Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo per la coltura ex vivo di ossa lunghe murine sia a stadi fetali che neonati, adatto per l'analisi dello sviluppo osseo e della cartilagine e dell'omeostasi in condizioni controllate, ricapitolando il processo in vivo.

Abstract

Le ossa lunghe sono strutture complesse e dinamiche, che derivano dall'ossificazione endocondrale attraverso una cartilagine intermedia. L'accesso limitato a ossa umane sane rende particolarmente prezioso l'uso di modelli di mammiferi, come topo e ratto, per esaminare diversi aspetti della crescita ossea e dell'omeostasi. Inoltre, lo sviluppo di sofisticati strumenti genetici nei topi consente studi più complessi di crescita ossea lunga e richiede un'espansione delle tecniche utilizzate per studiare la crescita ossea. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura ossea ex vivo murina, che consente lo studio dell'osso e della cartilagine in modo strettamente controllato, ricapitolando la maggior parte del processo in vivo. Il metodo descritto permette la coltura di una gamma di ossa, tra cui tibia, femore, e ossa metatarsali, ma ci siamo concentrati principalmente sulla cultura tibiale qui. Inoltre, può essere utilizzato in combinazione con altre tecniche, come l'imaging Live time-lapse o il trattamento farmacologico.

Introduzione

La crescita degli organi deve essere strettamente sintonizzata per prevenire la comparsa di disturbi della crescita, e coinvolge la regolazione di diversi tipi di cellule, vie molecolari e crosstalk tra diverse parti del corpo. Le tecniche di imaging sono essenziali per affrontare i cambiamenti che si verificano nel corso del tempo in un embrione in crescita, sia in condizioni normali, così come dopo una perturbazione è indotta nel sistema. Gli embrioni con sviluppo intrauterino, come i modelli di roditori ampiamente utilizzati, presentano una sfida aggiuntiva per l'imaging dal vivo e il trattamento farmacologico, che può essere parzialmente superato utilizzando tecniche di coltura ex vivo. Per ricapitolare con successo i processi in vivo e ottenere risultati significativi, diventa cruciale trovare le giuste condizioni di coltura per ogni organo o tessuto.

La maggior parte delle ossa dello scheletro dei mammiferi crescono attraverso l'ossificazione endocondrale, dove la cartilagine embrionale (composta da cellule chiamate condrociti) spinge la crescita longitudinale e viene gradualmente sostituita dall'osso. Questo processo avviene alle piastre di crescita, situate alla fine delle ossa lunghe, dove si distinguono tre zone: riposo, proliferativo e ipertrofico^1,2. In primo luogo, i condrociti progenitrici rotondi nella zona di riposo transitano nei condrociti colonnari ciclistici nella zona proliferativa. Durante la successiva fase di differenziazione, questi condrociti diventano ipertrofici e iniziano a secchire il collagene di tipo X. I condrociti ipertrofici orchestrano le fasi successive di ossificazione: secernono molecole di segnalazione chiave, come il fattore di crescita del tessuto connettivo, le proteine morfogenetiche ossee e il riccio indiano, e dirigono la mineralizzazione della matrice, reclutano vasi sanguigni alla parte centrale dell'osso, e, su apoptosi, consentire osteoblasti (cellule che formano ossa) per invadere la matrice per formare il centro di ossificazione primaria^3,4. La matrice mineralizzata facilita la penetrazione dei vasi sanguigni attraverso i quali gli osteoblasti migrano per sostituire questa cartilagine degradata con una matrice ossea⁵. La maggior parte degli osteoblasti invade la matrice cartilaginea dal perichdri, uno strato fibusto che avvolge la cartilagine⁶. In alternativa, una proporzione di condrociti ipertrofici è in grado di sopravvivere e di trasdifferenziarsi agli osteoblasti^7,8,9. La lunghezza finale dell'osso è dovuta alla crescita accumulata della cartilagine transitoria, il cui tasso di crescita a sua volta dipende dal numero e dalle dimensioni dei condrociti ipertrofici e dalla loro produzione di matrici¹⁰. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la durata dell'ultima fase dell'ipertrofia è correlata alla lunghezza finale dell'osso¹¹. Pertanto, è necessaria una stretta regolazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule per garantire la corretta dimensione ossea.

Nonostante le conoscenze sostanziali acquisite nel corso degli anni sull'organizzazione e lo sviluppo delle piastre di crescita, la maggior parte di queste conclusioni si basano sull'osservazione delle sezioni istologiche fisse. Il sezionamento dei tessuti fornisce informazioni preziose su questo processo, ma può essere guidato con artefatti tecnici, quindi non può essere sempre utilizzato in modo affidabile per stimare i cambiamenti morfologici o dimensionali tra le diverse fasi. Inoltre, poiché la crescita ossea è un processo dinamico, le immagini statiche bidimensionali (2D) offrono una visione limitata del movimento delle cellule nella piastra di crescita, mentre l'imaging time-lapse sul tessuto vivo potrebbe offrire informazioni preziose sul comportamento del condrociti nella piastra di crescita.

Tutte queste limitazioni possono essere potenzialmente risolte utilizzando colture ossee ex vivo. Mentre i protocolli di coltura ossea sono stati sviluppati qualche tempo fa, sono stati limitatamente applicati alle ossa lunghe murine. La maggior parte degli studi usa le ossa delle pollastrelle a causa dei vantaggi tecnici offerti dal pulcino modello^12,13. Le colture organotipiche (interfaccia aria/liquido) sono state applicate ai femori embrionali di pulcino, che sono stati mantenuti in coltura per 10 giorni¹⁴. I sofisticati strumenti genetici disponibili nel topo rendono questo modello molto attraente per essere utilizzato nella coltura ossea ex vivo. Gli studi che hanno usato i topi per esaminare la crescita ossea hanno funzionato principalmente con le ossa metatarsali¹⁵, probabilmente a causa delle loro piccole dimensioni e dei numeri maggiori ottenuti per embrione¹⁶. Sebbene tradizionalmente considerate ossa lunghe, metatarsi entrano in senescenza (caratterizzata da ridotta proliferazione e involuzione della piastra di crescita¹⁷) prima di altre ossa lunghe in vivo, e quindi la loro continua crescita ex vivo non davvero ricapitolare il processo in vivo. Ai fini di questo articolo, useremo il termine ossa lunghe per le ossa delle regioni degli arti prossimali e intermedie. Diversi studi precedenti hanno usato ossa lunghe murine, come la tibia, in colture ex vivo e osservato una crescita sostanziale della cartilagine, ma poca ossificazione¹⁸. Abbiamo anche usato le colture tibiali recentemente, principalmente per studiare la dinamica dei condrociti¹⁹. Altri studi hanno usato teste femorali da giovani topi²⁰ o solo la parte distale del femore per la cultura²¹. Alcune opere più recenti combinano con successo la cultura ex vivo di ossa piene con imaging time-lapse per acquisire film tridimensionali (3D) di condrociti nel tessuto vivente del topo^22,23. Gli autori sono riusciti ad osservare eventi precedentemente inosservati nel riarrangiamento dei condrociti alla zona proliferativa²³ in un buon esempio della potenziale applicazione della coltura ossea ex vivo. L'alternativa, cioè l'analisi delle immagini statiche, richiede tecniche indirette e complesse. Questo è stato esemplificato da un recente studio che ha valutato l'importanza di cloni orientati alla trasversalmente per la crescita della cartilagine, dove il tracciamento genetico con ceppi di topo reporter multicolore accoppiato con la modellazione matematica sono stati utilizzati²⁴. Pertanto, la cultura ex vivo potrebbe contribuire a ottenere informazioni sui processi dinamici in modo più rapido e diretto.

Qui, presentiamo un metodo per la cultura ossea lunga murina, che può essere combinata con diversi trattamenti molecolari e/o con Time-lapse Live Imaging. Questo protocollo adatta i metodi utilizzati nelle precedenti relazioni^15,18,25, ma affronta alcuni problemi aggiuntivi e si concentra su ossa lunghe come la tibia, piuttosto che le ossa metatarsali. Infine, Esplora il potenziale dell'utilizzo di confronti associati statisticamente potenti Culturando le ossa sinistra e destra separatamente in presenza di diverse sostanze.

Protocollo

Tutti gli esperimenti devono essere svolti seguendo le linee guida governative e istituzionali locali di manipolazione etica degli animali da laboratorio.

1. preparativi prima del giorno della coltura ossea

1. Impostare le accoppiamenti temporizzate del mouse per ottenere feti e cuccioli dal giorno embrionale 14,5 (e 14.5) e successivi.
   Nota: La cultura delle ossa lunghe può essere applicata con successo a diversi ceppi di topo; nel presente protocollo vengono utilizzati topi wild-type svizzeri di tipo Webster.
2. Preparare il mezzo di dissezione (adattato da Houston et al.¹⁵): diluire α-minimo il mezzo essenziale (α-MEM) o il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (dmem) 1/13 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) e sterilizzare il filtro attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm, 33 mm di diametro. Conservare le aliquote a-20 ° c.
3. Il giorno prima dell'estrazione dei feti, preparare il mezzo di coltura ossea privo di siero composto da DMEM contenente 0,2% BSA, 0,5 mM L-Glutammina, 40 U/mL penicillina/streptomicina, 0,05 mg/mL di acido ascorbico e 1 mM di betaglicofosfato. Filtrare sterilizzare attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm, 33 mm di diametro e conservare a 4 ° c per un massimo di 1 mese.
4. Il giorno della cultura e prima dell'abbattimento del topo, preparate piatti da 24 pozzetti e 60 mm con mezzo di dissezione e mantenete il ghiaccio freddo. Preriscaldare il terreno di coltura ossea in un bagnomaria a 37 ° c. Spray 80% (v/v) etanolo sugli attrezzi (pinzette e piccole forbici) da utilizzare per la manipolazione del feto. Trasferire un mirino binoculare ad un armadietto di biosicurezza di classe II.

2. cultura del feto e neonato tibia e femore

1. Cull il topo incinta attraverso la lussazione cervicale alla fase gestazionale desiderata (che vanno da E 14.5 a E 18.5). Se vengono utilizzati cuccioli neonati, rimuoverli dalla madre uno per uno e Cull da decapitazione.
2. Posizionare il mouse sulla schiena e sterilizzare la regione addominale spruzzando 80% (v/v) di etanolo sulla sua superficie.
3. Tagliare la pelle e il muscolo addominale con piccole forbici per accedere alle corna uterina.
4. Estrarre l'utero dalla cavità addominale con l'aiuto di pinzette e piccole forbici, rimuovendo il Mesometrio e tagliando la base delle corna. Posizionare l'utero in una piastra di Petri da 60 mm con un mezzo di dissezione ghiacciato e mantenere il piatto di coltura sul ghiaccio durante l'intera procedura.
5. Trasferire la capsula di Petri con l'utero nel mobile di biosicurezza e lavorare lì da ora in poi.
6. Separare i singoli feti con le forbici tagliando tra le sacche.
7. Trasferire il sacco individuale sotto uno stereomicroscopio di dissezione in un piatto pulito da 60 mm con mezzo di dissezione e aprirli con delle pinzette per separare i feti dai placenta e pulirlo dalle membrane.
   Nota: Lavorare con un embrione alla volta, mantenendo il resto sul ghiaccio.
8. Decapitate i feti e trasferite il corpo a un nuovo piatto 60 mm pulito con una pipetta sterile tagliata da 1 mL.
9. Rimuovere la pelle dei feti o cuccioli con pinzette a partire dalla parte posteriore e staccarlo fino alle dita dei piedi.
10. Separare gli arti posteriori dal corpo tagliando con le pinzette vicino alla colonna vertebrale e trasferirli in un piatto pulito con mezzo di dissezione ghiaccio-freddo.
11. Separare la tibia dal femore con le pinzette, introducendole con attenzione tra la cartilagine superficiale del femore distale e la tibia prossimale.
12. Rimuovere le ossa dell'anca dal femore prossimale e l'osso del calcagno e la fibula dalla tibia.
13. Rimuovere con cautela il tessuto molle dal femore e la tibia da nipping e tirando fuori.
    Nota: È importante rimuovere quanto più tessuto molle possibile, facendo particolare attenzione a rimuovere il tessuto che collega i due pali della cartilagine, ma evitando di danneggiare la cartilagine, il perichdri, e le ossa.
14. Posizionare le quattro ossa (tibia e femori sinistra e destra) nel primo pozzo della piastra 24-Well con una pipetta sterile in plastica da 1 ml. In alternativa, per confrontare l'effetto di diversi trattamenti sugli arti sinistro e destro, posiziona gli arti controlaterali in pozzi diversi.
    Nota: Prestare maggiore attenzione quando le ossa vengono trasferite ai pozzi, in quanto possono facilmente aderire alla pipetta.
15. Procedere allo stesso modo con il maggior numero di feti se necessario.
    Nota: Cambiare il piatto con il mezzo di dissezione non appena diventa troppo offuscato, in quanto è importante vedere chiaramente le ossa dissezionate.
16. Quando tutte le ossa desiderate vengono trasferite ai pozzi, rimuovere il mezzo di dissezione con una pipetta sterile in plastica da 1 mL e prestare attenzione a non aspirare le ossa.
    1. A seconda dello scopo dell'esperimento, le immagini possono essere scattate delle ossa prima di rimuovere il mezzo di dissezione, come punto zero dell'esperimento. Scattare foto con un microscopio collegato a una fotocamera digitale e annotare l'esposizione e la scala utilizzata. Per garantire misurazioni semplici e affidabili, scattare foto con un buon contrasto per distinguere la parte mineralizzata.
17. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a ogni pozzo. Se qualsiasi trattamento è destinato alle ossa (doxiciclina, tamoxifene, fattori di crescita, ecc.), dovrebbe essere aggiunto ora.
18. Per osservare l'effetto dell'inibizione della crescita nelle condizioni di coltura, trattare la tibia sinistra con acido retinoico (RA, 500 Nm), mentre incubando la tibia destra con un volume equivalente di veicolo (dimetilsolfossido [DMSO], concentrazione finale 0,1%) come un controllo.
19. Lasciare che le ossa crescano per due giorni o più in un incubatore di colture cellulari in condizioni di coltura cellulare standard (a 37 ° c in un incubatore 5% CO₂ ).
20. Per valutare la proliferazione, aggiungere 5-ethynyl-2'-deossiuridina (EdU) o 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) al fluido ad una concentrazione finale di 10 μM 1 − 2h prima della fissazione.
    Nota: La concentrazione di stock di EdU è di 20 mM.
    Attenzione: EdU e BrdU sono analoghi della timidina e possono essere tossici e mutageni.
21. Scongelare 4% paraformaldeide (PFA) e fissare le ossa per immersione in PFA in singoli tubi da 2 mL.
    Attenzione: PFA è tossico e designato come un probabile cancerogeno umano. Evitare di respirare la polvere e i vapori di paraformaldeide. EdU e BrdU sono analoghi della timidina e possono essere tossici e mutageni.
22. Dopo una breve fissazione di 10 minuti in PFA a temperatura ambiente, trasferire le ossa in PBS per l'acquisizione di immagini al punto finale. Poi riposiziona le ossa in PFA per il fissaggio notturno a 4 ° c.
23. Dopo che le ossa di fissazione possono essere elaborate per le applicazioni downstream desiderate.

3. misurazione e analisi dell'intera lunghezza dell'osso e della regione mineralizzata

1. Utilizzare un software di editing di immagini per misurare la lunghezza delle ossa, tenendo conto della scala dell'immagine. Misurare sia la lunghezza totale dell'osso e la regione mineralizzata. Avviare le misurazioni dalle prime celle scure ad una estremità fino a quelle dell'ultimo all'altra estremità.
   Nota: La regione mineralizzata è caratterizzata dal colore più scuro e si distingue facilmente dalla cartilagine.
2. Per calcolare il tasso di crescita, definito come l'aumento medio di lunghezza al giorno, dividere la differenza tra la lunghezza finale dell'osso e quella iniziale per il numero di giorni in coltura.

Risultati

La coltura ossea può essere eseguita partendo da diverse fasi. Nella Figura 1a-D, viene mostrato un confronto tra la tibia coltivata e quelle appena estratte in fasi equivalenti. La prima osservazione è che fino a due giorni di cultura le dimensioni raggiunte sono paragonabili alla crescita ossea in vivo sia per la cartilagine che per l'osso mineralizzato (Figura 1a, B, D). Periodi di coltura p...

Discussione

I metodi di coltura ossea ex vivo sono stati usati per un certo tempo per valutare la biologia della crescita ossea²⁸, ma sono stati raramente applicati alle ossa lunghe murine. Con lo sviluppo di tecniche di imaging, la coltura ossea ex vivo offre un modo attraente per studiare la crescita ossea in tempo reale in un ambiente che assomiglia strettamente alle condizioni in vivo. In questo scenario, è importante definire le condizioni in cui la crescita delle ossa lunghe è paragonabile alla loro c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2 incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T