Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris

Résumé

Ce protocole décrit un ensemble de méthodes pour identifier la connectivité fonctionnelle spécifique de type cellulaire des entrées à longue portée des régions éloignées de cerveau utilisant des stimulations optogénétiques dans des tranches de cerveau ex vivo.

Résumé

La connaissance de la connectivité synaptique spécifique de type cellulaire est une condition préalable cruciale pour comprendre les circuits neuronaux à l'échelle du cerveau. L'étude fonctionnelle des connexions à longue portée nécessite des enregistrements ciblés de neurones uniques combinés à la stimulation spécifique d'intrants éloignés identifiés. Ceci est souvent difficile à réaliser avec les techniques conventionnelles et de stimulation électrique, parce que les axones des zones convergentes du cerveau en amont peuvent se mêler dans la région cible. Le ciblage stéréotaxique d'une région spécifique du cerveau pour l'expression par le virus des canaux ioniques sensibles à la lumière permet la stimulation sélective des axones provenant de cette région avec la lumière. Les injections stéréotaxiques intracérébrales peuvent être utilisées dans des structures bien délimitées, telles que les noyaux thalamiques antérieurs, en plus d'autres zones sous-corticales ou corticales dans tout le cerveau.

Décrit ici est un ensemble de techniques pour l'injection stéréotaxique précise des vecteurs viraux exprimant la canalrhodopsine dans le cerveau de souris, suivie par la photostimulation des terminaux d'axone dans la préparation de tranche de cerveau. Ces protocoles sont simples et largement applicables. En combinaison avec l'enregistrement de pince de correction de pleine cellule d'un neurone postsynaptically relié, la photostimulation des axones permet la détection des connexions synaptiques fonctionnelles, la caractérisation pharmacologique, et l'évaluation de leur force. En outre, le remplissage de biocytine du neurone enregistré peut être employé pour l'identification morphologique post-hoc du neurone postsynaptic.

Introduction

Définir la connectivité entre les régions du cerveau est nécessaire pour comprendre les circuits neuronaux. Les méthodes classiques de traçage anatomique permettent d'établir une connectivité interrégionale, et les études sur les lésions aident à comprendre l'organisation hiérarchique du flux d'information. Par exemple, les circuits cérébraux pour l'orientation spatiale et la signalisation de direction de la tête impliquent le flux directionnel de l'information du thalamus au présubiculum. Ceci a été démontré par des études de lésion des noyaux thalamicants antéro-dorsal (ADN) qui dégradent le signal de direction de tête dans le presubiculum dorsal en aval, aussi bien que le signal de cellule de grille parahippocampal^1,2.

La connectivité fonctionnelle entre les zones du cerveau est plus difficile à établir au niveau cellulaire et subcellulaire. Dans l'hippocampe, une anatomie très organisée permet d'étudier les connexions synaptiques spécifiques à la voie à l'aide de la simulation électrique dans la préparation des tranches. Les électrodes de stimulation placées dans le radiatum de strate de CA1 peuvent être utilisées pour stimuler spécifiquement l'entrée collatérale de Schaffer de CA3³. Des électrodes stimulantes placées dans la strate lacunosum moleculare de CA1 activeront l'entrée de chemin de perforant à CA1^4,5. La stimulation électrique active la libération de neurotransmetteurdes des terminaux d'axone ; cependant, il active les neurones avec somata près du site de stimulation ainsi que des axones de passage. Il est donc d'une utilité limitée pour l'étude des afférents des régions définies du cerveau lorsque les fibres de différentes régions d'origine s'entremêlent dans la structure cible, comme c'est généralement le cas dans le néocortex.

Les neurones peuvent également être stimulés par la lumière. Les méthodes optiques incluent la photoactivation du glutamate en cage, qui peut être combinée avec un ou deux photons de balayage laser. Plusieurs sites étroitement espacés peuvent être stimulés séquentiellement, sans dommages mécaniques au tissu⁶. Ceci a été utilisé avec succès pour cartographier les récepteurs synaptiques ainsi que d'activer les neurones individuels⁷. Bien que le décaissement du glutamate puisse être utilisé pour l'analyse des circuits locaux, il ne permet pas l'activation spécifique des entrées à longue portée.

Une méthode de choix pour l'étude de la connectivité à longue portée dans les circuits neuronaux est l'utilisation de l'expression de canalrhodopsine virus-négociée. En utilisant des injections stéréotaxiques in vivo telles que décrites ici, l'expression des canaux ioniques à portes lumineuses peut être ciblée et spatialement limitée à une région du cerveau désirée. De cette façon, les channelrhodopsines sont efficaces pour cartographier la connectivité excitatrice ou inhibitrice d'une région à sa cible. Les terminaux d'axones transfectés peuvent être stimulés avec la lumière dans une préparation de tranche de cerveau, et les enregistrements de correction-clamp comme lecture-out permettent l'examen des fonctions et des forces des composants spécifiques de circuit dans le cerveau^8. L'approche optogénétique combinée à l'injection stéréotaxique d'un virus offre une spécificité sans précédent et un contrôle génétique⁹. Stimuler avec la lumière permet en outre à la fois haute précision temporelle et spatiale^10,11.

Le présubiculum est une structure corticale à six couches à la transition de l'hippocampe et de la formation para-hippocampal^12,13. Il reçoit une entrée synaptique importante de l'ADN^11, mais aussi de plusieurs autres régions corticales et sous-corticales¹⁴. Ainsi, la stimulation sélective des terminaux d'axones thalamic dans une tranche présubiculaire n'est pas possible avec la stimulation électrique ni le glutamate uncaging. Décrits dans ce protocole sont des méthodes pour déterminer la connectivité fonctionnelle entre les régions du cerveau (ADN et presubiculum) en utilisant des injections stéréotaxiques précises de vecteurs viraux exprimant des canaux à porte-lumière. On décrit également la photostimulation des terminaux d'axones des neurones projetants dans leur région cible, couplée aux enregistrements de patch-clamp de cellules entières des neurones post-synaptiques dans la préparation de tranche de cerveau.

Protocole

Toutes les procédures ont été réalisées conformément à la directive du Conseil communautaire européen (2010/63/UE) et approuvées par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes. L'expérimentateur doit obtenir l'autorisation de la procédure pour se conformer à la réglementation locale.

1. Planification de l'expérience

1. Définir la zone du cerveau à cibler. Déterminer les coordonnées stéréotaxiques du site d'injection à l'aide d'un atlas du cerveau de souris¹⁵. Pour le noyau thalamique antéro-dorsal droit (ADN), les coordonnées sont : -0,82 postérieur, 0,75 latéral, -3,2 profondeur (mm) par rapport au bregma. Les coordonnées peuvent devoir être ajustées pour les animaux d'âge, de sexe ou de souche différents.
2. Confirmer et documenter l'exactitude des coordonnées en injectant un traceur fluorescent (150 à 300 nL) observable avec un microscope épifluorescence dans une expérience pilote(figure 1A,B).
3. Définir le type de virus à injecter. Conserver le virus dans 6 aliquots de L à -80 oC, comme le recommande le producteur. Apportez 1 aliquot placé sur la glace à la salle de chirurgie, pour l'injection d'un à six animaux sur un jour donné. Les règlements de biosécurité pour l'utilisation de l'AAV peuvent dépendre du pays ou de l'institution, et l'utilisation d'un capot PSM 2 peut être nécessaire.
   REMARQUE: Ici, nous utilisons un sérotype AAV2/5 exprimant Chronos, une variante rapide channelrhodospin-2, fusionné à la protéine fluorescente verte sous le contrôle du promoteur Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. Chirurgie stéréotaxique

1. Installez un cadre stéréotaxique équipé d'un support de pompe sur un banc de laboratoire standard stable. Ajustez le stéréoscope afin de voir clairement la zone où la tête de l'animal sera placée. Utilisez une source de lumière LED pour l'éclairage. Faites pivoter le stéréoscope pour accéder au support de la pompe, ce qui n'est pas nécessaire pour les premières étapes de la chirurgie.
2. Installez une seringue Hamilton de 10 l l munie d'une aiguille en métal bevée de 33 G dans le support de la pompe. Testez le système d'éjection avec de l'eau.
3. Anesthésiez une souris C57BL6 de 4 à 5 semaines avec une injection intrapéritonéale d'un mélange d'hydrochlorure de kétamine et de xylazine (100 mg/kg et 10 mg/kg, respectivement). Préparer un mélange de 1 ml de kétamine et de 0,5 ml de xylazine dans 8,5 ml de 0,9 % de NaCl. Cela se traduira par 10 mg/mL de kétamine et 1 mg/mL de xylazine dans le mélange. De ce mélange, injectez intraperitoneally 10 L par gramme du poids corporel de l'animal. La durée de l'anesthésie est d'environ 1 h.
4. Vérifier que l'animal est bien anesthésié avec une pincée d'orteil. Ensuite, sortez la langue pour faciliter la respiration. Raser les cheveux crâniens.
5. Injecter 20 ll d'hydrochlorure de lidocaïne (4 mg/mL; 2 mg/kg) sous la peau de la tête pour une anesthésie locale et attendre 5 min pour que l'effet commence. Pour éviter les lésions oculaires dues à la sécheresse, recouvrez les yeux d'onguent ophtalmique topique.
6. Pour exposer le crâne, créer une coupe droite dans le cuir chevelu avec de petits ciseaux de chirurgie. Placez l'animal dans un cadre stéréotaxique, en insérant les barres d'oreille légèrement rostral à l'oreille réelle pour se reposer sur l'os et tirer vers le bas la peau, ce qui devrait créer un bon accès au crâne. Resserrer en place. Installer le morceau de nez.
7. Maintenir le corps de l'animal horizontalement au niveau de la tête à l'aide d'un support ajusté en hauteur. Placez un coussin chauffant sous la souris pour le garder à la température physiologique.
8. Nettoyer le crâne en appliquant 0,9% NaCl avec un coton-tige pour enlever les tissus mous de l'os. Utilisez le stéréoscope pour le reste de la chirurgie.
9. Ajustez le crâne de sorte que l'axe bregma-lambda est de niveau, se déplaçant vers le haut ou vers le bas du nez et des dents pièce. Cela nécessite des mesures itératives de bregma et lamba, car les deux vont changer après ajustement du niveau du nez.
10. Trouvez l'emplacement du site d'injection sur le crâne. Ajustez l'aiguille d'injection au-dessus du site d'injection en fonction des coordonnées postérieures et médiales et marquez le crâne avec une aiguille jetable. Déplacez l'aiguille d'injection vers le haut de 4 cm.
11. Utilisez une bavure de 0,5 mm avec une perceuse pour réaliser une craniotomie de 1 mm de diamètre sur la marque, à la moitié de la vitesse maximale. Swab saignement éventuel avec un tissu de papier.
12. Videz l'eau contenue dans la seringue de Hamilton pour l'entreposer en l'éjectant complètement avec la pompe. Seule l'aiguille sera encore remplie d'eau. L'aiguille est lavée entre chaque utilisation avec de l'eau déionisée pure. La stérilisation n'est pas nécessaire.
13. Prenez l'aliquot de virus qui doit être utilisé pour cette journée. Assurez-vous que la solution virale n'est plus congelée mais qu'elle est restée refroidie (près de 0 oC, sur la glace). Retirez seulement brièvement de la glace pour obtenir 700 nL avec une micropipette pour de petits volumes. Déposer la goutte sur un morceau de 5 cm x 5 cm de film de paraffine. Évitez de créer des bulles. Remettre la solution virale restante sur la glace.
    REMARQUE : Le volume de chute devrait être supérieur au volume d'injection souhaité (700 nL pour 200 nL injectés). Cela donnera une marge de sécurité au cas où une partie du liquide serait perdue pendant le transfert et permettra d'effectuer une petite éjection d'essai (étape 2.16) avant de procéder.
14. Placer le film de paraffine sur la craniotomie. Plongez l'aiguille dans la goutte de la solution virale sans changer la position antéro-postérieure et latérale.
15. Utilisez la fonction "retirer" de la pompe pour remplir la seringue avec environ 500 nL de solution virale éliminée sur le film de paraffine.  Faites-le sous contrôle visuel (stéréoscope), regardez la goutte disparaître, et assurez-vous de ne pas aspirer l'air.
16. Assurez-vous que la seringue a été remplie correctement. Vérifier le fonctionnement du système d'éjection en descendant le piston pour tester l'éjection d'une petite goutte de liquide de 50 nL sous contrôle visuel. Essuyez la goutte.
17. Insérez l'aiguille dans le cerveau à la profondeur choisie, en tournant le bouton contrôlant l'axe dorso-ventral de l'appareil stéréotaxique dans le sens des aiguilles d'une montre. Appuyez sur le bouton "run" (vitesse 15 nL/min par volume de 150 nL injecté). Un petit volume (50-300 nL, selon le virus utilisé) est lentement éjecté sur 10 min avec une pompe automatique.
18. Attendez 10 min après l'injection pour éviter les fuites du site d'injection. Ensuite, retirez lentement l'aiguille de 3 à 5 min en tournant le bouton contrôlant l'axe dorso-ventral dans le sens inverse des aiguilles d'une montre.
19. Faites pivoter la partie verticale du cadre stéréotaxique avec la seringue loin de l'animal. Lavez immédiatement l'aiguille dans de l'eau propre distillée en la remplissant plusieurs fois, afin d'éviter l'engorgement. Rangez la seringue remplie d'eau.
20. Retirez la souris du cadre stéréotaxique. Suturer la peau avec 4-0 filament de suture polyamide. Faire trois ou quatre stiches, à égalité avec 2-1-1 noeuds chirurgicaux standard.
21. Placez la souris dans une cage chauffée jusqu'à ce qu'elle se réveille complètement de l'anesthésie, et fournir de l'eau et de la nourriture trempée dans un plat Petri placé sur le sol. Si la source de chaleur est sous la cage, utilisez une grille d'espaceur pour éviter la surchauffe.
    REMARQUE : Selon les lignes directrices locales, une seule dose de kétoprofène (2-5 mg/kg, sous-cutanée) ou de buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg, sous-cutané) peut être appliquée pour prévenir la douleur.
22. Lorsque l'animal est complètement éveillé, retournez-le dans sa cage d'origine et surveillez son bien-être, en particulier le lendemain de l'injection. Vérifiez s'il y a des signes de douleur. Si une modification comportementale est observée, l'animal est pesé pour surveiller son poids corporel.
23. Selon le virus utilisé, le temps d'expression complète peut varier. Ici, nous permettons 3 semaines pour l'expression de AAV5. Syn.Chronos-GFP.

3. Solutions pour les enregistrements de tranches aigues et la fixation

1. Préparer des solutions de stock de solution de coupe concentrée 10x (125 mM NaCl, 25 mM de saccharose, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO₃, 1,25 mM NaH₂PO_4, et 2,5 mM D-glucose) et solution artificielle de liquide céphalo-rachidien (ACSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mMM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO_4, et 11 mM D-glucose) dans de l'eau déionisée pure avant les expériences d'électrophysiologie. Entreposez ces solutions à 4 oC en bouteilles de 1 L sans CaCl₂ et MgCl₂.
2. Le jour de l'expérience, diluer les solutions stock de la solution de coupe et ACSF 10x à un volume final de 0,5 L chacun. Agiter avec un agitateur magnétique et oxygéner en bouillonnant avec 95%/5% O₂/CO₂. Ajouter des ions divalents pour obtenir des concentrations finales de 0,1 mM CaCl₂ et 7 mM MgCl₂ pour la solution de coupe, et 2 mM CaCl₂ et 2 mM MgCl₂ pour L'ACSF.
3. Préparer la solution de pipette à base de potassium-gluconate pour contenir : 135 mM K-gluconate, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 4 mM MgATP, 0,4 mM Tris-GTP, 10 mM Na₂-phosphocreatine, et 2,7 à 7,1 mM biocytine pour les cellules post-hoc révélation morphologie. Ajustez le pH de la solution à 7,3 et l'osmolarité à 290 mOsm. Conserver 1 ml d'aliquots à -20 oC.
4. Préparer 0,1 M PBS en diluant les sachets de poudre à mélange sec BupH PBS dans 500 ml d'eau distillée, ce qui donne 0,1 M de phosphate de sodium, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
5. Pour préparer 1 L de 4% de solution PFA, diluer 111 ml de 36% de PFA liquide à 36% et 90 ml de solution 10x PBS dans de l'eau distillée.
6. Préparer une solution de saccharose de 30 % contenant 150 g de saccharose dans 500 ml de 0,1 M PBS.

4. Préparation de tranches de cerveau

1. Préparer l'espace de banc avec du papier absorbant avant la perfusion.
2. Installez un goutte-à-goutte à environ 1 m au-dessus du banc pour la perfusion alimentée par gravité. Fixer une aiguille papillon de 24 G.
3. Entourer la chambre de coupe du vibratome de glaçons et la conserver au congélateur.
4. Anesthésiez la souris avec l'injection intrapéritonéale du même mélange de kétamine-xylazine utilisé pour la chirurgie. Évaluez le stade de l'anesthésie en pinçant l'orteil avec des forceps. Lorsque vous dormez complètement, injectez 100 l'héparine (5000 U.I./mL) par voie intrapéritone.
5. Fixer l'animal avec du ruban adhésif sur le papier absorbant, couché sur le dos. Ouvrez la cage thoracique en coupant les côtes sur les côtés gauche et droit avec de petits ciseaux, du diaphragme vers le haut. Maintenir la cage thoracique ouverte à l'aide de ruban adhésif.
6. Pincez l'aorte descendante avec un hemostat et perfssez par le ventricule gauche du cœur avec 4 oC refroidis et oxygénés (95%/5% O₂/CO₂), coupant la solution à travers l'aiguille papillon de 24 G. Après 5 s, ouvrir l'atrium droit avec de petits ciseaux.
7. Après 5 min de perfusion, lorsque les organes sont sans sang, arrêter la perfusion. Décapiter l'animal avec de gros ciseaux et immerger la tête dans une solution de coupe refroidie et oxygénée à 4 oC dans un plat Petri.
8. Pour extraire le cerveau, couper la peau du cou au nez, puis sectionnez les dernières vertèbres du crâne avec des ciseaux. Rétractez manuellement la peau et utilisez de petits ciseaux pour ouvrir le crâne, en le coupant le long de la ligne médiane, du caudal au rostral, vers le haut jusqu'entre les yeux.
9. Enlever soigneusement l'os pariétal et la partie caudale de l'os frontal avec des forceps courbés ou osseux. Extraire le cerveau avec une petite spatule arrondie en insérant l'instrument entre le cerveau et le plancher crânien, sectionnant l'ampoule olfactive, le nerf optique et d'autres nerfs crâniens, et le cervelet.
10. Plonger délicatement le cerveau dans une solution de coupe glacée (4 oC) dans un bécher. Placez le cerveau sur du papier filtre pour sécher doucement la surface corticale. Collez le cortex cérébral vers le bas au porte-échantillon d'un vibratome, avec le côté caudal faisant face à la lame, afin de couper les tranches horizontales de cerveau.
11. Remplissez la chambre de coupe d'une solution de coupe oxygénée à froid afin que le cerveau soit complètement immergé. Faire une coupure sur l'hémisphère gauche (contralatéral au côté injecté) pour éviter l'ambiguïté gauche-droite potentielle sur les tranches.
    CAUTION : Oxygénez toujours la solution et protégez les tranches de l'exposition à la lumière.
12. Couper des tranches de 300 m d'épaisseur avec le vibratome, à une vitesse de 0,07 mm/s à 1 mm d'amplitude. À ce stade, il est recommandé de vérifier brièvement l'expression Chronos-GFP dans le thalamus à l'aide d'une lampe de poche fluorescente (440-460 nm) et des verres filtrecorrespondant (500 nm de long pass).
13. Isoler la région hippocampique à l'eau avec un scalpel et le transférer dans une chambre placée dans un bécher rempli de bain réchauffé (34 oC), oxygéné (95%/5% O₂/CO₂) ACSF.
14. Après 15 min, sortir la chambre du bain d'eau chauffé et laisser reposer les tranches à température ambiante, encore oxygénée pendant au moins 45 min jusqu'à l'utilisation.

5. Enregistrement patch-clamp à cellules entières

1. Transférer délicatement une tranche de cerveau contenant le complexe hippocampique avec une pipette de transfert de verre sur mesure à la chambre d'enregistrement montée sur un microscope droit. Une pipette de transfert est faite d'une pipette Pasteur raccourcie (diamètre intérieur de 6,5 mm) fixée à une ampoule de pipette en caoutchouc. Perfil le long de la chambre d'enregistrement (3 mL) avec 34 oC (chauffé) ACSF bullé avec 95%/5% O₂/CO₂. Définir la vitesse de la pompe péristétique à 2-3 ml/min.
2. Examinez brièvement l'expression Chronos-GFP dans les terminaux d'axone dans la région d'intérêt avec l'éclairage LED bleu (470 nm) et observez avec un objectif 4x. La fluorescence du GFP est visualisée à l'aide d'un filtre d'émission approprié, avec une image de caméra CCD affichée sur un écran d'ordinateur.
3. Placez une ancre de tranche faite à partir d'un fil de platine en forme de U avec des cordes de nylon étroitement espacées (« harpe ») sur la tranche pour la maintenir.
4. Passer à un objectif d'immersion 63x et ajuster la mise au point. Vérifiez si les axones expriment Chronos-GFP et choisissez un neurone pyramidal pour l'enregistrement des correctifs.
5. Déplacez l'objectif vers le haut.
6. Tirez des pipettes à l'aide d'un pull à électrodes Brown-Flaming en verre borosilicate. Le tireur est réglé pour produire des pipettes d'environ 1 m de diamètre. Remplissez les pipettes avec une solution interne à base de K-gluconate.
7. Monter la pipette dans le porte-pipette sur le front-étape. Abaissez la pipette dans la chambre et trouvez la pointe sous l'objectif. La résistance à la pipette doit se sier dans la distillage entre 3 et 8 M. Appliquer une légère pression positive avec une seringue afin de voir un cône de solution sortir de la pipette et abaisser progressivement la pipette et l'objectif à la surface de la tranche.
8. Patchez la cellule en configuration tension-clamp : approchez-vous du neurone identifié et appuyez délicatement sur la pointe de la pipette sur le soma. La pression positive devrait produire une fossette sur la surface de la membrane. Relâchez la pression pour créer un sceau giga-ohm (résistance de g '. Une fois scellé, définir la tension de retenue à -65 mV. Briser la membrane avec une forte impulsion de pression négative: ceci est réalisé en appliquant une forte aspiration à un tube relié au porte-pipette.
9. Enregistrez en mode pince à courant à cellules entières les réponses du neurone à l'hyperpolarisation et à la dépolarisation des étapes actuelles (Figure 2A).
   REMARQUE : Ce protocole sera utilisé pour déterminer les propriétés intrinsèques actives et passives de la cellule. Les routines MATLAB personnalisées sont utilisées pour l'analyse hors ligne^10,16.
10. Enregistrez dans les réponses postsynaptic de courant ou de tension-clamp à la stimulation de LED de champ entier 475 nm des fibres afférentes exprimant Des Chronos. Stimuler avec des trains de 10 stimulations de 2 ms durées à 20 Hz (Figure 2B,C). L'intensité lumineuse peut varier de 0,1 à 2 mW.
    REMARQUE : L'intensité lumineuse a été mesurée à l'aide d'une console de puissance optique numérique portative équipée d'un capteur photodiode, placée sous l'objectif. Les latences de réponse de 2 à 4 m s sont caractéristiques pour une connexion monosynaptique.
11. Pour étudier la nature de la transmission synaptique entre les afférents à longue portée et le neurone enregistré, différents agents pharmacologiques peuvent être utilisés. Pour distinguer pharmacologiquement les réponses directes et monosynaptiques des réponses indirectes par l'activation du réseau, ajoutez 1 M TTX et 100 M 4-AP à l'ACSF.
    REMARQUE : L'application de bain des bloqueurs de récepteur de glutamate permet de déterminer la nature du neurotransmetteur qui est libéré et l'identité des récepteurs postsynaptic. Par exemple, les récepteurs de glutamate de type AMPA seront bloqués par les récepteurs NBQX (10 M) et NMDA par aPV (100 m). Selon l'objectif de l'étude, des protocoles peuvent être conçus pour étudier la dépendance à la tension des réponses synaptiques ou de la dynamique de réponse au fil du temps.
12. Laver avec la solution ACSF originale pour patcher une autre cellule, ou transférer la tranche contenant un neurone rempli de biocytine dans une petite fiole remplie de 4% de PFA.
13. Après la fixation de nuit en 4% PFA, laver la tranche en 0.1 M PBS (2x pour 5 min, 1x pour 20 min).
14. Conserver dans un saccharose de 30 % à 4 oC.

6. Révélation de Biocytin

1. Transférer les tranches fixes contenant des neurones remplis de biocytine sur une lame de verre dans une goutte de 30% de saccharose et effectuer trois cycles de gel-dégel: placer la lame sur la glace sèche disposée dans une boîte en polystyrène pendant 1 min jusqu'à ce que les gouttes de saccharose sont complètement congelées, puis appuyez sur la lame contre la paume de la main pour décongeler.
2. Laver la tranche 3x en 0,1 M PBS (2x pour 5 min, 1x pour 1 h et 50 min), doucement agitée. Ne pas dépasser 2 h pour le dernier lavage.
3. Pré-incuber la tranche à RT pendant 2 h dans une solution tampon agitée contenant 2 % de lait en poudre (0,4 g sur 20 ml) pour saturer les sites non spécifiques et 0,5 % Triton X100 (0,1 ml sur 20 ml) pour perméabiliser les membranes en 0,1 M PBS.
4. Incuber toute la nuit à 4 oC dans une solution contenant 2 % de lait en poudre, 1 % de Triton X100, de conjugué streptavidin-Cy5 (1/500) et DAPI (1/1000) dans 0,1 M PBS, doucement agité.
5. Laver la tranche trois fois en 0,1 M PBS (2x pour 5 min, 1x pour 2 h). Le dernier lavage peut durer plus longtemps, jusqu'à 4 h, pour réduire la coloration de fond.
6. Avant de monter la tranche, utilisez un microscope épifluorescence à 10x grossissement configuré pour observer les marqueurs fluorescents Cy5 afin d'identifier le côté de la tranche contenant la cellule marquée dans une chambre remplie de PBS.
7. Transférer la tranche sur une lame, côté cellule vers le haut, la sécher avec un papier mouchoir et la monter à l'aide d'un milieu de montage à haute résistance.
8. Utilisez un microscope épifluorescence à 10x grossissement en configuration Cy5 et DAPI pour examiner l'emplacement du corps cellulaire, et dans la configuration GFP pour observer les afférents marqués, ou un microscope confocal à haute résolution à 20x pour le somatique détaillé, axonal, et morphologie dendritique (Figure 2D,E). Les paramètres du filtre sont détaillés dans le tableau des matériaux.

Résultats

La procédure présentée ici a été utilisée pour exprimer une canalrhodopsine bleu sensible à la lumière (Chronos) fusionnée à GFP dans le noyau antéro-dorsal du thalamus (ADN), par injection stéréotaxique du virus antérograde adéno-associé. Les coordonnées stéréotaxiques ont été déterminées selon un atlas du cerveau de souris et testées en injectant 200 nL de fluoro-ruby fluorescent. L'animal a été sacrifié 10 min après l'injection, et le cerveau a été extrait et fixé pendant la nuit. Les se...

Discussion

L'injection virale in vivo pour exprimer les opsines sensibles à la lumière dans une zone cérébrale définie est une méthode de choix pour l'analyse optogénétique de la connectivité fonctionnelle à longue portée^10,11,17,18. Les injections stéréotaxiques offrent la possibilité de cibler précisément une zone spécifique du cerveau. La coexpression d'un opsin avec un journaliste flu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm bur	Harvard Apparatus	724962
10 µL Hamilton syringe	Hamilton	1701 RN - 7653-01
10X PBS solution	Thermofisher Scientific	AM9624	text
36% PFA	Sigma-Aldrich	F8775
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED  DC/59022m	use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
All chemicals	Sigma
Bath temperature controler	Luigs & Neumann	SM7	Set at 34°C
beveled metal needle	Hamilton	7803-05	33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors	Dahle Allround	50038
Biocytin	Sigma	B4261	final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries	Havard Apparatus	GC150-10	1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller	Sutter Instruments	P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack	Thermofisher Scientific	28372
butterfly needle for perfusion	Braun	Venofix A	24G
CCD Camera	Andor	DL-604M
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710	20X
curved forceps	FST	11011-17
CY5 configuration (confocal)			Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633
CY5 configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI	Sigma	D9542
DAPI configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A	Axon Instruments
Digital handheld optical meter	ThorLabs	PM100D	Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight	Nightsea	DFP-1	excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA	Sigma	E4368	final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE-2000E	10 or 20X
Filter paper	Whatman
Fluoro-Ruby 10%	Millipore	AG335	disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate	Physitemp	HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml	Sanofi		5 ml vial
HEPES	Sigma	H3375	final 10 mM
High speed rotary micromotor kit	Foredom	K.1070	maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
KCl	Sigma	P4504	final 1,2 mM
Ketamine 1000	Virbac
Ketofen 10%	Merial		100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine)	MSD		16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery	Photonic (via Phymep)	10044
LED Power Supply	Cairn Research	OptoLED Light Source
Manipulators	Luigs & Neumann	SM-7
Mg-ATP 2H20	Sigma	A9187	final 4 mM
MgCl2	Sigma	63069	final 2 mM
Micro temperature controler	Physitemp	MTC-1
Milk powder	Carnation
MultiClamp 700B	Axon Instruments
Na Phosphocreatine	Sigma	P7936	final 10 mM
Na3-GTP 2H20	Sigma	G9002	final 0.4 mM
needle holder/hemostat	FST	13005-14
pClamp acquisition software	Axon Instruments
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	14-16 on the display for 2-3 ml/min
Potassium gluconate (K-gluconate)	Sigma	G4500	Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium	Thermofisher Scientific	P36390
Rompun 2% (xylazine)	Bayer
small scissors	FST	14060-09
Sodium chloride 0.9%	Virbac		dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT	VWR	630-1584
Stereotaxic frame with digital display	Kopf	Model 940	Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate	Life technologies	434315
Streptavidin-Cy5 conjugate	Thermofisher Scientific	S32357
Superglue3 Loctite	Dutscher	999227	1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid	Ethicon	F3210
Syringe pump	kdScientific	Legato 130 - 788130	Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer	Leica	VT1200S	speed 0.07, amplitude 1.
tubing	Gilson	F117942, F117946	Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope	Olympus	BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper	Nalgene