태아와 신생아 뮤 린 긴 뼈를 배양 하 고 측정

요약

여기서, 우리는 생체 내 과정을 다시 캡처하는 동안 제어 된 조건에서 뼈 및 연골 발달 및 항상성 분석에 적합 한 태아 및 신생 단계에서 긴 뮤 린 뼈의 생체 내 배양을 위한 방법을 제시 한다.

초록

긴 뼈는 복잡 하 고 동적인 구조, 연골 중간을 통해 endochondral 골 화에서 발생 하는. 건강 한 인간의 뼈에 대 한 제한 된 액세스는 특히 마우스와 쥐와 같은 포유류 모델을 사용 하 여 뼈 성장과 항상성의 다양 한 측면을 살펴 보는 데 유용 합니다. 추가적으로, 쥐에 있는 정교한 유전 공구의 발달은 긴 뼈 성장의 더 복잡 한 연구를 허용 하 고 뼈 성장을 공부 하기 위하여 이용 된 기술의 확장을 요구 합니다. 여기서, 우리는 생체 내 뮤 린 뼈 배양에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고,이는 체 내 과정의 대부분을 탈환 하면서 밀접 하 게 통제 된 방식으로 뼈와 연골의 연구를 가능 하 게 한다. 설명 된 방법은 경골, 대 퇴 골 및 중 족 뼈를 포함 한 뼈의 범위의 배양을 허용 하지만, 우리는 여기에 경골 문화에 주로 초점을 맞추고 있다. 더욱이, 타임 랩 스 라이브 이미징 또는 약물 치료와 같은 다른 기술과 조합 하 여 사용 될 수 있다.

서문

장기 성장은 성장 장애의 출현을 막기 위해 밀접 하 게 조율 되어야 하며, 신체의 다른 부분 들 사이에서 여러 세포 유형, 분자 통로 및 누화를 조절 하는 것을 수반 한다. 이미징 기법은 정상적인 상태에서 성장 하는 배아에서 시간이 지남에 따라 발생 하는 변화를 해결 하는 데 필수적 이며, 시스템에서 교란이 유도 된 후에도 중요 합니다. 널리 사용 되는 설치류 모델과 같은 자궁내 발달을 가진 배아는, 전 생체 배양 기술을 사용 하 여 부분적으로 극복할 수 있는 살아있는 화상 진 찰 및 약 처리를 위한 추가 도전을 제시 합니다. 생체 내 프로세스를 성공적으로 탈환 하 고 의미 있는 결과를 얻으려면 각 기관이 나 조직에 적합 한 배양 조건을 찾는 것이 중요 합니다.

포유류 해골의 대부분의 뼈는 endochondral 골 화를 통해 자라 며, 여기서 배아 (연골 세포로 구성 됨)는 세로 성장을 유도 하 고 점차적으로 뼈로 대체 됩니다. 이 과정은 3 개의 영역이 구별 될 수 있는 긴 뼈의 끝에 있는 성장 판에서 발생 합니다: 휴식, 증식 및 비 대^1,2. 먼저, 휴지기에서의 원형 전구 연골 세포는 증식 영역에서 사이클링 원주 형 연골 세포로 전환 한다. 분화의 다음 단계 도중,이 연골 세포는 비 대 하 하 고 유형 X 교원 질을 은닉 하기 시작 됩니다. 비 대 성 연골 세포는 골 화의 후속 단계를 조율 합니다: 그들은 결합 조직 성장 인자, 뼈 형성 단백질 및 인도 고슴도치와 같은 주요 신호 분자를 분 비 하 고 매트릭스의 미네랄 화를 직접, 모집 혈관을 뼈의 중앙 부분에, 그리고 아 폽 토시 스를 시 킴으로써, 골 아 세포가 매트릭스에 침입 하 여 일차 골 화 중심^3,4를 형성 하도록 한다. 광물 화 된 매트릭스는 골 아 세포가 이동 하 여이 저하 된 연골을 뼈 매트릭스⁵로 대체 하는 혈관의 침투를 촉진 합니다. 대부분의 골 아 세포는 연골 세포 로부터 연골 매트릭스를 침범 하 고, 섬유질 층은⁶. 대안적으로, 비 대 성 연골 세포의 비율은 조 골 세포를 생존 하 고 트랜스 분화 할 수 있다^7,8,9. 뼈의 최종 길이는 일시적인 연골의 축적 된 성장에 기인 하며, 그의 성장 속도는 비 대 성 연골 세포의 수 및 크기, 및 그들의 매트릭스 생산¹⁰에 의존 한다. 추가적으로, 최근 비 대 단계의 지속 시간이 뼈 (¹¹)의 최종 길이와 상관 된다는 것이 최근에 나타났다. 따라서, 적절 한 뼈 크기를 보장 하기 위해 이러한 세포의 증식 및 분화의 엄격한 조절이 필요 하다.

조직 및 성장 판의 개발에 년 동안 취득 한 실질적인 지식에도 불구 하 고, 이러한 결론의 대부분은 고정 조직학 섹션의 관찰에 기초한. 조직 절편은이 과정에 대 한 중요 한 정보를 제공 하지만, 기술적 아티팩트를가지고 수 있습니다, 그래서 항상 안정적으로 다른 단계 사이의 형태학 적 또는 크기 변화를 추정 하는 데 사용할 수 없습니다. 또한 뼈 성장이 동적인 과정 이기 때문에 정적 2 차원 (2D) 이미지는 성장 판의 세포 움직임에 대 한 제한적인 통찰력을 제공 하는 반면, 살아있는 조직에 대 한 타임 랩 스 이미징의 행동에 대 한 귀중 한 정보를 제공 할 수 있습니다 성장 판의 연골 세포.

이러한 모든 제한은 생체 내 뼈 배양을 사용 하 여 잠재적으로 해결 될 수 있습니다. 뼈 배양 프로토콜은 얼마 전에 개발 되었지만, 그들은 뮤 린 긴 뼈에 무제한으로 적용 되었습니다. 대부분의 연구는 병아리 모델^12,13에 의해 제공 되는 기술적인 이점 때문에 병아리 뼈를 사용 합니다. 유기 형 배양 물 (공기/액체 계면)은 10 일 동안 배양에서 유지 되었던 병아리 배아 미 립 기에 적용 되었다¹⁴. 마우스에서 사용할 수 있는 정교한 유전 도구는이 모델을 ex vivo 뼈 문화에서 사용 되는 매우 매력적으로 만듭니다. 뼈 성장에 마우스를 사용 하는 연구는 대부분 중 족 뼈 (¹⁵)와 함께 일했다, 아마 그들의 작은 크기와 배아 당 얻은 더 큰 숫자 때문에¹⁶. 전통적으로 긴 뼈로 여겨 졌으 나, 중 족은 생체 내 다른 긴 뼈 보다 더 일찍 노화 (성장 판 (¹⁷)의 증식 및 인 볼륨 감소를 특징으로 하며, 따라서 이들의 지속적인 성장은 전 생체 실제로 생체 내 프로세스를 다시 캡처합니다. 이 기사의 목적상 근 위 및 중간 팔 다리 영역의 골격에 긴 골격 이라는 용어를 사용 합니다. 몇몇 이전 연구는 tibia와 같은 긴 뮤 린 뼈를 사용 하 여, 전 생체 내 배양에서 연골의 실질적인 성장을 관찰 하지만, 작은 골 화¹⁸. 우리는 또한 최근 연골 세포 역학 (¹⁹)을 연구 하기 위해, 경골 문화를 사용 했다. 다른 연구 들은 배양²¹에 대 한 대 퇴 골의 말단 부에만 젊은 쥐 (²⁰ ) 로부터 넓 적으로 대 퇴 머리를 사용 하였다. 일부 더 최근의 작품은 성공적으로 살아있는 마우스 조직^22,23에 있는 연골 세포의 3 차원 (3d) 영화를 획득 하기 위해 전체 뼈의 전 생체 배양을 타임 랩 스 이미징과 결합 한다. 저자는 뼈 ex vivo 문화의 잠재적인 적용의 좋은 예에 있는 증식 영역 (²³ )에 연골 세포의 재배열에서 이전에 주목 이벤트를 관찰 하기 위해 관리. 대체, 즉 정적 이미지 분석에는 간접적이 고 복잡 한 기법이 필요 합니다. 이것은 연골 성장에 대 한 transversally 중심의 클론의 중요성을 평가 하는 최근의 연구에 의해 예시 되었으며, 여기서 수학적 모델링과 결합 된 다 색 리포터 마우스 균 주를 사용한 유전 추적이²⁴를 사용 하였다. 따라서, 전 생체 배양은 보다 빠르고 간단한 방법으로 동적 프로세스에 대 한 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기에서, 우리는 다른 분자 처리 및/또는 시간 경과 살아있는 화상 진 찰과 결합 될 수 있는 긴 뼈 문화를 뮤 린 위한 방법을 제시 합니다. 이 프로토콜은 이전 보고서¹⁵,²⁵에서 사용 된 방법을 조정 하지만 몇 가지 추가 문제를 해결 하 고 중 족 뼈가 아닌 경골과 같은 긴 뼈에 초점을 맞춥니다. 마지막으로, 그것은 다른 물질의 존재에 개별적으로 왼쪽과 오른쪽 뼈를 배양 하 여 통계적으로 강력한 쌍 비교를 사용의 잠재력을 탐구.

프로토콜

모든 실험은 실험실 동물의 윤리적 취급에 대 한 지방 정부 및 제도적 지침에 따라 수행 되어야 합니다.

1. 뼈 배양의 날 이전 준비

1. 배아 날 14.5에서 태아와 새끼를 얻기 위해 시간 마우스 짝짓기를 설정 (전자 14.5) 그리고 이후.
   참고: 긴 뼈의 문화는 다른 마우스 균 주에 성공적으로 적용 될 수 있다; 본 프로토콜에서, 스위스 웹스터 야생 형 마우스의 무법자가 사용 된다.
2. 해 부 배지 준비 (휴스턴 외¹⁵): α-최소 필수 배지 (α-MEM) 또는 Dulbecco의 변성이 글 (DMEM) 1/13 인산 완충 식 염 수도 (PBS) 및 2 Mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 및 필터 살 균 0.22 µm, 33 mm 직경 주사기 필터를 통해. -20°c에 저장 하십시오.
3. 태아의 추출 전날, 0.2% BSA를 포함 하는 DMEM로 구성 된 무 혈 청 뼈 배양 배지, 0.5 mM의 L-글루타민, 40 U/mL 페니실린/streptomycin, 0.05 mg/ml 아 스 코르 브 산 및 1mm 베타 포스 페이트를 제조 한다. 0.22 µm, 33 mm 직경 주사기 필터를 통해 필터를 소독 하 고 최대 1 개월 동안 4°c에서 보관 하십시오.
4. 배양 당일 및 마우스 컬링 이전에, 24 웰 플레이트와 60 mm 요리를 해 부 배지로 준비 하 고 얼음을 차갑게 유지 하십시오. 37 ° c의 수조에 뼈 배양 액을 미리 따뜻하게 합니다. 스프레이 80 (핀셋 및 작은가 위)에 에탄올을 사용 하 여 태아를 처리 합니다. 쌍안경 범위를 2 등급 바이오 안전 캐비닛으로 전송 합니다.

2. 태아와 신생아 경골과 대 퇴 골의 문화

1. 원하는 임신 단계에서 자 궁 경부 탈 구를 통해 임신한 마우스를 컬링 (전자 14.5에서 전자 18.5에 이르기까지). 신생아 새끼를 사용 하는 경우, 하나 어머니에서 그들을 제거 하 고 욕 침에 의해 컬링.
2. 그녀의 뒤에 마우스를 놓고 그 표면에 80% (v/v) 에탄올을 분사 하 여 복 부 영역을 소독.
3. 작은가 위로 피부와 복 부 근육을 잘라 자 궁 뿔에 액세스 할 수 있습니다.
4. 핀셋과 작은가 위를 사용 하 여 복 강에서 자 궁을 추출 하 고 메 나 트리 움을 제거 하 고 뿔의 기저를 절단 합니다. 얼음 감기 해 부 매체와 60 mm 페 트리 접시에 자 궁을 배치 하 고 전체 절차 동안 얼음에 배양 접시를 유지.
5. 바이오 안전 내각에 자 궁으로 페 트리 접시를 전송 하 고 지금부터 거기에 작업.
6. Sacs 사이를 절단 하 여가 위로 개별 태아를 분리 하십시오.
7. 해 부 매체와 함께 깨끗 한 60 mm 접시에 해 부에 있는 개별 sac를 전송 하 고 핀셋으로 그들을 열어 플 래 트에서 태아를 분리 하 고 멤브레인에서 청소 하십시오.
   참고: 얼음에 나머지를 유지 하면서 한 번에 하나의 태아와 함께 작동 합니다.
8. 태아를 욕 하 고 깨끗 한 새로운 60 mm 접시에 시체를 전송 1 mL 잘라 멸 균 피 펫.
9. 핀셋으로 태아 또는 새끼의 피부를 제거 하 고 뒤쪽에서 시작 하 여 발가락까지 벗 겨 냅니다.
10. 척추에 가까운 핀셋으로 절단 하 여 신체에서 후 각을 분리 하 고 얼음 감기 해 부 매체로 깨끗 한 요리로 전송 합니다.
11. 핀셋으로 대 퇴 골에서 경골을 분리 하 여 말단 대 퇴 골과 근접 경골의 표면 연골 사이를 조심 스럽게 소개 합니다.
12. 근 위 대 퇴 골과 종 골 뼈에서 엉덩이 뼈와 경골에서 불 라를 제거 합니다.
13. 대 퇴 골과 경골에서 부드러운 조직을 조심 스럽게 제거 하 고 당겨 빼냅니다.
    참고: 그것은 가능한 한 많은 부드러운 조직을 제거 하는 것이 중요 합니다, 두 개의 연골 극을 연결 하는 조직을 제거에 특별 한 주의를 복용 하지만, 연골을 손상 피하고, 심 낭, 그리고 뼈.
14. 24 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 4 개의 뼈 (왼쪽 및 오른쪽 티 바이어스 및 페 머)를 플라스틱 1Ml 멸 균 피 펫으로 배치 하십시오. 양자 택일로, 왼쪽과 오른쪽 사지에 다른 처리의 효력을 비교 하기 위하여, 다른 우물에 반대편 사지를 놓습니다.
    참고: 뼈가 피 펫에 쉽게 붙을 수 있으므로 웰에 전달 될 때 여분의 주의를 기울여야 합니다.
15. 필요에 따라 많은 태아와 같은 방법으로 진행 합니다.
    참고: 해 부 뼈를 명확 하 게 보는 것이 중요 하기 때문에 너무 흐리게 되 자 마자 해 부 매체로 접시를 변경 하십시오.
16. 모든 원하는 뼈가 우물에 전달 되 면, 플라스틱 1 mL 멸 균 피 펫으로 해 부 배지를 제거 하 고 뼈를 흡입 하지 않도록 여분의 주의를 기울여야 합니다.
    1. 실험의 목적에 따라, 실험의 timepoint 0으로 해 부 매체를 제거 하기 전에 뼈의 사진을 찍을 수 있습니다. 디지털 카메라에 부착 된 현미경으로 사진을 찍고 사용 된 노출과 크기에 주석을 답니다. 쉽고 신뢰할 수 있는 측정을 위해 좋은 대조를 가진 사진을 찍어 광물 화 된 부분과 구별 합니다.
17. 각 웰에 1 mL의 배양 배지를 추가 합니다. 어떤 치료가 뼈 (독 시 사이 클린, 타 목 시 펜, 성장 인자 등)에 대 한 것 이라면 지금 추가 해야 합니다.
18. 배양 조건에서 생 육 억제의 효과를 관찰 하기 위해, 레 틴 산 (RA, 500 nM)으로 왼쪽 티 바이어스를 처리 하 고 동등한 부피의 비 히 클 (디 메 틸 설 폭 사이드)을 배양 하면서 최종 농도 0.1% 제어로.
19. 표준 세포 배양 조건 하에서 세포 배양 인큐베이터에서 2 일 이상 성장 하는 뼈를 남겨 둡니다 (5% CO2 인큐베이터에서 37 ° c 에서).
20. 증식을 평가 하기 위해 5 틴-deoxyuridine) 또는 5 브로 모 deoxyuridine (BrdU)을 고정 전 10 µ의 최종 농도에서 1-2 시간으로 추가 합니다.
    참고: 에 듀의 재고 농도는 20mm입니다.
    주의: EdU와 BrdU는 티 미 딘 유사 하며 독성이 있고 돌연 변이 수 있습니다.
21. 4% 파라 포름알데히드 (PFA)를 해 동 하 고, 개별 2 mL 튜브에 PFA에 침 지 하 여 뼈를 고정 합니다.
    주의: PFA는 독성이 있으며 인간의 발암 물질로 지정 됩니다. 파라 포름알데히드 분말 및 증기를 호흡 하지 마십시오. EdU와 BrdU는 티 미 딘 유사 하며 독성이 있고 돌연 변이 수 있습니다.
22. 실 온에서 PFA에 10 분간 고정 한 후 최종 timepoint에서 사진 획득을 위해 뼈를 PBS로 전달 합니다. 그런 다음 4 ° c에서 하룻밤 고정을 위해 뼈를 PFA에 다시 놓습니다.
23. 고정 뼈는 원하는 다운스트림 응용 프로그램을 처리 할 수 있습니다 후.

3. 골 및 광물 화 된 영역의 전체 길이의 측정 및 분석

1. 이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지의 배율을 고려 하 여 골격의 길이를 측정 합니다. 뼈의 총 길이와 광물 화 된 부위를 모두 측정 합니다. 한 쪽 끝에 있는 첫 번째 어두운 셀부터 다른 쪽 끝의 마지막 값까지 측정을 시작 합니다.
   참고: 광물 화 된 영역은 더 어두운 색을 특징으로하 며 연골과 쉽게 구별 됩니다.
2. 일일 평균 길이 증가로 정의 되는 성장률을 계산 하려면 골격의 최종 길이와 초기 값 간의 차이를 문화권의 일 수로 나눕니다.

결과

뼈 배양은 다른 단계에서 시작 하 여 수행할 수 있습니다. 도 1a에서, 동등한 단계에서 배양 된 경골과 갓 추출한 것 들 사이의 비교가 도시 되어 있다. 제 1 관찰은 최대 2 일간의 배양이 달성 되는 크기는 연골 및 광물 화 된 뼈 모두에 대 한 생체 내 뼈 성장에 필적 하는 것 이다 (도 1a, B, D). 더 긴 배양 ?...

토론

뼈 ex 생체 배양 방법은 뼈 성장 (²⁸)의 생물학을 평가 하기 위해 몇 시간 동안 사용 되어 왔으며, 뮤 린 긴 뼈에는 거의 적용 되지 않았다. 이미징 기술의 발달로, 생체 내 뼈 배양은 생체 내 조건과 밀접 하 게 유사한 설정에서 실시간으로 뼈 성장을 연구 할 수 있는 매력적인 방법을 제공 합니다. 이 시나리오에서는 긴 뼈의 성장이 생체 내 성장에 필적 하는 조건을 정의 하는 것이 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile	Falcon	353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ascorbic acid	Sigma	A92902
Base unit for the scope	Zeiss	435425-9100-000
Betaglycerophosphate	Sigma	G9422
Binocular scope	Zeiss	STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v	Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500 camera	Aunet
Dissection kit	Cumper Robbins	PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Eppendorf 2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
Ethanol 96%	Merk	159010
Forceps Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2 incubator	Thermo Fisher	51026282
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma	M2279
Multiwell 24 well	Falcon	353047
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped	Thermo	273
Syringe filter 0.2 um	Life Sciences	PN4612
Terumo syringe 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid)	Sigma	PHR1187-3X
Trinocular scope	Aunet	AZS400T