Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Özet

Bu protokol, ex vivo beyin dilimlerinde optogenetik stimülasyonlar kullanarak uzak beyin bölgelerinden gelen uzun menzilli girdilerin hücre tipi spesifik fonksiyonel bağlantısını belirlemek için bir dizi yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Hücre tipi spesifik sinaptik bağlantı bilgisi, beyin çapındaki nöronal devreleri anlamak için çok önemli bir ön koşuldur. Uzun menzilli bağlantıların fonksiyonel incelemesi, tanımlanan uzak girdilerin spesifik uyarılmasıyla birlikte tek nöronların hedefli kayıtlarını gerektirir. Bu genellikle geleneksel ve elektriksel stimülasyon teknikleri ile elde etmek zordur, yukarı beyin bölgelerinde yakınsama aksonhedef bölgede iç içe olabilir, çünkü. Işığa duyarlı iyon kanallarının virüs aracılı ekspresyonu için belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik hedeflemesi, o bölgeden gelen aksonun ışıkla seçici olarak uyarılmasını sağlar. İntraserebral stereotaksik enjeksiyonlar beyin deki diğer subkortikal veya kortikal alanlara ek olarak, anterior talamik çekirdekleri gibi iyi delimited yapılarda kullanılabilir.

Burada açıklanan fare beyninde channelrhodopsin ifade viral vektörlerin hassas stereotaksik enjeksiyon için teknikler bir dizi, beyin dilimi hazırlanmasında akson terminalleri fotostimülasyon takip. Bu protokoller basit ve yaygın olarak uygulanabilir. Postsynaptically bağlı nöron dan tam hücre yama kıskaç kaydı ile birlikte, aksonların fotostimülasyon fonksiyonel sinaptik bağlantıların tespiti sağlar, farmakolojik karakterizasyon, ve güçlerinin değerlendirilmesi. Buna ek olarak, kaydedilen nöronun biyositin dolgu postinaptik nöronun post-hok morfolojik belirlenmesi için kullanılabilir.

Giriş

Beyin bölgeleri arasındaki bağlantıyı tanımlamak nöral devreleri anlamak için gereklidir. Klasik anatomik izleme yöntemleri bölgelerarası bağlantının kurulmasına olanak sağlarken, lezyon çalışmaları bilgi akışının hiyerarşik organizasyonunu anlamaya yardımcı olur. Örneğin, uzamsal oryantasyon ve baş yön sinyali için beyin devreleri, talamustan presubiculuma kadar olan bilginin yön akışını içerir. Bu antero-dorsal talamik çekirdeklerin lezyon çalışmaları ile gösterilmiştir (ADN) downstream dorsal presubiculum baş yön sinyalini bozan, yanı sıra parahipokampal ızgara hücre sinyali^1,2.

Beyin bölgeleri arasındaki fonksiyonel bağlantı hücresel ve hücre altı düzeyde kurmak daha zordur. Hipokampus, son derece organize anatomi dilim hazırlanmasında elektrik simülasyonu kullanarak yola özgü sinaptik bağlantıları araştırmak için izin verir. CA1'in stratum radyatumuna yerleştirilen stimülasyon elektrotları özellikle CA3^3'tenSchaffer teminat girdisini uyarmak için kullanılabilir. CA1'in stratum lacunosum molekülerine yerleştirilen uyarıcı elektrotlar, CA1^4,5'eperforant yol girişini aktive edecektir. Elektriksel stimülasyon akson terminallerinden nörotransmitter salınımı aktive; ancak, stimülasyon bölgesine yakın somata ile nöronlar aktive yanı sıra geçiş aksonları. Bu nedenle, neokortekste olduğu gibi, farklı orijin bölgelerinden liflerin hedef yapıda iç içe geçtiğinde, tanımlanmış beyin bölgelerinden gelen afferentlerin incelenmesinde sınırlı kullanım söz konusudur.

Nöronlar da ışık ile uyarılabilir. Optik yöntemler kafesli glutamat fotoaktivasyonu içerir, hangi bir kombine edilebilir- veya iki foton lazer tarama. Birden fazla yakın aralıklı siteler ardışık olarak uyarılabilir, doku hiçbir mekanik hasar ile⁶. Bu başarıyla sinaptik reseptörleri harita yanı sıra bireysel nöronlar^{etkinleştirmek}için kullanılmıştır 7 . Glutamat uncaging yerel devre analizi için kullanılabilir iken, uzun menzilli girişlerin özel aktivasyonu için izin vermez.

Nöronal devrelerde uzun menzilli bağlantının araştırılması için tercih edilen bir yöntem virüs aracılı kanalrhodopsin ekspresyonu kullanımıdır. Burada açıklandığı gibi in vivo stereotaksik enjeksiyonlar kullanılarak, ışık kapılı iyon kanallarının ifadesi hedeflenebilir ve mekansal olarak istenilen beyin bölgesi ile sınırlı olabilir. Bu şekilde, kanaloidpsinler bir bölgeden hedefine uyarıcı veya inhibitör bağlantı haritalama için etkilidir. Transfected akson terminalleri bir beyin dilimi hazırlık ışık ile uyarılabilir, ve yama-kelepçe kayıtları bir okuma olarak beyindeki belirli devre bileşenlerinin işlevleri ve güçlü lerinin incelenmesine izin⁸. Optogenetik yaklaşım bir virüsün stereotaksik enjeksiyonu ile birlikte benzeri görülmemiş özgüllük ve genetik kontrol sunuyor⁹. Ayrıca ışık ile uyarıcı hem yüksek zamansal ve mekansal hassasiyet^10,11sağlar.

Presubiculum hipokampus geçiş altı katmanlı kortikal yapı ve para-hipokampal oluşumu^12,13. ADN^11'den önemli sinaptik giriş alır, aynı zamanda diğer birçok kortikal ve subkortikal bölgeden^14. Bu nedenle, bir presubiküler dilim içinde talamik aksonlar terminallerinin seçici stimülasyon elektriksel stimülasyon veya glutamat uncaging ile mümkün değildir. Bu protokolde açıklanan yöntem, ışık kapılı kanalları ifade eden viral vektörlerin hassas stereotaksik enjeksiyonları kullanılarak beyin bölgeleri (ADN ve presubiculum) arasındaki fonksiyonel bağlantıyı belirleme yöntemleridir. Ayrıca açıklanan kendi hedef bölgede nöronlar projektör aksonların terminalleri fotostimülasyon, beyin dilimi hazırlanmasında post-sinaptik nöronların tüm hücre yama-kelepçe kayıtları ile birleştiğinde.

Protokol

Tüm prosedürler Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi (2010/63/EU) uyarınca gerçekleştirilmiştir ve Paris Descartes Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Deneyci, yerel yönetmeliklere uymak için prosedür için yetki almalıdır.

1. Deneyin planlanması

1. Hedef alınacak beyin bölgesini tanımlayın. Bir fare beyin atlası¹⁵yardımıyla enjeksiyon alanının stereotaksik koordinatlarını belirleyin. Sağ antero-dorsal talamik çekirdek için (ADN), koordinatları şunlardır: -0.82 posterior, 0.75 lateral, -3.2 derinlik (mm) bregma göre. Koordinatların farklı yaş, cinsiyet veya zorlanmadaki hayvanlar için ayarlanması gerekebilir.
2. Bir pilot deneyde epifloresan mikroskobu ile gözlemlenebilir bir floresan izleyici (150 ila 300 nL) enjekte ederek koordinatların kesinliğini doğrulayın ve belgelayın(Şekil 1A,B).
3. Enjekte edilecek virüsün türünü tanımlayın. Virüsü üreticinin önerdiği şekilde -80 °C'de 6°L aliquots'ta saklayın. Belirli bir günde bir ila altı hayvan enjeksiyonu için, ameliyathaneye buz üzerine yerleştirilen 1 aliquot getirin. AAV kullanımı için biyogüvenlik düzenlemeleri ülkeye veya kuruma bağlı olabilir ve PSM 2 başlık kullanımı gerekebilir.
   NOT: Burada, Synapsin organizatörü AAV5 kontrolü altında yeşil floresan proteinerimiş hızlı bir channelrhodospin-2 varyantı olan Chronos'u ifade eden Bir AAV2/5 serotipi kullanıyoruz. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. Stereotaksik cerrahi

1. Kararlı bir standart laboratuvar tezgahüzerinde bir pompa tutucu ile donatılmış bir stereotaksik çerçeve yükleyin. Stereoskopu, hayvanın kafasının yerleştirileceği bölgeyi net bir şekilde görebilmek için ayarlayın. Aydınlatma için bir LED ışık kaynağı kullanın. Ameliyatın ilk adımları için gerekli olmayan pompa tutucuya erişmek için stereoskopu uzağa döndürün.
2. Pompa tutucuya 33 G yontucu metal iğne ile donatılmış 10 μL Hamilton şırıngası takın. Fırlatma sistemini suyla test edin.
3. Ketamin hidroklorür ve ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile 4 ila 5 haftalık C57BL6 fare (sırasıyla 100 mg/kg ve 10 mg/kg) anestezi. 1 mL ketamin ve 0,5 mL xylazine karışımını 8,5 mL %0,9 NaCl olarak hazırlayın. Bu karışımda 10 mg/mL ketamin ve 1 mg/mL xylazine ile sonuçlanır. Bu karışımdan, hayvanın vücut ağırlığının gramı için intraperitoneally 10 μL enjekte edin. Anestezi süresi yaklaşık 1 saattir.
4. Hayvanın ayak parmak çimdikiyle iyi anesthetize olduğunu doğrulayın. Sonra, nefes kolaylaştırmak için dil çekin. Kafatasının saçlarını tıraş edin.
5. Lokal anestezi için başın derisinin altına 20 μL lidokain hidroklorür (4 mg/mL; 2 mg/kg) enjekte edin ve etkinin başlaması için 5 dakika bekleyin. Kuruluk nedeniyle göz hasarı önlemek için, topikal oftalmik merhem ile gözleri kaplayın.
6. Kafatası ortaya çıkarmak için, küçük cerrahi makas ile kafa derisi düz bir kesim oluşturun. Bir stereotaksik çerçeve içinde hayvan yerleştirin, kemik üzerinde dinlenmek ve kafatası için iyi bir erişim oluşturmalıdır deri aşağı çekmek için gerçek kulak biraz rostral kulak çubukları ekleyerek. Yerine sıkın. Burun parçasını töben.
7. Boy ayarlı bir destek kullanarak hayvanın vücudunu yatay olarak baş seviyesinde koruyun. Fizyolojik sıcaklıkta tutmak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin.
8. Kemikten yumuşak doku kaldırmak için bir pamuklu bez ile% 0.9 NaCl uygulayarak kafatası temizleyin. Ameliyatın geri kalanında stereoskopu kullan.
9. Kafatasını, bregma-lambda ekseninin seviyesi, burun ve diş parçasının yukarı veya aşağı hareket ettirilmesi için ayarlayın. Bu bregma ve lamba yinelemeli önlemler gerektirir, her ikisi de burun seviyesinin ayarını takiben değişecek gibi.
10. Kafatasındaki enjeksiyon yerini bulun. Enjeksiyon iğnesini enjeksiyon bölgesinin üstündeki posterior ve medial koordinatlara göre ayarlayın ve kafatasını tek kullanımlık bir iğneyle işaretleyin. Enjeksiyon iğnesini 4 cm yukarı doğru hareket ettirin.
11. Maksimum hızın yarısında 1 mm çapında kraniyotomi gerçekleştirmek için matkapla 0,5 mm'lik bir çapak kullanın. Bir kağıt mendil ile nihai kanama swab.
12. Hamilton şırıngasında bulunan suyu tamamen pompayla dışarı atarak depolamak için boşaltın. Sadece iğne hala suyla dolacak. İğne saf deiyonize su ile her kullanım arasında yıkanır. Sterilizasyon gerekli değildir.
13. Bu gün için kullanılacak virüs aliquot atın. Viral çözeltinin artık dondurulmadığını ancak soğutulduğundan emin olun (buz üzerinde 0 °C'ye yakın). Sadece kısa bir süre küçük hacimler için bir mikropipet ile 700 nL elde etmek için buz kaldırın. 5 cm x 5 cm'lik parafin filminin üzerine damlayı yatırın. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Kalan viral çözeltiyi tekrar buza koy.
    NOT: Damla hacmi istenilen enjeksiyon hacminden daha büyük olmalıdır (enjekte edilen 200 nL için 700 nL). Bu, sıvının bir kısmının aktarım sırasında kaybolması durumunda bir güvenlik marjı sağlar ve devam etmeden önce küçük bir test çıkarma işlemini (adım 2.16) sağlar.
14. Parafin filmini kraniyotominin üstüne yerleştirin. Antero-posterior ve lateral pozisyondeğiştirmeden viral çözelti damla iğne Dalma.
15. Fırdamacın parafin filmine atıldığı yaklaşık 500 nL viral çözeltiile doldurmak için pompanın "geri çekme" işlevini kullanın.  Bunu görsel kontrol (stereoskop) altında yapın, damlanın kaybolmasını izleyin ve hava yıkmayın.
16. Şırınganın doğru doldurulduğundan emin olun. Görsel kontrol altında 50 nL likit küçük bir damla çıkarmak test etmek için piston aşağı sürüş tarafından fırlatma sisteminin işleyişini doğrulayın. Damlayı sil.
17. Stereotaksik aygıtın dorso-ventral eksenini kontrol eden kalayı saat yönünde çevirerek iğneyi beyne seçili derinliğe yerleştirin. "Çalıştır" düğmesine basın (hız 15 nL/dk hacim başına 150 nL enjekte). Küçük bir hacim (50-300 nL, kullanılan virüse bağlı olarak) yavaş yavaş otomatik bir pompa ile 10 dakika üzerinde atılır.
18. Enjeksiyon alanından sızmamak için enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin. Daha sonra, dorso-ventral ekseni saat yönünün tersine kontrol eden tonucu çevirerek 3-5 dk üzerinde yavaş yavaş iğne çıkarın.
19. Stereotaksik çerçevenin dikey kısmını şırınga yla hayvandan uzaklaştırın. Tıkanmasını önlemek için iğneyi hemen temiz distile suda birkaç kez doldurarak yıkayın. Su dolu şırıngayı saklayın.
20. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın. 4-0 poliamid dikiş filament ile cilt dikiş. 2-1-1 standart cerrahi düğümile bağlı üç veya dört stiches olun.
21. Tamamen anestezi uyanır kadar ısıtılmış bir kafesiçinde fare yerleştirin ve yere yerleştirilen bir Petri kabında su ve ıslatılmış gıda sağlar. Isı kaynağı kafesin altındaysa, aşırı ısınmayı önlemek için bir spacer ızgarası kullanın.
    NOT: Lokal kılavuzlara göre ağrıyı önlemek için tek doz ketoprofen (2-5 mg/kg, deri altı) veya buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg, subkutan olarak) uygulanabilir.
22. Hayvan tamamen uyanık olduğunda, ev kafesine geri dönün ve özellikle enjeksiyonu takip eden gün, onun refahını izleyin. Ağrı belirtileri olup yok. Herhangi bir davranışsal değişiklik gözlenirse, hayvan vücut ağırlığını izlemek için tartılır.
23. Kullanılan virüse bağlı olarak, tam ifade süresi değişebilir. Burada, AAV5 ifadesi için 3 hafta izin verir. Syn.Chronos-GFP.

3. Akut dilim kayıtları ve fiksasyon için çözümler

1. 10x konsantre kesme çözeltisi (125 mM NaCl, 25 mM sakkaroz, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO_3,1,25 mM NaH₂PO₄ ve 2,5 mM D-glikoz) ve yapay cerebrospinalspinal sıvı (ACSF) çözeltisi (124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM Elektrofizyoloji deneyleri öncesinde saf deiyonize suda NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO_{4 ve} 11 mM D-glukoz) Bu çözeltileri CaCl₂ ve MgCl₂olmadan 1 L şişelerde 4 °C'de saklayın.
2. Deney günü, kesme çözeltisi ve ACSF 10x'in stok çözümlerini her biri 0,5 L'lik son bir hacme seyreltin. Bir manyetik karıştırıcı ile çalkalama ve% 95/5% O₂/ CO₂ile köpürerek oksijen. Kesme çözeltisi için 0,1 mM CaCl₂ ve 7 mM MgCl_2, ACSF için 2 mM CaCl₂ ve 2 mM MgCl₂ son konsantrasyonları elde etmek için divalent iyonlar ekleyin.
3. Potasyum-glukonat bazlı pipet çözeltisini içerecek şekilde hazırlayın: 135 mM K-glukonat, 1.2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 4 mM MgATP, 0.4 mM Tris-GTP, 10 mM Na₂-fosfokreatin ve 2.7-7.1 mM post-hoc hücre için biyositin morfoloji vahiy. Çözeltinin pH'ını 7.3'e, ozmolaritesini 290 mOsm'a ayarlayın. -20 °C'de 1 mL aliquots saklayın.
4. BupH PBS kuru karışım toz poşetleri 500 mL distile suda seyrelterek 0,1 M PBS hazırlayın ve 0,1 M sodyum fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,2 elde edin.
5. 1 L %4 PFA çözeltisi hazırlamak için, 111 mL%36 sıvı PFA ve 90 mL 10x PBS çözeltisini damıtılmış suda seyreltin.
6. 0,1 M PBS'lik 500 mL'de 150 g sakaroz içeren %30 sakaroz çözeltisi hazırlayın.

4. Beyin dilimlerinin hazırlanması

1. Perfüzyon dan önce emici tezgah kağıdı ile tezgah alanı hazırlayın.
2. Yerçekimi ile beslenen perfüzyon için tezgah yaklaşık 1 m yukarıda bir damla yükleyin. 24 G kelebek iğnesi takın.
3. Vibratomun kesme odasını buzla çevreleyin ve dondurucuda saklayın.
4. Ameliyat için kullanılan aynı ketamin-ksilazin karışımı intraperitoneal enjeksiyon ile fare anestezi. Anestezinin evresini, parmak parmaklarını forceps ile sıkıştırarak değerlendirin. Tam uykudayken, intraperitoneal olarak 100 μL heparin (5000 U.I./mL) enjekte edin.
5. Hayvanı emici kağıda yapışkan bantla düzeltin. Göğüs kafesini, sol ve sağ taraftaki kaburgaları diyaframdan yukarı doğru küçük makaslarla keserek açın. Yapışkan bant yardımıyla göğüs kafesini açık tut.
6. İnen aortu hemostat la kenetleyin ve kalbin sol ventrikülünden 4 °C soğutulmuş ve oksijenli (%95/5 O_2/CO2)ile perfüzyon ile 24 G kelebek iğnesi ile çözeltiyi keserek sıkıştırın. 5 s sonra, küçük makas ile sağ atriyum açın.
7. Perfüzyon 5 dakika sonra, organlar kansız olduğunda, perfüzyon durdurun. Hayvanın kafasını büyük makasla ayırın ve kafanızı Petri kabında 4 °C'lik soğutulmuş ve oksijenli kesme çözeltisine batırın.
8. Beyni çıkarmak için, deriyi boyundan buruna kesmek, sonra da son omurları kafatasından makasla kes. El ile deri geri ve kafatası açmak için küçük makas kullanın, orta hat boyunca kesme, kaudal rostral için, yukarı göz arasında.
9. Dikkatle kavisli veya kemik forceps ile frontal kemik parietal kemik ve kaudal kısmını çıkarın. Beyin ve kranial zemin arasında alet ekleyerek küçük bir yuvarlak spatula ile beyin ayıklayın, koku ampul kesit, optik sinir ve diğer kranial sinirler, ve beyincik.
10. Beyni buz gibi kesme çözeltisine (4 °C) yavaşça bir kabın batırın. Kortikal yüzeyi nazikçe kurutmak için beyni filtre kağıdına yerleştirin. Yatay beyin dilimlerini kesmek için beyin korteksini bir vibratomun örnek tutucusuna yapıştırın, kaudal tarafı bıçakla bakacak şekilde.
11. Kesme odasını buz gibi oksijenli kesme çözeltisi ile doldurun, böylece beyin tamamen gömülmüş olur. Dilimler üzerinde potansiyel sol-sağ belirsizliği önlemek için sol yarımkürede (enjekte edilen tarafa kontralateral) bir kesim yapın.
    DİkKAT: Çözeltiyi her zaman oksijene maruz edin ve dilimleri ışığa maruz kalmaktan koruyun.
12. 1 mm genlikte 0,07 mm/s hızla 300 μm kalınlığında dilimler vibratom ile kesin. Bu aşamada, floresan el feneri (440-460 nm) ve ilgili filtre gözlükleri (500 nm uzun geçiş) kullanarak talamusta chronos-GFP ifadesini kısaca kontrol etmek önerilir.
13. Hipokampal bölgeyi neşterle izole edin ve banyo ile dolu bir kabın içinde yer alan bir odaya aktarın (34 °C), oksijenli (%95/5 O₂/CO₂) ACSF.
14. 15 dk sonra, ısıtılan su banyosu ndan odayı alın ve dilimlerin oda sıcaklığında dinlenmesine izin verin, kullanıma kadar en az 45 dakika oksijenli olun.

5. Tüm hücreli yama-kelepçe kaydı

1. Hipokampal kompleksi içeren bir beyin dilimini, özel yapım cam transfer pipetiyle dik bir mikroskoba monte edilmiş kayıt odasına nazikçe aktarın. Transfer pipeti, kauçuk pipet ampule bağlı kısaltılmış pasteur pipetten (iç çap 6,5 mm) yapılır. Kayıt odasını (3 mL) 34 °C (ısıtılmış) ACSF ile %95/5 O_2/CO2ile sürekli olarak perfüzyon. Peristaltik pompanın hızını 2-3 mL/dk'ya ayarlayın.
2. Mavi LED aydınlatma (470 nm) ile ilgi bölgesindeki akson terminallerinde Chronos-GFP ifadesini kısaca inceleyin ve 4x objektif olarak gözlemleyin. GFP floresansı, bilgisayar ekranında görüntülenen bir CCD kamera görüntüsüyle uygun bir emisyon filtresi aracılığıyla görselleştirilir.
3. Onu korumak için dilimin üzerine, sıkıca aralıklı naylon dizeleri ("arp") ile U şeklinde platin telden yapılmış bir dilim çapa yerleştirin.
4. 63x daldırma hedefine değiştirin ve odağı ayarlayın. Chronos-GFP ifade aksonları kontrol edin ve yama kaydı için bir piramidal nöron seçin.
5. Hedefi yukarı doğru hareket ettirin.
6. Pipetleri borosilikat camdan Kahverengi-Yanan elektrot çekmecesi kullanarak çekin. Çekmece, yaklaşık 1 μm uç çapına sahip pipetler üretecek şekilde ayarlanmıştır. Pipetleri K-glukonat bazlı iç solüsyonla doldurun.
7. Pipeti pipet tutucuya baş sahnede monte edin. Hazneyi odadaki pipeti indirin ve ucu hedefin altında bulun. Pipet direnci 3-8 MΩ arasında olmalıdır. Pipetten çıkan bir çözelti konisi görmek ve pipeti ve hedefi dilimin yüzeyine kademeli olarak düşürmek için şırınga ile hafif pozitif basınç uygulayın.
8. Hücreyi voltaj-kıskaç yapılandırmasında yama: tanımlanan nörona yaklaşın ve pipet ucunu soma üzerine hassas bir şekilde bastırın. Pozitif basınç membran yüzeyinde bir gamze üretmelidir. Giga-ohm mührünü (>1 GΩ direnci) oluşturmak için basıncı bırakın. Mühürlendikten sonra tutma gerilimini -65 mV'ye ayarlayın. Negatif basınç keskin bir darbe ile membran break: Bu pipet tutucubağlı bir tüp güçlü emme uygulanarak elde edilir.
9. Tam hücre akım kelepçe modunda kayıt nöron yanıtları hiperpolarize ve depolarize akım adımları(Şekil 2A).
   NOT: Bu protokol hücrenin aktif ve pasif içsel özelliklerini belirlemek için kullanılacaktır. Özel yazılmış MATLAB yordamları off-line analiz^10,16için kullanılır.
10. Chronos ifade afferent liflerin tüm alan 475 nm LED stimülasyonu için akım veya voltaj-kıskaç postsinaptik tepkiler kayıt. 20 Hz 'de 2 ms süreleri 10 stimülasyon trenler ile uyarın (Şekil 2B,C). Işık yoğunluğu 0.1-2 mW arasında değişebilir.
    NOT: Işık yoğunluğu, hedefe göre konumlandırılmış fotodiyat sensörü ile donatılmış dijital el optik güç konsolu ile ölçüldü. 2-4 ms'lik yanıt gecikmeleri monosinaptik bağlantı için karakteristiktir.
11. Uzun menzilli afferents ve kayıtlı nöron arasındaki sinaptik iletimin doğasını araştırmak için farklı farmakolojik ajanlar kullanılabilir. Farmakolojik olarak ağ aktivasyonu yoluyla dolaylı yanıtlardan doğrudan, monosinaptik yanıtları ayırt etmek için ACSF'ye 1 μM TTX ve 100 μM 4-AP ekleyin.
    NOT: Glutamat reseptör blokerlerinin banyo uygulaması serbest bırakılan nörotransmitterin doğasını ve postsinaptik reseptörlerin kimliğini belirlemeye olanak sağlar. Örneğin, AMPA tipi glutamat reseptörleri NBQX (10 μM) ve NMDA reseptörleri tarafından APV (100 μM) tarafından bloke edilecektir. Çalışmanın amacına bağlı olarak, sinaptik yanıtların veya yanıt dinamiğinin zaman adedine olan gerilim bağımlılığını araştırmak için protokoller tasarlanabilir.
12. Başka bir hücreyi yamalamak için orijinal ACSF solüsyonuyla yıkayın veya biyositin dolu bir nöron içeren dilimi %4 PFA ile dolu küçük bir şişeye aktarın.
13. %4 PFA'da gece fiksasyonundan sonra, dilimi 0,1 M PBS (5 dk için 2 x, 20 dk için 1x) yıkayın.
14. 4 °C'de %30 sakarozda saklayabilirsiniz.

6. Biocytin vahiy

1. Biyositin dolu nöronların bulunduğu sabit dilimleri %30 sakaroz damlasında cam bir bıçak üzerine aktarın ve üç kez donma-erime gerçekleştirin: bıçağı sakaroz damlaları tamamen dondurulana kadar 1 dakika boyunca strafor kutusuna atfedilen kuru buzüzerine yerleştirin, sonra erimesi için bıçağı avuç içine bastırın.
2. 0,1 M PBS (5 dk için 2x, 1 saat ve 50 dakika için 1x), hafifçe ajite dilim 3x yıkayın. Son yıkama için 2 saati geçmeyin.
3. Membranları 0,1 M PBS'de permeabilize etmek için %2 süt tozu (20 mL'de 0,4 g) ve %0,5 Triton X100 (20 mL'de 0,1 mL) içeren ajite tampon çözeltisi içinde 2 saat boyunca RT'deki dilimi önceden inkübedin.
4. %2 süt tozu, %1 Triton X100, streptavidin-Cy5 konjuge (1/500) ve DAPI (1/1000) içeren bir çözeltide gece boyunca 0,1 M PBS'de hafifçe ajite edin.
5. Dilimi 0,1 M PBS 'de üç kez yıkayın (5 dk için 2 kat, 2 saat için 1x). Son yıkama arka plan boyama azaltmak için, 4 saate kadar, daha uzun sürebilir.
6. Dilimi takmadan önce, PBS ile dolu bir bölmede işaretli hücreyi içeren dilimin yan tarafını belirlemek için Cy5 floresan işaretleyicilerini gözlemlemek üzere yapılandırılmış 10x büyütmede epifloresan mikroskobu kullanın.
7. Bir bıçak üzerine dilim aktarın, hücre tarafı kadar, bir kağıt mendil ile kuru, ve yüksek dirençli montaj ortamı kullanarak monte.
8. Hücre gövdesinin konumunu incelemek için Cy5 ve DAPI yapılandırmasında 10x büyütmede epifloresan mikroskobu kullanın ve GFP yapılandırmasında işaretli afferentleri veya ayrıntılı somatik, aksonal ve dendritik morfoloji (Şekil 2D,E). Filtre ayarları Malzemeler Tablosu'ndaayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sonuçlar

Burada sunulan prosedür, anterograd adeno ilişkili virüsün stereotaksik enjeksiyonu ile talamus (ADN) antero-dorsal çekirdeğinde GFP'ye kaynaşmış mavi ışığa duyarlı channelrhopsin (Chronos) ifade etmek için kullanılmıştır. Stereotaksik koordinatlar fare beyin atlasına göre belirlendi ve 200 nL floresan izleyici floro-yakut enjekte edilerek test edildi. Hayvan enjeksiyondan 10 dakika sonra kurban edildi ve beyin bir gecede çıkarıldı ve sabitlendi. Koronal beyin bölümleri doğru yerleştirilmiş ...

Tartışmalar

Tanımlanmış bir beyin bölgesinde ışığa duyarlı opsinler ifade etmek için in vivo viral enjeksiyon uzun menzilli fonksiyonel bağlantı¹⁰optogenetik analizi için bir seçim yöntemidir^,11,17,18. Stereotaksik enjeksiyonlar tam olarak beynin belirli bir alanı hedef imkanı sunuyoruz. Floresan bir muhabir ile bir opsin coexpression uygun başarılı ifade ve kesin enjeksiyon sitenin ona...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm bur	Harvard Apparatus	724962
10 µL Hamilton syringe	Hamilton	1701 RN - 7653-01
10X PBS solution	Thermofisher Scientific	AM9624	text
36% PFA	Sigma-Aldrich	F8775
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED  DC/59022m	use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
All chemicals	Sigma
Bath temperature controler	Luigs & Neumann	SM7	Set at 34°C
beveled metal needle	Hamilton	7803-05	33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors	Dahle Allround	50038
Biocytin	Sigma	B4261	final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries	Havard Apparatus	GC150-10	1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller	Sutter Instruments	P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack	Thermofisher Scientific	28372
butterfly needle for perfusion	Braun	Venofix A	24G
CCD Camera	Andor	DL-604M
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710	20X
curved forceps	FST	11011-17
CY5 configuration (confocal)			Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633
CY5 configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI	Sigma	D9542
DAPI configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A	Axon Instruments
Digital handheld optical meter	ThorLabs	PM100D	Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight	Nightsea	DFP-1	excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA	Sigma	E4368	final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE-2000E	10 or 20X
Filter paper	Whatman
Fluoro-Ruby 10%	Millipore	AG335	disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate	Physitemp	HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml	Sanofi		5 ml vial
HEPES	Sigma	H3375	final 10 mM
High speed rotary micromotor kit	Foredom	K.1070	maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
KCl	Sigma	P4504	final 1,2 mM
Ketamine 1000	Virbac
Ketofen 10%	Merial		100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine)	MSD		16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery	Photonic (via Phymep)	10044
LED Power Supply	Cairn Research	OptoLED Light Source
Manipulators	Luigs & Neumann	SM-7
Mg-ATP 2H20	Sigma	A9187	final 4 mM
MgCl2	Sigma	63069	final 2 mM
Micro temperature controler	Physitemp	MTC-1
Milk powder	Carnation
MultiClamp 700B	Axon Instruments
Na Phosphocreatine	Sigma	P7936	final 10 mM
Na3-GTP 2H20	Sigma	G9002	final 0.4 mM
needle holder/hemostat	FST	13005-14
pClamp acquisition software	Axon Instruments
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	14-16 on the display for 2-3 ml/min
Potassium gluconate (K-gluconate)	Sigma	G4500	Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium	Thermofisher Scientific	P36390
Rompun 2% (xylazine)	Bayer
small scissors	FST	14060-09
Sodium chloride 0.9%	Virbac		dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT	VWR	630-1584
Stereotaxic frame with digital display	Kopf	Model 940	Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate	Life technologies	434315
Streptavidin-Cy5 conjugate	Thermofisher Scientific	S32357
Superglue3 Loctite	Dutscher	999227	1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid	Ethicon	F3210
Syringe pump	kdScientific	Legato 130 - 788130	Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer	Leica	VT1200S	speed 0.07, amplitude 1.
tubing	Gilson	F117942, F117946	Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope	Olympus	BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper	Nalgene