resimler çekin.
17. Her iyi kültür orta 1 mL ekleyin. Herhangi bir tedavi kemikler (Doksisiklin, tamoksifen, büyüme faktörleri, vb) üzerinde tasarlanmıştır, şimdi eklenmesi gerekir.
18. Kültür koşullarında büyüme inhibisyonu etkisini gözlemlemek için, retinoik asit (ra, 500 Nm) ile sol kaval tedavi, araç eşdeğer bir hacim ile doğru tifite inkükleme sırasında (dimetil sülfoxid [DMSO], nihai konsantrasyon 0,1%) bir kontrol olarak.
19. Standart hücre kültürü koşullarında (37 °C ' de% 5 CO₂ kuluçta) bir hücre kültürü kuluçta iki gün veya daha fazla büyümek için kemikleri bırakın.
20. Proliferasyon değerlendirmek için, 5-etynyl-2'-deoxyuridine (EdU) veya 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) orta 10 μM 1 − 2 h son konsantrasyonda, fiktasyon önce ekleyin.
    Not: EdU 'nın stok konsantrasyonu 20 mM 'dir.
    Dikkat: EdU ve BrdU, timidin analogları ve toksik ve mutajisik olabilir.
21. Çözülme 4% paraformaldehit (PFA) ve bireysel 2 mL tüplerde PFA daldırma tarafından kemikleri düzeltin.
    Dikkat: PFA toksik ve olası bir insan kanserojen olarak belirlenir. Civarında formaldehite tozu ve buharları nefes kaçının. EdU ve BrdU, timidin analogları ve toksik ve mutajisik olabilir.
22. Oda sıcaklığında PFA 'da kısa bir 10 dk sabitleme sonrasında, son zaman noktasında resim edinme için kemikleri PBS 'ye aktarın. Sonra 4 °C ' de gece sabitleme için kemikleri PFA 'ya geri yerleştirin.
23. Sabitleme kemikleri istenen akış uygulamaları için işlenebilir sonra.

3. kemik ve mineralize bölgenin tam uzunluğunun ölçülmesi ve Analizi

1. Görüntünün ölçeğini dikkate alarak, kemiklerin uzunluğunu ölçmek için bir görüntü düzenleme yazılımı kullanın. Kemik ve mineralize bölgenin toplam uzunluğunu ölçün. İlk karanlık hücrelerdeki ölçümleri, diğer ucunda son olanlar kadar bir ucunda başlatın.
   Not: Mineralize bölge koyu renk ile karakterize ve kolayca kıkırdak ayırt edilir.
2. Büyüme hızını hesaplamak için, günlük uzunluğu ortalama artış olarak tanımlanan, kemik son uzunluğu ve ilk bir kültür gün sayısı arasındaki farkı bölmek.

Sonuçlar

Kemik kültürü farklı aşamalardan başlayarak yapılabilir. Şekil 1a-D, kültürlü Tibia ve eşdeğer aşamalarında taze çıkarılan olanlar arasında bir karşılaştırma gösterilir. İlk gözlem, elde edilen iki günlük kültürün, hem kıkırdak hem de mineralize kemik (Şekil 1a, B, D) için in vivo kemik büyümesi ile karşılaştırılabilir olması. Daha uzun kültür dönemle...

Tartışmalar

Kemik ex vivo kültür yöntemleri, kemik büyümesi²⁸biyolojisi değerlendirmek için bir süre kullanılmıştır, ancak nadiren murine uzun kemikler uygulanmıştır. Görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi ile ex vivo kemik kültürü, in vivo koşullarına yakından benzeyen bir ortamda kemik büyümesini gerçek zamanlı olarak incelemek için cazip bir yol sunar. Bu senaryoda, uzun kemiklerin büyümesini in vivo kendi büyüme karşılaştırılabilir koşulları tanımlamak önemlidi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2 incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T