胎儿和新生儿小鼠长骨的培养与测量

摘要

在这里, 我们提出了一种方法, 在胎儿和新生儿阶段的长小鼠骨骼的体外培养, 适用于分析骨骼和软骨的发展和稳态在受控条件下, 同时重述体内过程。

摘要

长骨是复杂而动态的结构, 通过软骨中间体进行软骨内骨化。获得健康的人体骨骼的机会有限, 使得使用哺乳动物模型 (如小鼠和大鼠) 来研究骨骼生长和稳态的不同方面特别有价值。此外, 在小鼠身上开发复杂的遗传工具, 可以对长骨生长进行更复杂的研究, 并要求扩大用于研究骨骼生长的技术。在这里, 我们提出了一个详细的方案, 为体内小鼠骨培养, 允许研究骨和软骨在严格控制的方式, 同时重述大部分的体内过程。所描述的方法允许培养一系列的骨骼, 包括胫骨、股骨和掌骨, 但我们主要集中在胫骨培养。此外, 它还可与其他技术结合使用, 如延时实时成像或药物治疗。

引言

器官生长必须进行严格调整, 以防止生长障碍的出现, 并涉及调节多种细胞类型, 分子途径和身体不同部位之间的串扰。成像技术对于解决在正常条件下以及系统中引起扰动后在生长中的胚胎中随着时间的推移而发生的变化至关重要。宫内发育的胚胎, 如广泛使用的啮齿类动物模型, 对活体成像和药物治疗提出了额外的挑战, 可以通过使用体外培养技术来部分克服这些挑战。要成功地重述体内过程并获得有意义的结果, 为每个器官或组织找到正确的培养条件变得至关重要。

哺乳动物骨骼的大部分骨骼是通过软骨内骨化生长的, 胚胎软骨 (由称为软骨细胞的细胞组成) 推动纵向生长, 并逐渐被骨骼所取代。这个过程发生在生长板, 位于长骨的末端, 在那里可以区分三个区域: 休息, 增殖, 和肥厚^1,2。首先, 休眠区的圆形祖细胞软骨细胞过渡到增殖区的循环柱状软骨细胞。在分化的下一个阶段, 这些软骨细胞变得肥厚, 并开始分泌 x 型胶原蛋白。肥厚软骨细胞组织骨化的后续步骤: 他们分泌关键的信号分子, 如结缔组织生长因子, 骨形态蛋白和印度刺猬, 并指导成矿基质, 招募血管到骨骼的中心部分, 并在凋亡时, 允许成骨细胞 (形成骨的细胞) 侵入基质, 形成原发骨化中心 3^,4。矿化基质促进血管的渗透, 成骨细胞通过血管迁移, 用骨基质⁵取代这种退化的软骨。大多数成骨细胞从周长 (包裹软骨的纤维层) 侵入软骨基质^.另外, 有一部分肥厚软骨细胞能够存活并转化为^{成骨细胞 7,8,9}。骨骼的最终长度是由于短暂软骨的累积生长, 其生长速度反过来又取决于肥厚软骨细胞的数量和大小, 以及它们的基质产生¹⁰。此外, 最近还显示, 最后一个肥大阶段的持续时间与骨骼^{1 1}的最后长度有关。因此, 需要严格调节这些细胞的增殖和分化, 以确保适当的骨骼大小。

尽管多年来获得了大量知识, 关于生长板的组织和发展, 但这些结论大多是基于对固定组织学部分的观察。组织切片提供了有关这一过程的有价值的信息, 但可以利用技术伪影, 因此它不能总是可靠地用于估计不同阶段之间的形态或大小变化。此外, 由于骨骼生长是一个动态过程, 静态二维 (2D) 图像提供了对生长板细胞运动的有限洞察, 而活体组织上的延时成像可以提供有关细胞行为的有价值的信息。生长板中的软骨细胞。

所有这些限制都可以通过使用体外骨培养来解决。虽然骨培养协议是在一段时间前已经开发出来, 他们被有限地应用于小鼠长骨。由于小鸡模型^{12、13 提供}的技术优势, 大多数研究都使用了小鸡骨。将组织型培养物 (空气-液体界面) 应用于雏鸡胚胎股骨, 在培养中维持 10天^14天。小鼠可用的复杂遗传工具使这一模型在体外骨培养中非常有吸引力。利用小鼠研究骨骼生长的研究主要与骨骨 15^有关, 这可能是由于它们体积小, 每个胚胎^16岁获得的数量更多。虽然传统上被认为是长骨, 但元骨在体内比其他长骨更早进入衰老 (其特点是生长板^的增殖和卷曲减少), 因此它们在体内的连续生长不会提前真正重述体内的过程。为了本文的目的, 我们将使用长期骨骼一词的骨骼从近端和中间肢体区域。此前的几项研究在体外培养中使用了胫骨等长小鼠骨骼, 观察到软骨的大量生长, 但很少骨化18。我们最近还使用胫骨培养法, 主要研究软骨细胞动力学¹⁹。其他研究使用年轻小鼠^{20 的}股骨头或仅股骨的远端部分培养²¹。最近的一些作品成功地将全骨的体外培养与延时成像结合起来, 获得活着的老鼠组织中软骨细胞的三维 (3d)电影 22^,23。作者成功地观察了以前未被注意到的软骨细胞重新排列到增殖区²³的事件, 这是骨体外培养潜在应用的一个很好的例子。另一种方法, 即分析静态图像, 需要间接和复杂的技术。最近的一项研究评估了横向克隆对软骨生长的重要性, 使用了多色记者小鼠菌株的遗传追踪和数学建模 24.因此, 体外培养可能有助于以更快、更直接的方式深入了解动态过程。

在这里, 我们提出了一种方法, 小鼠长骨培养, 它可以结合不同的分子治疗和/延时活体成像。该协议调整了前^一次报告 15^、18、25中使用的方法, 但解决了一些其他问题, 并侧重于长骨, 如胫骨, 而不是掌骨。最后, 它探讨了使用统计强大的配对比较的潜力, 通过培养左和右骨分别存在不同的物质。

研究方案

所有实验都应遵循地方政府和机构关于实验室动物道德处理的准则进行。

1. 骨培养日之前的准备工作

1. 设置定时老鼠交配, 从胚胎日 14.5 (E14.5) 到以后获得胎儿和幼崽。
   请注意:长骨培养可成功应用于不同的小鼠品系;在目前的协议中, 使用了超繁殖的瑞士韦伯斯特野型小鼠。
2. 制备解剖培养基 (改编自休斯顿等^人, 任例): 稀释α-最小必要培养基 (Α-mem) 或 dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和 2 mgml 牛血蛋白 (bsa) 和过滤消毒通过 0.22μm, 33 毫米直径的注射器过滤器。在-20°c 下储存脂肪。
3. 提取胎儿前一天, 制备由含有 0.2% BSA、0.5 mm l-谷氨酰胺、40 U/peml Penicilin/streptomin、0.05 Mg/ml 抗坏血酸和 1 mM 磷酸酯酯组成的无血清素培养培养基。过滤器通过 0.22μm, 33 毫米直径的注射器过滤器进行消毒, 并在4°c 下存放长达1个月。
4. 在培养的当天和老鼠宰杀前, 准备24孔盘子和60毫米的菜肴与解剖介质, 并保持冰凉。在37°c 的水浴中预热骨培养基。在用于处理胎儿的工具 (推子和小剪刀) 上喷洒 80% (vv) 乙醇。将双目示波器转移到 II 类生物安全柜。

2. 胎儿、新生儿胫骨和股骨的培养

1. 在所需的妊娠阶段 (从 E14.5 到 E18.5 不等) 通过宫颈脱位将怀孕的小鼠宰杀。如果使用新生的幼崽, 将它们一个接一个地从母亲身上取出, 并通过斩首进行宰杀。
2. 将鼠标放在背部, 并在腹部表面喷洒80% 的乙醇, 对其进行消毒。
3. 用小剪刀切割皮肤和腹部肌肉, 以进入子宫角。
4. 利用推拿器和小剪刀从腹腔中提取子宫, 去除中膜, 切割角的底部。将子宫放入60毫米培养皿中, 用冰凉解剖介质, 并在整个过程中将培养皿放在冰上。
5. 将带有子宫的培养皿转移到生物安全柜, 并从现在开始在那里工作。
6. 用剪刀在囊之间切割来分离单个胎儿。
7. 将个别囊转移到解剖立体显微镜下的一个干净的60毫米的盘子与解剖介质, 并打开他们与推子, 以分离胎儿从胎盘, 并将其从膜清洗。
   请注意:一次用一个胚胎工作, 同时把剩下的胚胎放在冰上。
8. 将胎儿斩首, 并将身体转移到一个干净的新的60毫米盘子与1毫升切割无菌移液器。
9. 从背部开始用推子去除胎儿或幼崽的皮肤, 将其剥落到脚趾。
10. 用靠近脊椎的推子切割后肢, 用冰凉的解剖介质将它们转移到干净的盘子里, 将后肢与身体分开。
11. 将胫骨与股骨分开, 用推子仔细引入股骨远端和胫骨近端的表面软骨。
12. 从股骨近端取出髋骨、跟骨和胫骨上的腓骨。
13. 通过咬住并将软组织从股骨和胫骨上取出软组织, 小心地将其取出。
    请注意:重要的是要去除尽可能多的软组织, 特别注意去除连接两个软骨杆的组织, 但避免损坏软骨、腹膜和骨骼。
14. 将四块骨头 (左、右胫骨和股骨) 放入24孔板的第一井, 并配有塑料1毫升无菌移液器。或者, 比较不同治疗对左、右肢体的影响, 将对侧肢体放置在不同的井中。
    请注意:当骨头转移到井里时, 应该格外小心, 因为它们很容易粘在移液器上。
15. 根据需要对尽可能多的胎儿进行相同的操作。
    请注意:一旦被覆盖的云, 就用解剖介质更换盘子, 因为清楚地看到解剖的骨头是很重要的。
16. 当所有所需的骨骼被转移到井中时, 用塑料1毫升无菌移液器取出解剖介质, 并格外注意不要吸气。
    1. 根据实验的目的, 可以在取出解剖介质之前拍摄骨骼的图片, 作为实验的时间点零点。用贴在数码相机上的显微镜拍照, 并对所使用的曝光和比例进行注释。为了确保简单可靠的测量, 拍摄对比度好的照片, 以区分矿化部分。
17. 在每口井中加入1毫升培养基。如果打算对骨骼进行任何治疗 (多西环素、他莫西芬、生长因子等), 现在就应该添加。
18. 观察生长抑制在培养条件下的作用, 用维甲酸 (RA, 500 nM) 治疗左替尼, 同时用等量的车辆 (二甲基亚硫酸盐 [DMSO], 最终浓度 0.1%) 孵育右替尼则。作为一个控件。
19. 在标准细胞培养条件下 (在5°c 二氧化碳孵化器中的37°c 时), 让骨骼在细胞培养孵化器中生长两天或更长时间 。
20. 为了评估增殖, 在固定前10μm1-2 小时的最终浓度下, 在培养基中加入 5-乙基-2 '-脱氧尿素 (Edu) 或 5-溴-2 '-脱氧尿嘧啶 (BrdU)。
    请注意:EdU 的库存浓度为 20 mM。
    注意事项:EdU 和 BrdU 是胸苷类似物, 可能有毒和致突变。
21. 解冻4% 的甲醛 (PFA), 并通过浸入 PFA 在单个2毫升管修复骨骼。
    注意事项:PFA 有毒, 被指定为一种可能的人类致癌物。避免吸入多甲醛粉末和蒸气。EdU 和 BrdU 是胸苷类似物, 可能有毒和致突变。
22. 在室温下短暂固定 PFA 10分钟后, 将骨骼转移到 PBS, 以便在最后一个时间点采集图片。然后将骨骼放回 PFA, 以便在4°c 下进行夜间固定。
23. 固定后的骨骼可以进行处理, 以达到所需的下游应用。

3. 骨全长和矿化区域长度的测量与分析

1. 使用图像编辑软件测量骨骼的长度, 同时考虑到图像的比例。测量骨骼的总长度和矿化区域。从一端的第一个暗细胞开始测量, 直到一端的最后一个黑暗细胞。
   请注意:矿化区域的特点是颜色较深, 很容易与软骨区分开来。
2. 要计算生长速率 (定义为每天平均长度的增加), 请将骨骼的最终长度与初始长度之间的差异除以培养中的天数。

结果

骨培养可以从不同的阶段开始进行。在图 1A-d中, 比较了在等效阶段培养的胫骨和新鲜提取的胫骨。第一个观察是, 在长达两天的培养时间里, 所达到的大小与软骨和矿化骨的体内骨骼生长相当 (图 1a、b、d)。较长的培养周期导致培养的骨骼和刚提取的骨骼之间有更大的差异 (图 1c)?...

讨论

骨外培养方法已经使用了一段时间来评估骨生长^的生物学 28, 但很少应用于小鼠长骨。随着成像技术的发展, 体外骨培养为在与体内条件非常相似的环境中实时研究骨骼生长提供了一种有吸引力的方法。在这种情况下, 重要的是要定义长骨生长与其在体内生长相当的条件。

在本研究中, 我们描述了一个简单且经济实惠的长骨培养协议, 解决了其局限性和可能的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2 incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T