في فيفو الحقن المجسمة داخل الدماغ لتحفيز البصريات من المدخلات بعيدة المدى في شرائح الدماغ الماوس

Summary

يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتحديد الاتصال الوظيفي الخاص من نوع الخلية من المدخلات طويلة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام التحفيز البصري في شرائح الدماغ في الجسم الحي السابق.

Abstract

معرفة من نوع الخلية اتصال متشابك محددة هو شرط مسبق حاسم لفهم الدوائر العصبية على نطاق الدماغ. التحقيق الوظيفي للاتصالات طويلة المدى يتطلب تسجيلات مستهدفة من الخلايا العصبية واحدة جنبا إلى جنب مع التحفيز المحدد للمدخلات البعيدة المحددة. وغالبا ً ما يكون من الصعب تحقيق ذلك باستخدام تقنيات التحفيز التقليدية والكهربائية، لأن المحاور من مناطق الدماغ المتقاربة في المنبع قد تختلط في المنطقة المستهدفة. ويتيح استهداف منطقة دماغية محددة لتعبير قنوات أيون حساسة للضوء بتسمع مجسم ة من قبل الفيروس التحفيز الانتقائي للمحاور الناشئة من تلك المنطقة بالضوء. يمكن استخدام الحقن المجسمة داخل الدماغ في هياكل محددة جيدا، مثل النوى الثالية الأمامية، بالإضافة إلى المناطق الأخرى تحت القشرية أو القشرية في جميع أنحاء الدماغ.

وصف هنا هو مجموعة من التقنيات لحقن مجسمة دقيقة من ناقلات الفيروسية التي تعبر عن channelrhodopsin في الدماغ الماوس، تليها التحفيز الضوئي للمحطات axon في إعداد شريحة الدماغ. وهذه البروتوكولات بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع. في تركيبة مع كامل الخلية التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية المتصلة postsynaptically، والتحفيز الضوئي للمحاور يسمح الكشف عن الاتصالات متشابك وظيفية، والتوصيف الدوائي، وتقييم قوتها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام ملء السيتين من الخلايا العصبية المسجلة لتحديد مورفولوجيما ما بعد مخصص للخلية العصبية postynaptic.

Introduction

تعريف الاتصال بين مناطق الدماغ ضروري لفهم الدوائر العصبية. تسمح أساليب التتبع التشريحي الكلاسيكية بإنشاء اتصال أقاليمي، وتساعد دراسات الآفات على فهم التنظيم الهرمي لتدفق المعلومات. على سبيل المثال، دوائر الدماغ للاتجاه المكاني واتجاه الرأس الإشارات تنطوي على تدفق الاتجاه من المعلومات من المهاد إلى presubiculum. وقد ثبت هذا من خلال دراسات الآفات من النوى الثالية الصدغية الصدغية (ADN) التي تتحلل إشارة اتجاه الرأس في presubiculum الظهرية المصب، فضلا عن إشارة خلية الشبكة parahippocampal^1،2.

الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ هو أكثر صعوبة في إنشاء على مستوى الخلوية ودون الخلوية. في الحصين، يسمح التشريح المنظم للغاية بالتحقيق في اتصالات متشابكة خاصة بالمسار باستخدام المحاكاة الكهربائية في إعداد الشريحة. يمكن استخدام أقطاب التحفيز الموضوعة في طبقة الراديوتوم من CA1 لتحفيز المدخلات الجانبية شافر على وجه التحديد من CA3³. تحفيز الأقطاب الكهربائية وضعت في الطبقة lacunosum الجزيئية من CA1 سوف تنشيط مدخلات مسار مثقب إلى CA1^4،5. التحفيز الكهربائي ينشط الإفراج العصبي من محطات axon; ومع ذلك، فإنه ينشط الخلايا العصبية مع سوماتا بالقرب من موقع التحفيز، فضلا عن محاور المرور. ولذلك فهي ذات استخدام محدود لدراسة الأوفيرينتس من مناطق الدماغ المحددة عندما تختلط الألياف من مناطق منشأ مختلفة في الهيكل المستهدف، كما هو الحال عادة في القشرة الجديدة.

ويمكن أيضا تحفيز الخلايا العصبية مع الضوء. وتشمل الطرق البصرية التنشيط الضوئي للغلوتامات القفص، والتي يمكن الجمع بينها وبين واحد أو اثنين من المسح الضوئي بالليزر الفوتون. يمكن تحفيز مواقع متعددة متباعدة بشكل وثيق بالتتابع، مع عدم وجود ضرر ميكانيكي للأنسجة⁶. وقد استخدم هذا بنجاح لرسم خريطة مستقبلات متشابك وكذلك تنشيط الخلايا العصبية الفردية⁷. في حين يمكن استخدام الغلوتامات في تحليل الدوائر المحلية، فإنه لا يسمح لتنشيط محددة من المدخلات طويلة المدى.

طريقة الاختيار للتحقيق في الاتصال بعيد المدى في الدوائر العصبية هو استخدام التعبير channelrhodopsin بوساطة الفيروس. باستخدام الحقن المجسمة في الجسم الحي كما هو موضح هنا، يمكن استهداف التعبير عن قنوات أيون ذات بوابات خفيفة ويقتصر مكانيا على منطقة الدماغ المطلوبة. وبهذه الطريقة، تكون القنوات فعالة لرسم خرائط الاتصال المحفز أو المثبط من منطقة إلى هدفها. يمكن تحفيز محطات المحاور المتحولة مع الضوء في إعداد شريحة الدماغ، وتسجيلات التصحيح المشبك كقراءة تسمح بفحص وظائف ونقاط القوة من مكونات دائرة محددة في الدماغ⁸. النهج البصري جنبا إلى جنب مع حقن مجسمة من الفيروس يقدم خصوصية غير مسبوقة والسيطرة الوراثية⁹. تحفيز مع الضوء بالإضافة إلى ذلك يسمح لكل من الدقة الزمنية والمكانية العالية^10،11.

وpresubiculum هو هيكل القشرية من ست طبقات في الانتقال من الحصين وتشكيل شبه فرس النهر^12،13. هو يستلم مساهمة مهمّة متشابكة من ال [أدن]¹¹ غير أنّ أيضا من عدّة أخرى [كورتك] ومناطق تحت^{القشريّة 14}. وهكذا، فإن التحفيز الانتقائي لمحطات المحاور الثلاميك داخل شريحة ما قبل الخضوع غير ممكن مع التحفيز الكهربائي ولا الغلوتامات المنقطع. الموصوفة في هذا البروتوكول هي طرق لتحديد الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ (ADN وpresubiculum) باستخدام حقن مجسمة دقيقة من النواقل الفيروسية التي تعبر عن قنوات ذات بوابات خفيفة. كما وصف هو التحفيز الضوئي للمحطات axons من إسقاط الخلايا العصبية في منطقتهم المستهدفة، إلى جانب تسجيلات التصحيح المشبك الخلية الكاملة من الخلايا العصبية ما بعد متشابك في إعداد شريحة الدماغ.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية (2010/63/EU) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة باريس ديكارت. يجب على المُجرِّب الحصول على تفويض لإجراء الامتثال للوائح المحلية.

1- تخطيط التجربة

1. حدد منطقة الدماغ التي سيتم استهدافها. تحديد إحداثيات stereotaxic من موقع الحقن بمساعدة أطلس الدماغ الماوس¹⁵. بالنسبة للنواة الثالية اللامعية اللاإتية اليمنى (ADN)، تكون الإحداثيات هي: -0.82 الخلفية، 0.75 الجانبي، -3.2 عمق (مم) نسبة إلى بريجما. قد تحتاج الإحداثيات إلى تعديل للالحيوانات من مختلف العمر أو الجنس أو الإجهاد.
2. تأكيد وتوثيق دقة الإحداثيات عن طريق حقن التتبع الفلورسنت (150 إلى 300 نمل) يمكن ملاحظتها مع مجهر الفلورة في تجربة تجريبية(الشكل 1A، B).
3. تحديد نوع الفيروس الذي سيتم حقنه. تخزين الفيروس في 6 ميكرولتر aliquots في -80 درجة مئوية على النحو الموصى به من قبل المنتج. جلب 1 aliquot وضعت على الجليد إلى غرفة الجراحة، لحقن واحد إلى ستة الحيوانات في يوم معين. وقد تعتمد لوائح السلامة الأحيائية لاستخدام المركبات المضادة للمركبات على البلد أو المؤسسة، وقد يلزم استخدام غطاء محرك محرك PSM 2.
   ملاحظة: هنا، نستخدم AAV2/5 serotype التعبير عن كرونوس، وهو متغير channelrhodospin-2 سريع، تنصهر إلى بروتين الفلورسنت الأخضر تحت سيطرة المروج Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. جراحة المجسمة

1. تثبيت إطار مجسم مجهز بحامل مضخة على مقاعد البدلاء مختبر القياسية مستقرة. ضبط منظار ستيريو بحيث نرى بوضوح المنطقة التي سيتم وضع رأس الحيوان. استخدم مصدر ضوء LED للإضاءة. تدوير منظار مجسم بعيدا للوصول إلى حامل المضخة، والتي ليست هناك حاجة للخطوات الأولى من الجراحة.
2. تثبيت حقنة هاميلتون 10 درجة مئوية مجهزة إبرة معدنية 33 G مجدول في حامل المضخة. اختبار نظام الإخراج بالماء.
3. التخدير 4-إلى 5 أسابيع القديمة C57BL6 الماوس مع حقن داخل اقابية من مزيج من هيدروكلوريد الكيتامين وxylazine (100 ملغ / كغ و 10 ملغ / كغ، على التوالي). إعداد مزيج من 1 مل من الكيتامين و 0.5 مل من إكسيليزين في 8.5 مل من 0.9٪ NaCl. وهذا سيؤدي إلى 10 ملغ / مل الكيتامين و 1 ملغ / مل إكسيليزين في هذا المزيج. من هذا المزيج، حقن داخل peritoneally 10 درجة مئوية لكل غرام من وزن جسم الحيوان. مدة التخدير حوالي 1 ساعة.
4. تحقق من أن الحيوان هو التخدير جيدا مع قرصة اصبع القدم. ثم، سحب اللسان لتسهيل التنفس. حلاقة الشعر القحفي.
5. حقن 20 ميكرولتر من هيدروكلوريد ليدوكائين (4 ملغ /مل؛ 2 ملغ/كغ) تحت جلد الرأس للتخدير الموضعي والانتظار 5 دقائق ليبدأ التأثير. لتجنب تلف العين بسبب الجفاف ، قم بتغطية العينين بمرهم عيون موضعي.
6. لفضح الجمجمة، وخلق قطع مستقيم في فروة الرأس مع مقص جراحة صغيرة. وضع الحيوان في إطار مجسم، وإدراج قضبان الأذن rostral قليلا إلى الأذن الفعلية للراحة على العظام وسحب الجلد، والتي ينبغي أن تخلق وصول جيد إلى الجمجمة. تشديد في مكانها. قم بتثبيت قطعة الأنف.
7. الحفاظ على جسم الحيوان أفقيا على مستوى الرأس باستخدام دعم تعديل الارتفاع. وضع وسادة التدفئة تحت الماوس للحفاظ عليه في درجة الحرارة الفسيولوجية.
8. تنظيف الجمجمة عن طريق تطبيق 0.9٪ NaCl مع مسحة القطن لإزالة الأنسجة الرخوة من العظام. استخدم منظار مجسم لبقية الجراحة.
9. ضبط الجمجمة بحيث محور بريغا لامدا هو مستوى، تتحرك صعودا أو أسفل الأنف والأسنان قطعة. وهذا يتطلب تدابير متكررة من بريغا ولامبا، كما أن كلا سوف تتغير بعد تعديل مستوى الأنف.
10. العثور على موقع الحقن على الجمجمة. ضبط إبرة الحقن فوق موقع الحقن وفقا لإحداثيات الخلفية والوسيطة ووضع علامة على الجمجمة مع إبرة المتاح. نقل إبرة الحقن صعودا من قبل 4 سم.
11. استخدام لدغ 0.5 ملم مع الحفر لتحقيق استئصال الجمجمة قطرها 1 ملم على العلامة، في نصف السرعة القصوى. مسحة نزيف في نهاية المطاف مع الأنسجة الورقية.
12. إفراغ المياه الواردة في حقنة هاملتون للتخزين عن طريق إخراج تماما مع المضخة. فقط الإبرة ستظل مليئة بالماء يتم غسل الإبرة بين كل استخدام مع الماء منزوع الأيونات النقي. التعقيم غير مطلوب.
13. خذ aliquot من الفيروس الذي سيتم استخدامه لهذا اليوم. تأكد من أن الحل الفيروسي لم يعد مجمدا ً ولكنه ظل مبرداً (بالقرب من 0 درجة مئوية، على الجليد). فقط لفترة وجيزة إزالة من الجليد للحصول على 700 nL مع micropipette لأحجام صغيرة. إيداع قطرة على قطعة 5 سم × 5 سم من فيلم البارافين. تجنب إنشاء فقاعات. ضع الحل الفيروسي المتبقي على الجليد.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم الانخفاض أكبر من حجم الحقن المطلوب (700 nL ل200 نل حقن). وهذا يعطي هامش أمان في حالة فقدان بعض السائل أثناء النقل ويسمح بإجراء طرد اختبار صغير (الخطوة 2.16) قبل المتابعة.
14. ضع فيلم البارافين فوق استئصال الجمجمة. يغرق الإبرة في قطرة من الحل الفيروسي دون تغيير موقف الأنتيرو الخلفي والجانبي.
15. استخدام وظيفة "سحب" من المضخة لملء الحقنة مع حوالي 500 مل من محلول فيروسي التخلص منها على فيلم البارافين.  القيام بذلك تحت السيطرة البصرية (منظار مجسم)، ومشاهدة انخفاض تختفي، وتأكد من عدم استنشاق الهواء.
16. تأكد من ملء الحقنة بشكل صحيح. تحقق من أداء نظام الإخراج عن طريق القيادة إلى أسفل الغطاس لاختبار إخراج قطرة صغيرة من السائل من 50 نمل تحت السيطرة البصرية. امسح القطرة
17. أدخل الإبرة في الدماغ إلى العمق المختار، عن طريق تحويل مقبض الباب الذي يتحكم في المحور الأورفي البطني لجهاز مجسم في اتجاه عقارب الساعة. اضغط على زر "تشغيل" (سرعة 15 nL/min لكل حجم من 150 nL حقن). يتم إخراج حجم صغير (50-300 nL، اعتمادا على الفيروس المستخدم) ببطء أكثر من 10 دقيقة مع مضخة أوتوماتيكية.
18. انتظر 10 دقائق بعد الحقن لتجنب التسرب من موقع الحقن. ثم، إزالة ببطء الإبرة أكثر من 3-5 دقيقة عن طريق تحويل مقبض الباب السيطرة على محور الظهر البطني عكس اتجاه عقارب الساعة.
19. تدوير الجزء الرأسي من الإطار stereotaxic مع حقنة بعيدا عن الحيوان. على الفور غسل الإبرة في المياه المقطرة نظيفة عن طريق ملء إفراغ ذلك عدة مرات، من أجل تجنب انسداد. تخزين الحقنة مليئة بالماء.
20. إزالة الماوس من الإطار stereotaxic. خياطة الجلد مع 4-0 خيوط خياطة البولي أميد. جعل ثلاثة أو أربعة stiches، وتعادل مع 2-1-1 عقدة الجراحية القياسية.
21. ضع الفأر في قفص ساخن حتى يستيقظ تماما من التخدير، وتوفير الماء والأغذية غارقة في طبق بيتري وضعت على الأرض. إذا كان مصدر الحرارة تحت القفص، استخدم شبكة فاصلة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
    ملاحظة: وفقاللمبادئ التوجيهية المحلية، يمكن استخدام جرعة واحدة من كيتوبروفين (2-5 ملغم/كغم، تحت الجلد) أو البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغم/كغم، تحت الجلد) لمنع الألم.
22. عندما يكون الحيوان مستيقظا تماما، إعادته إلى قفصمنزله ومراقبة رفاهه، وخاصة في اليوم التالي للحقن. تحقق من علامات الألم. إذا لوحظ أي تعديل سلوكي، يتم وزن الحيوان لمراقبة وزن الجسم.
23. اعتماداً على الفيروس المستخدم، قد يختلف وقت التعبير الكامل. هنا، نسمح 3 أسابيع للتعبير عن AAV5. Syn.Chronos-GFP.

3. حلول لتسجيلات شريحة حادة وتثبيت

1. إعداد حلول الأسهم من 10X حلول القطع المركزة (125 مل NaCl، 25 مليون متر السكروز، 2.5 مليون متر قدم مربع، 25 مل NaHCO_3،1.25 mM NaH₂PO_4، و 2.5 mM D-الجلوكوز) والسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) الحل (124 M NaCl، 2.5 مليون متر كل NaHCO_3,1 mM NaH₂PO_4, and 11 m D-الجلوكوز) في المياه الأيونات النقية قبل تجارب الفيزيولوجيا الكهربائية. تخزين هذه الحلول في 4 درجة مئوية في 1 زجاجات لتر دون CaCl₂ وMgCl_2.
2. في يوم التجربة، تمييع حلول الأسهم من حل القطع وACSF 10X إلى حجم نهائي من 0.5 L لكل منهما. إثارة مع النمام المغناطيسي وأكسجين من قبل محتدما مع 95٪ / 5 ٪ س₂/ CO_2. إضافة أيونات ثنائية التكافؤ للحصول على تركيزات نهائية من 0.1 مليون CaCl₂ و 7 M MgCl₂ لحل القطع، و 2 مل CaCl₂ و 2 M MMgCl₂ لACSF.
3. إعداد محلول ماصة البوتاسيوم-غلوكونات القائم على تحتوي على: 135 mM K-غلوكونات، 1.2 مل ككل، 10 مل HEPES، 0.2 mM EGTA، 2 MMMgCl_2،4 MM MgATP، 0.4 mM Tris-GTP، 10 mM Na 2-phosphocreatine، و 2.7-7.1 mM biocytin لمرحلة ما بعد الخلية الوحي مورفولوجيا. ضبط الوظيفة الهيدروجينية للحل إلى 7.3 وosmolarity إلى 290 منوم. تخزين 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية.
4. إعداد 0.1 M PBS عن طريق تخفيف BupH PBS الجافة مزيج أكياس مسحوق في 500 مل من الماء المقطر، مما أدى إلى 0.1 M فوسفات الصوديوم، 0.15 M NaCl، درجة الحموضة 7.2.
5. لإعداد 1 لتر من محلول PFA 4٪، تمييع 111 مل من 36٪ PFA السائل و 90 مل من محلول PBS 10X في الماء المقطر.
6. إعداد 30٪ محلول السكروز الذي يحتوي على 150 غرام من السكروز في 500 مل من 0.1 M PBS.

4. إعداد شرائح الدماغ

1. إعداد مساحة مقاعد البدلاء مع ورقة مقاعد البدلاء ماصة قبل التسريب.
2. تثبيت بالتنقيط حوالي 1 متر فوق مقاعد البدلاء لالجاذبية تغذية التسريب. إرفاق إبرة فراشة 24 G.
3. تحيط غرفة القطع من الاهتزاز مع الجليد وتخزينها في الثلاجة.
4. التخدير الماوس مع حقن داخل اقاب من نفس خليط الكيتامين-xylazine المستخدمة في الجراحة. تقييم مرحلة التخدير عن طريق الضغط على اصبع القدم مع ملقط. عندما نائما تماما, حقن 100 € L من الهيبارين (5000 U.I./mL) داخل الجنة.
5. إصلاح الحيوان مع شريط لاصق على ورقة ماصة، والكذب على ظهره. فتح القفص الصدري عن طريق قطع الأضلاع على الجانبين الأيسر والأيمن مع مقص صغير، من الحجاب الحاجز صعودا. الحفاظ على القفص الصدري مفتوحة مع مساعدة من شريط لاصق.
6. المشبك الأبهر تنازلي مع hemostat وperfuse عبر البطين الأيسر من القلب مع 4 درجة مئوية تبريد وأكسجين (95٪ / 5٪ O₂/ CO_2)،وقطع الحل من خلال إبرة فراشة 24 G. بعد 5 s، فتح الأذين الأيمن مع مقص صغير.
7. بعد 5 دقائق من التسريب ، عندما تكون الأعضاء بلا دم ، توقف التسريب. قطع رأس الحيوان مع مقص كبير وimmerge الرأس في 4 درجة مئوية تبريد والأكسجين حل القطع في طبق بيتري.
8. لاستخراج الدماغ، وقطع الجلد من الرقبة إلى الأنف، ثم قسم الفقرات الأخيرة من الجمجمة مع مقص. سحب الجلد يدويا واستخدام مقص صغير لفتح الجمجمة، وقطع على طول خط الوسط، من caudal إلى rostral، صعودا إلى بين العينين.
9. قم بإزالة العظام الجدارية والجزء الصدغي من العظام الأمامية بعناية باستخدام ملقط منحني أو عظم. استخراج الدماغ مع ملعقة مستديرة صغيرة عن طريق إدراج الصك بين الدماغ وأرضية الجمجمة، وقسمة لمبة الشم، والأعصاب البصرية وغيرها من الأعصاب القحفية، والمخيخ.
10. غمر الدماغ بلطف في محلول قطع الجليد الباردة (4 درجة مئوية) في كوب. وضع الدماغ على ورقة فلتر لتجفيف بلطف سطح القشرية. الغراء قشرة الدماغ وصولا الى حامل عينة من الاهتزاز، مع الجانب الكظرية التي تواجه النصل، من أجل قطع شرائح الدماغ الأفقي.
11. ملء غرفة القطع مع الجليد الباردة المؤكسدة حل القطع حتى يتم دمج الدماغ تماما. جعل قطع على نصف الكرة الأيسر (المضادة إلى الجانب حقن) لتجنب الغموض المحتمل ة اليسار واليمين على شرائح.
    تحذير: دائما أكسجين الحل وحماية شرائح من التعرض للضوء.
12. قطع شرائح سميكة 300 م مع الاهتزاز، بسرعة 0.07 مم / ثانية في سعة 1 ملم. في هذه المرحلة، فمن المستحسن للتحقق لفترة وجيزة التعبير كرونوس-GFP في المهاد باستخدام مصباح يدوي الفلورسنت (440-460 نانومتر) والنظارات مرشح المقابلة (500 نانومتر تمريرة طويلة).
13. عزل منطقة فرس النهر مع مشرط ونقله إلى غرفة المتمركزة في كوب مليئة حمام دافئ (34 درجة مئوية)، أكسجين (95٪ / 5٪ O₂/ CO₂₎ACSF.
14. بعد 15 دقيقة، تأخذ الغرفة من حمام الماء الساخن والسماح للشرائح بقية في درجة حرارة الغرفة، لا يزال الأوكسجين لمدة 45 دقيقة على الأقل حتى الاستخدام.

5. كامل الخلية التصحيح المشبك تسجيل

1. نقل بلطف شريحة الدماغ التي تحتوي على مجمع فرس النهر مع ماصة نقل الزجاج حسب الطلب إلى غرفة التسجيل التي شنت على المجهر تستقيم. يتم إجراء ماصة نقل من ماصة باستور تقصير (القطر الداخلي 6.5 ملم) تعلق على لمبة ماصة المطاط. يتغلغل باستمرار في غرفة التسجيل (3 مل) مع 34 درجة مئوية (دافئ) ACSF فقاعة مع 95٪ / 5٪ س₂/ CO_2. تعيين سرعة المضخة التمعجية إلى 2-3 مل / دقيقة.
2. فحص بإيجاز كرونوس-GFP التعبير في محطات axon في المنطقة ذات الأهمية مع الإضاءة LED الزرقاء (470 نانومتر) ومراقبة مع هدف 4X. يتم تصور الفلورة GFP من خلال مرشح الانبعاثات المناسبة، مع صورة كاميرا CCD المعروضة على شاشة الكمبيوتر.
3. ضع مرساة شريحة مصنوعة من سلك البلاتين على شكل حرف U مع سلاسل النايلون متباعدة بإحكام ("القيثارة") على شريحة للحفاظ عليه.
4. تغيير إلى هدف الغمر 63x وضبط التركيز. تحقق من وجود محاور تعبر عن كرونوس-GFP واختيار الخلايا العصبية الهرمية لتسجيل التصحيح.
5. نقل الهدف إلى أعلى.
6. سحب الماصات باستخدام البني المشتعلة الكهربائية الساحبة من الزجاج البورسليكات. يتم تعيين الساحبة لإنتاج الماصات مع ما يقرب من 1 ميكرومتر في قطر طرف. ملء الماصات مع الحل الداخلي القائم على K-غلوكونات.
7. جبل ماصة في حامل الماصات على مرحلة الرأس. خفض ماصة في الغرفة والعثور على غيض تحت الهدف. يجب أن تكون مقاومة الماصات بين 3-8 MΩ. تطبيق ضغط إيجابي خفيف مع حقنة وذلك لرؤية مخروط من حل تدفق من الماصة وخفض تدريجيا ماصة والهدف على سطح الشريحة.
8. تصحيح الخلية في تكوين الجهد المشبك: نهج الخلايا العصبية المحددة واضغط بدقة على طرف ماصة على سوما. يجب أن ينتج الضغط الإيجابي ديمبل على سطح الغشاء. الافراج عن الضغط لإنشاء ختم جيجا أوم (> 1 GΩ المقاومة). مرة واحدة مختومة، تعيين الجهد عقد إلى -65 مل فولت. كسر الغشاء مع نبض حاد من الضغط السلبي: ويتحقق هذا عن طريق تطبيق شفط قوي على أنبوب متصل بحامل الماصات.
9. سجل في كامل الخلية وضع المشبك الحالي استجابات الخلايا العصبية لفرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب الخطوات الحالية(الشكل 2A).
   ملاحظة: سيتم استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخصائص المضمنة النشطة والسلبية للخلية. يتم استخدام إجراءات MATLAB المكتوبة حسب الطلب للتحليل خارج الخط^10،16.
10. سجل في الحالية- أو الجهد المشبك الردود postsynaptic إلى حقل كامل 475 نانومتر LED التحفيز من ألياف afferent التعبير عن كرونوس. تحفيز مع القطارات من 10 التحفيز من 2 مللي ثانية مدة في 20 هرتز(الشكل 2B, C). قد تختلف شدة الضوء من 0.1 إلى 2 م.م.م.
    ملاحظة: تم قياس شدة الضوء مع وحدة تحكم الطاقة الضوئية المحمولة الرقمية المجهزة بمستشعر الصمام الضوئي، المتمركزة تحت الهدف. الاستجابة latencies من 2-4 مللي ثانية هي سمة لاتصال أحادي ة.
11. للتحقيق في طبيعة انتقال متشابك بين afferents طويلة المدى والخلايا العصبية المسجلة، يمكن استخدام عوامل الدوائية المختلفة. للتمييز الدوائي بين الاستجابات المباشرة الأحادية المرادفة من الاستجابات غير المباشرة عن طريق تنشيط الشبكة، أضف 1 μM TTX و100 μM 4-AP إلى ACSF.
    ملاحظة: تطبيق حمام حاصرات مستقبلات الغلوتامات يسمح لتحديد طبيعة الناقل العصبي الذي صدر وهوية مستقبلات postsynaptic. على سبيل المثال، سيتم حظر مستقبلات الغلوتامات من نوع AMPA بواسطة NBQX (10 μM) ومستقبلات NMDA بواسطة APV (100 درجة مئوية). اعتمادا على الهدف من الدراسة، يمكن وضع بروتوكولات للتحقيق في اعتماد الجهد من الاستجابات متشابك أو ديناميات الاستجابة مع مرور الوقت.
12. غسل مع حل ACSF الأصلي لتصحيح خلية أخرى، أو نقل شريحة تحتوي على الخلايا العصبية مليئة البيوتيسين في قارورة صغيرة مليئة 4٪ PFA.
13. بعد التثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ PFA، وغسل شريحة في 0.1 M PBS (2X لمدة 5 دقائق، 1X لمدة 20 دقيقة).
14. يُحفظ في 30% من السكروز عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

6. الوحي البيوسيتوين

1. نقل شرائح ثابتة تحتوي على الخلايا العصبية مليئة بالبيوتاين على شفرة زجاجية في قطرة من السكروز 30٪ وأداء ثلاث دورات من ذوبان التجميد: وضع النصل على الجليد الجاف التخلص منها في مربع الستايروفوم لمدة دقيقة واحدة حتى يتم تجميد قطرات من السكروز تماما، ثم اضغط على شفرة ضد كف اليد لذوبان.
2. اغسل الشريحة 3x في 0.1 M PBS (2X لمدة 5 دقائق، 1X لمدة ساعة و 50 دقيقة)، تحريكها بلطف. لا تتجاوز 2 ساعة للغسيل الأخير.
3. قبل احتضان شريحة في RT لمدة 2 ساعة في حل العازلة المهتاج التي تحتوي على 2٪ مسحوق الحليب (0.4 غرام في 20 مل) لتشبع المواقع غير المحددة و 0.5٪ تريتون X100 (0.1 مل في 20 مل) لنفاذ الأغشية في 0.1 M PBS.
4. حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حل يحتوي على 2٪ مسحوق الحليب، 1٪ تريتون X100، streptavidin-Cy5 conjugate (1/500)، وDAPI (1/1000) في 0.1 M PBS، تحريكها بلطف.
5. اغسل الشريحة ثلاث مرات في 0.1 M PBS (2X لمدة 5 دقائق، 1X لمدة 2 ساعة). يمكن أن تستمر الغسيل الأخير لفترة أطول، تصل إلى 4 ساعات، للحد من تلطيخ الخلفية.
6. قبل تركيب الشريحة، استخدم مجهر الظهارة في 10x التكبير تكوين لمراقبة علامات الفلورسنت Cy5 من أجل تحديد جانب الشريحة التي تحتوي على الخلية ملحوظ في غرفة مليئة PBS.
7. نقل شريحة على شفرة، الخلية الجانب حتى، وتجفيفها مع الأنسجة الورقية، وجبل ذلك باستخدام عالية المقاومة تصاعد المتوسطة.
8. استخدام مجهر الفلورة في التكبير 10X في تكوين Cy5 وDAPI لفحص موقع جسم الخلية، وفي تكوين GFP لمراقبة afferents ملحوظ، أو مجهر البؤر عالية الدقة في 20X لجسدي مفصل، وaxonal، و مورفولوجيا الددرية(الشكل 2D, E). يتم تفصيل إعدادات التصفية في جدول المواد.

النتائج

وقد استخدم الإجراء المعروض هنا للتعبير عن قناة زرقاء حساسة للضوء (كرونوس) تنصهر إلى GFP في النواة الأبهرية الظهرية للالمهاد (ADN)، عن طريق حقن مجسم ة من الفيروس المرتبط بالغدة الدرقية. تم تحديد إحداثيات مجسمة وفقا لأطلس الدماغ الماوس واختبارها عن طريق حقن 200 نانولتر من الفلورسنت التتبع فلورو ?...

Discussion

في الحقن الفيروسي في الجسم الحي للتعبير عن أوبسينات حساسة للضوء في منطقة الدماغ المحددة هو طريقة الاختيار للتحليل البصري للاتصال الوظيفي طويل المدى^{10،11،17،18}. حقن مجسمة توفر إمكانية لاستهداف منطقة محددة من الدماغ على وج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm bur	Harvard Apparatus	724962
10 µL Hamilton syringe	Hamilton	1701 RN - 7653-01
10X PBS solution	Thermofisher Scientific	AM9624	text
36% PFA	Sigma-Aldrich	F8775
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED  DC/59022m	use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
All chemicals	Sigma
Bath temperature controler	Luigs & Neumann	SM7	Set at 34°C
beveled metal needle	Hamilton	7803-05	33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors	Dahle Allround	50038
Biocytin	Sigma	B4261	final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries	Havard Apparatus	GC150-10	1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller	Sutter Instruments	P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack	Thermofisher Scientific	28372
butterfly needle for perfusion	Braun	Venofix A	24G
CCD Camera	Andor	DL-604M
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710	20X
curved forceps	FST	11011-17
CY5 configuration (confocal)			Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633
CY5 configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI	Sigma	D9542
DAPI configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A	Axon Instruments
Digital handheld optical meter	ThorLabs	PM100D	Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight	Nightsea	DFP-1	excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA	Sigma	E4368	final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE-2000E	10 or 20X
Filter paper	Whatman
Fluoro-Ruby 10%	Millipore	AG335	disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate	Physitemp	HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml	Sanofi		5 ml vial
HEPES	Sigma	H3375	final 10 mM
High speed rotary micromotor kit	Foredom	K.1070	maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
KCl	Sigma	P4504	final 1,2 mM
Ketamine 1000	Virbac
Ketofen 10%	Merial		100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine)	MSD		16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery	Photonic (via Phymep)	10044
LED Power Supply	Cairn Research	OptoLED Light Source
Manipulators	Luigs & Neumann	SM-7
Mg-ATP 2H20	Sigma	A9187	final 4 mM
MgCl2	Sigma	63069	final 2 mM
Micro temperature controler	Physitemp	MTC-1
Milk powder	Carnation
MultiClamp 700B	Axon Instruments
Na Phosphocreatine	Sigma	P7936	final 10 mM
Na3-GTP 2H20	Sigma	G9002	final 0.4 mM
needle holder/hemostat	FST	13005-14
pClamp acquisition software	Axon Instruments
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	14-16 on the display for 2-3 ml/min
Potassium gluconate (K-gluconate)	Sigma	G4500	Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium	Thermofisher Scientific	P36390
Rompun 2% (xylazine)	Bayer
small scissors	FST	14060-09
Sodium chloride 0.9%	Virbac		dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT	VWR	630-1584
Stereotaxic frame with digital display	Kopf	Model 940	Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate	Life technologies	434315
Streptavidin-Cy5 conjugate	Thermofisher Scientific	S32357
Superglue3 Loctite	Dutscher	999227	1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid	Ethicon	F3210
Syringe pump	kdScientific	Legato 130 - 788130	Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer	Leica	VT1200S	speed 0.07, amplitude 1.
tubing	Gilson	F117942, F117946	Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope	Olympus	BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper	Nalgene