In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, um die zelltypspezifische funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe optogenetischer Stimulationen in ex vivo Gehirnscheiben zu identifizieren.

Zusammenfassung

Kenntnisse über zellspezifische synaptische Konnektivität sind eine entscheidende Voraussetzung für das Verständnis hirnbreiter neuronaler Schaltkreise. Die funktionelle Untersuchung von Fernverbindungen erfordert gezielte Aufnahmen einzelner Neuronen in Kombination mit der spezifischen Stimulation identifizierter entfernter Eingänge. Dies ist oft schwierig mit konventionellen und elektrischen Stimulationstechniken zu erreichen, da Axone aus konvergierenden vorgelagerten Hirnbereichen sich in der Zielregion vermischen können. Die stereotaxic-Targeting einer bestimmten Hirnregion für die virusvermittelte Expression lichtempfindlicher Ionenkanäle ermöglicht eine selektive Stimulation von Axonen aus dieser Region mit Licht. Intracerebrale stereotaxic Injektionen können in gut abgegrenzten Strukturen, wie die vorderen thalamic Kerne, zusätzlich zu anderen subkortikalen oder kortikalen Bereichen im gesamten Gehirn verwendet werden.

Beschrieben hier ist eine Reihe von Techniken für die präzise stereotaxic Injektion von viralen Vektoren, die Channelrhodopsin im Mausgehirn, gefolgt von Photostimulation von Axon-Terminals in der Gehirnscheibe Vorbereitung. Diese Protokolle sind einfach und weit verbreitet. In Kombination mit der Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnung aus einem postsynaptisch verbundenen Neuron ermöglicht die Photostimulation von Axonen den Nachweis funktioneller synaptischer Verbindungen, die pharmakologische Charakterisierung und die Beurteilung ihrer Stärke. Darüber hinaus kann die Biozytinfüllung des aufgezeichneten Neurons zur post-hoc morphologischen Identifizierung des postsynaptischen Neurons verwendet werden.

Einleitung

Die Definition der Konnektivität zwischen Hirnregionen ist notwendig, um neuronale Schaltkreise zu verstehen. Klassische anatomische Tracing-Methoden ermöglichen die Etablierung interregionaler Konnektivität, und Läsionsstudien helfen, die hierarchische Organisation des Informationsflusses zu verstehen. Zum Beispiel beinhalten Gehirnkreise für räumliche Orientierung und Kopfrichtungssignalisierung den Richtungsfluss von Informationen vom Thalamus zum Presubiculum. Dies wurde durch Läsionsstudien von antero-dorsalen thalamischen Kernen (ADN) nachgewiesen, die das Kopfrichtungssignal im nachgeschalteten dorsalen Presubiculum abbauen, sowie das parahippocampale Gitterzellsignal^1,2.

Die funktionelle Konnektivität zwischen Hirnbereichen ist schwieriger auf zellulärer und subzellulärer Ebene zu etablieren. Im Hippocampus ermöglicht eine hochorganisierte Anatomie die Untersuchung von signalspezifischen synaptischen Verbindungen mittels elektrischer Simulation in der Scheibenpräparation. Stimulationselektroden, die in der Stratum radiatum von CA1 platziert werden, können gezielt verwendet werden, um den Schaffer-Kollateraleinsatz aus CA3³gezielt zu stimulieren. Stimulierende Elektroden, die in Stratum lacunosum moleculare von CA1 platziert werden, aktivieren den perforanten Pfadeingang zu CA1^4,5. Elektrische Stimulation aktiviert Neurotransmitter Freisetzung von Axon-Terminals; es aktiviert jedoch Neuronen mit Somata in der Nähe der Stimulationsstelle sowie Axone der Passage. Es ist daher von begrenztem Nutzen für die Untersuchung von Afferents aus definierten Hirnregionen, wenn Fasern verschiedener Herkunftsregionen in der Zielstruktur verwechseln, wie es typischerweise im Neocortex der Fall ist.

Neuronen können auch mit Licht stimuliert werden. Optische Methoden umfassen die Photoaktivierung von Käfigglutamat, die mit ein- oder zweiphotonen Laserscanning kombiniert werden kann. Mehrere eng verteilte Stellen können sequenziell stimuliert werden, ohne mechanische Schäden am Gewebe⁶. Dies wurde erfolgreich verwendet, um synaptische Rezeptoren zu kartieren sowie einzelne Neuronen zu aktivieren⁷. Während Glutamat-Unkaging für die lokale Schaltungsanalyse verwendet werden kann, erlaubt es keine spezifische Aktivierung von Ferneingängen.

Eine Methode der Wahl für die Untersuchung der Langstreckenkonnektivität in neuronalen Schaltkreisen ist die Verwendung von virusvermittelter Kanalrhodopsin-Expression. Mit in vivo stereotaxic Injektionen, wie hier beschrieben, kann der Ausdruck von lichtgebundenen Ionenkanälen gezielt und räumlich auf eine gewünschte Hirnregion beschränkt werden. Auf diese Weise sind Kanalrhodopsine wirksam für die Kartierung erregender oder hemmender Konnektivität von einer Region zu ihrem Ziel. Transfizierte Axonklemmen können mit Licht in einer Gehirnscheibenpräparation stimuliert werden, und Patch-Clamp-Aufnahmen als Auslese ermöglichen die Untersuchung der Funktionen und Stärken bestimmter Schaltungskomponenten im Gehirn⁸. Der optogenetische Ansatz in Kombination mit der stereotaxic-Injektion eines Virus bietet eine beispiellose Spezifität und genetische Kontrolle⁹. Stimulieren mit Licht ermöglicht zusätzlich sowohl hohe zeitliche als auch räumliche Präzision^10,11.

Das Presubiculum ist eine sechsschichtige kortikale Struktur am Übergang des Hippocampus und der Parahippocampusformation^12,13. Es erhält wichtige synaptische Eingaben aus dem ADN^11, aber auch aus mehreren anderen kortikalen und subkortikalen Regionen¹⁴. Somit ist die selektive Stimulation von thalamischen Axonklemmen innerhalb einer präsubikulären Scheibe weder mit elektrischer Stimulation noch mit Glutamat-Unkaging möglich. Beschrieben in diesem Protokoll sind Methoden zur Bestimmung der funktionellen Konnektivität zwischen Hirnregionen (ADN und Presubiculum) mithilfe präziser stereotaxic-Injektionen viraler Vektoren, die lichtgated Kanäle exdrücken. Ebenfalls beschrieben ist die Photostimulation von Axonen-Terminals von projizierten Neuronen in ihrer Zielregion, gekoppelt mit Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Neuronen in der Hirnscheibenpräparation.

Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/EU) durchgeführt und von der Ethikkommission der Universität Paris Descartes genehmigt. Der Experimentator muss die Genehmigung für das Verfahren einholen, um den örtlichen Vorschriften zu entsprechen.

1. Planung des Experiments

1. Definieren Sie den Hirnbereich, der zielgerichtet werden soll. Bestimmen Sie die stereotaxic Koordinaten der Injektionsstelle mit Hilfe eines Maus-Gehirnatlas¹⁵. Für den rechten antero-dorsalen Thalamischen Kern (ADN) sind die Koordinaten: -0,82 posterior, 0,75 seitlich, -3,2 Tiefe (mm) relativ zu Bregma. Die Koordinaten müssen möglicherweise für Tiere unterschiedlichen Alters, Geschlechts oder Stamms angepasst werden.
2. Bestätigen und dokumentieren Sie die Genauigkeit der Koordinaten, indem Sie in einem Pilotversuch einen fluoreszierenden Tracer (150 bis 300 nL) injizieren, der mit einem Epifluoreszenzmikroskop beobachtet werden kann(Abbildung 1A,B).
3. Definieren Sie den Typ des zu injizierenden Virus. Lagern Sie das Virus in 6 L Aliquots bei -80 °C, wie vom Hersteller empfohlen. Bringen Sie 1 Aliquot auf Eis in den Operationssaal, für die Injektion von ein bis sechs Tieren an einem bestimmten Tag. Die Biosicherheitsvorschriften für die Verwendung von AAV können vom Land oder der Institution abhängen, und die Verwendung einer PSM 2-Haube kann erforderlich sein.
   HINWEIS: Hier verwenden wir einen AAV2/5 Serotyp, der Chronos ausdrückt, eine schnelle Channelrhodospin-2-Variante, die unter der Kontrolle des Synapsin-Promotors: AAV5 mit grünem fluoreszierendem Protein verschmolzen wird. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. Stereotaxie Chirurgie

1. Installieren Sie einen stereotaxic Rahmen mit pumpeneinem Halter auf einer stabilen Standard-Laborbank. Passen Sie das Stereoskop an, um die Zone, in der der Kopf des Tieres platziert wird, deutlich zu sehen. Verwenden Sie eine LED-Lichtquelle für die Beleuchtung. Drehen Sie das Stereoskop weg, um auf den Pumpenhalter zuzugreifen, der für die ersten Schritte der Operation nicht benötigt wird.
2. Installieren Sie eine 10-L-Hamilton-Spritze, die mit einer 33 G abgeschrägten Metallnadel im Pumpenhalter ausgestattet ist. Testen Sie das Auswurfsystem mit Wasser.
3. Anästhetisieren Sie eine 4- bis 5 Wochen alte C57BL6-Maus mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid und Xylazin (100 mg/kg bzw. 10 mg/kg). Bereiten Sie eine Mischung aus 1 ml Ketamin und 0,5 ml Xylazin in 8,5 ml von 0,9% NaCl vor. Dies führt zu 10 mg/ml Ketamin und 1 mg/ml Xylazin in der Mischung. Von dieser Mischung injizieren Sie intraperitoneal 10 l pro Gramm des Körpergewichts des Tieres. Die Dauer der Anästhesie beträgt ca. 1 h.
4. Stellen Sie sicher, dass das Tier mit einer Zehenzange gut anästhesiert ist. Ziehen Sie dann die Zunge heraus, um das Atmen zu erleichtern. Rasieren Sie das Schädelhaar.
5. Injizieren Sie 20 l Lidocainhydrochlorid (4 mg/ml; 2 mg/kg) unter die Haut des Kopfes für lokalanästhesie und warten Sie 5 min, bis die Wirkung beginnt. Um Augenschäden durch Trockenheit zu vermeiden, bedecken Sie die Augen mit topischer ophthalmologischer Salbe.
6. Um den Schädel freizulegen, erstellen Sie einen geraden Schnitt in der Kopfhaut mit einer kleinen Chirurgischen Schere. Legen Sie das Tier in einen stereotaxic Rahmen, setzen Sie die Ohrstangen leicht rostral auf das eigentliche Ohr, um auf dem Knochen zu ruhen und ziehen Sie die Haut, die einen guten Zugang zum Schädel schaffen sollte. An Ort und Stelle anziehen. Installieren Sie das Nasenstück.
7. Halten Sie den Körper des Tieres horizontal auf der Höhe des Kopfes mit einem höhenverstellbaren Träger. Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus, um es bei physiologischer Temperatur zu halten.
8. Reinigen Sie den Schädel, indem Sie 0,9% NaCl mit einem Wattestäbchen auftragen, um Weichgewebe aus dem Knochen zu entfernen. Verwenden Sie das Stereoskop für den Rest der Operation.
9. Passen Sie den Schädel so an, dass die Bregma-Lambda-Achse eben ist und sich die Nase und das Zähneinnwerk nach oben oder unten bewegt. Dies erfordert iterative Maßnahmen von Bregma und Lamba, da sich beide nach der Anpassung des Nasenniveaus ändern werden.
10. Finden Sie den Standort der Injektionsstelle auf dem Schädel. Stellen Sie die Injektionsnadel über der Injektionsstelle nach hinteren und medialen Koordinaten ein und markieren Sie den Schädel mit einer Einwegnadel. Bewegen Sie die Injektionsnadel um 4 cm nach oben.
11. Verwenden Sie einen 0,5 mm Grat mit einem Bohrer, um eine Kraniotomie von 1 mm Durchmesser auf der Marke zu realisieren, bei der Hälfte der maximalen Geschwindigkeit. Tupfer schließlich Blutungen mit einem Papiergewebe.
12. Entleeren Sie das in der Hamilton-Spritze enthaltene Wasser zur Lagerung, indem Sie es vollständig mit der Pumpe auswerfen. Nur die Nadel wird noch mit Wasser gefüllt. Die Nadel wird zwischen jedem Gebrauch mit reinem entionisiertem Wasser gewaschen. Eine Sterilisation ist nicht erforderlich.
13. Nehmen Sie das Aliquot des Virus, das für diesen Tag verwendet werden soll. Stellen Sie sicher, dass die virusvirale Lösung nicht mehr gefroren ist, sondern abgekühlt ist (nahe 0 °C, auf Eis). Nur kurz vom Eis entfernen, um 700 nL mit einer Mikropipette für kleine Volumina zu erhalten. Legen Sie den Tropfen auf ein 5 cm x 5 cm Großes Stück Paraffinfolie ab. Vermeiden Sie blasen. Setzen Sie die verbleibende virusbelastliche Lösung wieder auf Eis.
    HINWEIS: Das Tropfenvolumen sollte größer sein als das gewünschte Injektionsvolumen (700 nL für 200 nL injiziert). Dies gibt eine Sicherheitsmarge für den Fall, dass ein Teil der Flüssigkeit während des Transfers verloren geht und ermöglicht die Durchführung eines kleinen Testauswurfs (Schritt 2.16), bevor Sie fortfahren.
14. Legen Sie den Paraffinfilm auf die Kraniotomie. Tauchen Sie die Nadel in den Tropfen der viralen Lösung, ohne die antero-posterior und seitliche Position zu ändern.
15. Verwenden Sie die "Rückzug"-Funktion der Pumpe, um die Spritze mit ca. 500 nL virusischer Lösung zu füllen, die auf dem Paraffinfilm entsorgt wird.  Tun Sie dies unter visueller Kontrolle (Stereoscope), beobachten Sie den Tropfen verschwinden, und stellen Sie sicher, nicht Luft zu aspirieren.
16. Stellen Sie sicher, dass die Spritze korrekt gefüllt wurde. Überprüfen Sie die Funktionsweise des Auswurfsystems, indem Sie den Kolben herunterfahren, um zu testen, wie ein kleiner Flüssigkeitstropfen von 50 nL unter visueller Kontrolle ausgeworfen wird. Wischen Sie den Tropfen.
17. Setzen Sie die Nadel in die gewählte Tiefe in das Gehirn ein, indem Sie den Knopf drehen, der die dorso-ventrale Achse des stereotaxic-Geräts im Uhrzeigersinn steuert. Drücken Sie die "Run"-Taste (Geschwindigkeit 15 nL/min pro Volumen von 150 nL injiziert). Ein kleines Volumen (50-300 nL, je nach verwendetem Virus) wird langsam über 10 min mit einer automatischen Pumpe ausgestoßen.
18. Warten Sie 10 min nach der Injektion, um ein Auslaufen aus der Injektionsstelle zu vermeiden. Dann entfernen Sie langsam die Nadel über 3-5 min, indem Sie den Knopf drehen, der die dorso-ventrale Achse gegen den Uhrzeigersinn steuert.
19. Drehen Sie den vertikalen Teil des stereotaxic Rahmens mit der Spritze weg vom Tier. Waschen Sie die Nadel sofort in sauberem destilliertem Wasser, indem Sie sie mehrmals entleeren, um Verstopfungen zu vermeiden. Bewahren Sie die mit Wasser gefüllte Spritze auf.
20. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaxic Rahmen. Die Haut mit 4-0 Polyamid-Nahtfilamenten befolgen. Machen Sie drei oder vier Stiche, gebunden mit 2-1-1 Standard chirurgische Knoten.
21. Legen Sie die Maus in einen beheizten Käfig, bis sie vollständig aus der Anästhesie erwacht, und geben Sie Wasser und getränktes Essen in einer Petrischale auf den Boden gelegt. Wenn sich die Wärmequelle unterhalb des Käfigs befindet, verwenden Sie ein Abstandsgitter, um eine Überhitzung zu vermeiden.
    HINWEIS: Nach den örtlichen Richtlinien kann eine Einzeldosis Ketoprofen (2-5 mg/kg, subkutan) oder Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg, subkutan) angewendet werden, um Schmerzen zu verhindern.
22. Wenn das Tier vollständig wach ist, kehren Sie es in seinen Heimischen Käfig zurück und überwachen Sie sein Wohlbefinden, insbesondere am Tag nach der Injektion. Überprüfen Sie auf Anzeichen von Schmerzen. Wenn eine Verhaltensänderung beobachtet wird, wird das Tier gewogen, um sein Körpergewicht zu überwachen.
23. Je nach verwendeter Virus kann die Zeit für die vollständige Expression variieren. Hier erlauben wir 3 Wochen für den Ausdruck von AAV5. Syn.Chronos-GFP.

3. Lösungen für akute Slice-Aufnahmen und Fixierung

1. Bereiten Sie Lagerlösungen mit 10x konzentrierter Schneidlösung (125 mM NaCl, 25 mM Saccharose, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO₃, 1,25 mM NaH₂PO₄ und 2,5 mM D-Glucose) und künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Vorrat (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mMM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO₄ und 11 mM D-Glucose) in reinem deionisiertem Wasser vor elektrophysiologischen Experimenten. Bewahren Sie diese Lösungen bei 4 °C in 1 L-Flaschen ohne CaCl₂ und MgCl₂auf.
2. Verdünnen Sie am Tag des Experiments die Lagerlösungen der Schneidlösung und ACSF 10x auf ein Endvolumen von jeweils 0,5 l. Rühren Sie mit einem magnetischen Rührer und sauerstoffisieren durch Sprudeln mit 95%/5%_O2/CO2. Fügen Sie divalente Ionen hinzu, um Endkonzentrationen von 0,1 mM CaCl₂ und 7 mM MgCl₂ für die Schneidlösung und 2 mM CaCl₂ und 2 mM MgCl₂ für ACSF zu erhalten.
3. Bereiten Sie die kaliumgluconatbasierende Pipettenlösung vor, um: 135 mM K-Gluconat, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 4 mM MgATP, 0,4 mM Tris-GTP, 10 mM Na₂-Phosphokkreatin und 2,7–7,1 mM Biocytin für Post-Hoc-Zelle Morphologie-Offenbarung. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,3 und die Osmolarität auf 290 mOsm ein. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern.
4. Bereiten Sie 0,1 M PBS vor, indem Sie BupH PBS Trockenmischungspulverbeutel in 500 ml destilliertem Wasser verdünnen, was zu 0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,2 führt.
5. Zur Herstellung von 1 L 4% PFA-Lösung 111 ml mit 36% flüssigem PFA und 90 ml 10x PBS-Lösung in destilliertem Wasser verdünnen.
6. Bereiten Sie 30% Saccharoselösung mit 150 g Saccharose in 500 ml 0,1 M PBS vor.

4. Vorbereitung von Hirnscheiben

1. Bereiten Sie den Platz auf der Bank mit saugfähigem Bankpapier vor der Perfusion vor.
2. Installieren Sie einen Tropf ca. 1 m über der Bank für die Schwerkraft-Fed-Perfusion. Befestigen Sie eine 24 G Schmetterlingsnadel.
3. Umgeben Sie die Schneidkammer des Vibratome mit Eis und lagern Sie es in einem Gefrierschrank.
4. Anästhetisieren Sie die Maus mit intraperitonealer Injektion der gleichen Ketamin-Xylazin-Mischung für die Chirurgie verwendet. Bewerten Sie das Stadium der Anästhesie, indem Sie die Zehen mit Zange kneifen. Im Volleinschlafen 100 l Heparin (5000 U.I./ml) intraperitoneal injizieren.
5. Fixieren Sie das Tier mit Klebeband auf dem saugfähigen Papier, auf dem Rücken liegend. Öffnen Sie den Brustkorb, indem Sie die Rippen auf der linken und rechten Seite mit einer kleinen Schere schneiden, von der Membran nach oben. Halten Sie den Brustkorb mit Hilfe von Klebeband offen.
6. Die absteigende Aorta mit einem Hämostat klemmen und über die linke Herzkammer mit 4 °C gekühlt und mit Sauerstoff (95%/5% O_2/CO2)durchdringen, die Lösung durch die 24 G Schmetterlingsnadel schneiden. Nach 5 s, öffnen Sie das rechte Atrium mit einer kleinen Schere.
7. Nach 5 min Perfusion, wenn die Organe unblutig sind, stoppen Sie die Perfusion. Enthaupten Sie das Tier mit einer großen Schere und tauchen Sie den Kopf in 4 °C gekühlte und sauerstoffhaltige Schneidlösung in eine Petrischale.
8. Um das Gehirn zu extrahieren, schneiden Sie die Haut vom Hals bis zur Nase, dann schneiden Sie die letzten Wirbel aus dem Schädel mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut manuell zurück und verwenden Sie eine kleine Schere, um den Schädel zu öffnen, indem Sie ihn entlang der Mittellinie schneiden, von kaudal bis rostral, nach oben bis zwischen den Augen.
9. Entfernen Sie vorsichtig den parietalen Knochen und den kaudalen Teil des Frontalknochens mit gekrümmten oder Knochenzangen. Extrahieren Sie das Gehirn mit einem kleinen abgerundeten Spachtel, indem Sie das Instrument zwischen gehirn und den Schädelboden einsetzen, die Riechbirne, den Sehnerv und andere Hirnnerven und Kleinhirn sparten.
10. Tauchen Sie das Gehirn vorsichtig in eiskalte Schneidlösung (4 °C) in ein Becherglas. Positionieren Sie das Gehirn auf Filterpapier, um die kortikale Oberfläche sanft zu trocknen. Kleben Sie den Hirnrinde an den Probenhalter eines Vibratom, mit der kaudalen Seite zur Klinge gerichtet, um horizontale Gehirnscheiben zu schneiden.
11. Füllen Sie die Schneidkammer mit eiskalter sauerstoffhaltiger Schneidlösung, damit das Gehirn vollständig versunken ist. Machen Sie einen Schnitt auf der linken Hemisphäre (kontralateral zur injizierten Seite), um mögliche Links-Rechts-Mehrdeutigkeit auf Scheiben zu vermeiden.
    VORSICHT: Die Lösung immer mit Sauerstoff bedecken und Scheiben vor Lichteinwirkung schützen.
12. Mit dem Vibratome 300 m dicke Scheiben mit einer Geschwindigkeit von 0,07 mm/s bei 1 mm Amplitude schneiden. In diesem Stadium wird empfohlen, den Chronos-GFP-Ausdruck im Thalamus mit einer leuchtstofffreien Taschenlampe (440-460 nm) und entsprechenden Filtergläsern (500 nm langen Durchlauf) kurz zu überprüfen.
13. Isolieren Sie die Hippocampus-Region mit einem Skalpell und übertragen Sie sie in eine Kammer, die in einem bechergefüllten (34 °C) gefüllten, sauerstoffhaltigen (95%/5% O_2/CO2) ACSF positioniert ist.
14. Nach 15 min die Kammer aus dem beheizten Wasserbad nehmen und die Scheiben bei Raumtemperatur ruhen lassen, noch mindestens 45 min mit Sauerstoff versorgt, bis sie verwendet werden.

5. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahme

1. Übertragen Sie vorsichtig eine Gehirnscheibe mit dem Hippocampus-Komplex mit einer maßgeschneiderten Glastransferpipette in die Aufnahmekammer, die auf einem aufrechten Mikroskop montiert ist. Eine Transferpipette besteht aus einer verkürzten Pasteur Pipette (Innendurchmesser 6,5 mm), die an einer Gummipipettenlampe befestigt ist. Kontinuierlich durchdringen Sie die Aufnahmekammer (3 ml) mit 34 °C (erwärmt) ACSF mit 95%/5% O_2/CO2. Stellen Sie die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe auf 2-3 ml/min ein.
2. Betrachten Sie kurz den Chronos-GFP-Ausdruck in Axonklemmen im Interessenbereich mit blauer LED-Beleuchtung (470 nm) und beobachten Sie mit einem 4x Objektiv. Die GFP-Fluoreszenz wird durch einen geeigneten Emissionsfilter visualisiert, wobei ein CCD-Kamerabild auf einem Computerbildschirm angezeigt wird.
3. Legen Sie einen Scheibenanker aus einem U-förmigen Platindraht mit eng verteilten Nylonsaiten ("Harfe") auf die Scheibe, um sie zu erhalten.
4. Wechseln Sie zu einem 63-fachen Tauchobjektiv und passen Sie den Fokus an. Suchen Sie nach Axonen, die Chronos-GFP ausdrücken, und wählen Sie ein pyramidenförmiges Neuron für die Patch-Aufnahme.
5. Bewegen Sie das Ziel nach oben.
6. Ziehen Sie Pipetten mit einem braun-flaming Elektrodenzieher aus Borosilikatglas. Der Abzieher ist so eingestellt, dass Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von ca. 1 m produziert werden. Füllen Sie die Pipetten mit Einer internen Lösung auf K-Glukonat-Basis.
7. Montieren Sie die Pipette im Pipettenhalter auf der Kopfbühne. Senken Sie die Pipette in der Kammer und finden Sie die Spitze unter dem Objektiv. Der Pipettenwiderstand sollte zwischen 3 und 8 Mio. EUR liegen. Wenden Sie einen leichten positiven Druck mit einer Spritze an, um einen Konusausfluss aus der Pipette zu sehen und die Pipette und das Objektiv schrittweise auf die Oberfläche der Scheibe zu senken.
8. Patchen Sie die Zelle in Spannungs-Klemmen-Konfiguration: nähern Sie sich dem identifizierten Neuron und drücken Sie vorsichtig die Pipettenspitze auf das Soma. Der positive Druck sollte ein Grübchen auf der Membranoberfläche erzeugen. Lassen Sie den Druck los, um eine Giga-Ohm-Dichtung (>1 G-Widerstand) zu erzeugen. Nach dem Abdichten stellen Sie die Haltespannung auf -65 mV ein. Brechen Sie die Membran mit einem scharfen Druckimpuls: Dies wird durch starke Absaugung auf ein Rohr erreicht, das mit dem Pipettenhalter verbunden ist.
9. Zeichnen Sie im Ganzzellstrom-Klemmmodus die Reaktionen des Neurons auf hyperpolarisierende und depolarisierende Stromschritte auf (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Dieses Protokoll wird verwendet, um aktive und passive intrinsische Eigenschaften der Zelle zu bestimmen. Maßgeschneiderte MATLAB-Routinen werden für die Off-Line-Analyse^10,16verwendet.
10. Aufzeichnung der strom- oder spannungsklemmenpostsynaptischen Reaktionen auf 475 nm LED-Stimulation von affemittenten Fasern, die Chronos ausdrücken. Stimulieren Sie mit Zügen von 10 Stimulationen von 2 ms Dauer bei 20 Hz (Abbildung 2B,C). Die Lichtintensität kann zwischen 0,1 und 2 mW variieren.
    HINWEIS: Die Lichtintensität wurde mit einer digitalen optischen Handkonsole gemessen, die mit einem Photodiodensensor ausgestattet ist, der unter dem Objektiv positioniert ist. Reaktionslatenzen von 2–4 ms sind charakteristisch für eine monosynaptische Verbindung.
11. Um die Art der synaptischen Übertragung zwischen den Langstrecken-Afferents und dem aufgezeichneten Neuron zu untersuchen, können verschiedene pharmakologische Wirkstoffe verwendet werden. Um direkte, monosynaptische Reaktionen von indirekten Reaktionen über die Netzwerkaktivierung pharmakologisch zu unterscheiden, fügen Sie dem ACSF 1 -M TTX und 100 M 4-AP hinzu.
    HINWEIS: Bath Anwendung von Glutamat-Rezeptor-Blocker ermöglicht es, die Art des Neurotransmitters zu bestimmen, die freigesetzt wird und die Identität der postsynaptischen Rezeptoren. Zum Beispiel werden AMPA-Typ Glutamat-Rezeptoren durch NBQX (10 M) und NMDA-Rezeptoren durch APV (100 M) blockiert. Je nach Ziel der Studie können Protokolle konzipiert werden, um die Spannungsabhängigkeit von synaptischen Reaktionen oder Reaktionsdynamik im Laufe der Zeit zu untersuchen.
12. Waschen Sie mit der ursprünglichen ACSF-Lösung, um eine andere Zelle zu patchen, oder übertragen Sie die Scheibe, die ein Biocytin-gefülltes Neuron enthält, in eine kleine Durchstechflasche, die mit 4% PFA gefüllt ist.
13. Nach der nächtlichen Fixierung in 4% PFA die Scheibe in 0,1 M PBS (2x für 5 min, 1x für 20 min) waschen.
14. 30% Saccharose bei 4 °C lagern.

6. Biocytin-Offenbarung

1. Die festen Scheiben mit Biocytin gefüllten Neuronen in einem Tropfen von 30% Saccharose auf eine Glasklinge übertragen und drei Zyklen gefrierendes Auftauens durchführen: Die Klinge in einer Styroporbox für 1 min in eine Styroporbox legen, bis Diestropfen vollständig eingefroren sind, drücken Sie die Klinge gegen die Handfläche, um aufzutauen.
2. Waschen Sie die Scheibe 3x in 0,1 M PBS (2x für 5 min, 1x für 1 h und 50 min), sanft aufgeregt. Nicht mehr als 2 h für die letzte Wäsche.
3. Die Scheibe bei RT für 2 h in einer rührigen Pufferlösung mit 2 % Milchpulver (0,4 g in 20 ml) vorinkubieren, um unspezifische Stellen zu sättigen und 0,5 % Triton X100 (0,1 ml in 20 ml) zu sättigen, um die Membranen in 0,1 M PBS zu permeabilisieren.
4. Über Nacht bei 4 °C in einer Lösung mit 2% Milchpulver, 1% Triton X100, Streptavidin-Cy5-Konjugat (1/500) und DAPI (1/1000) in 0,1 M PBS, sanft gerührt.
5. Waschen Sie die Scheibe dreimal in 0,1 M PBS (2x für 5 min, 1x für 2 h). Die letzte Wäsche kann länger dauern, bis zu 4 h, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren.
6. Verwenden Sie vor der Montage der Scheibe ein Epifluoreszenzmikroskop mit 10-facher Vergrößerung, das für die Beobachtung von Cy5-Fluoreszenzmarkern konfiguriert ist, um die Seite der Scheibe zu identifizieren, die die markierte Zelle in einer mit PBS gefüllten Kammer enthält.
7. Übertragen Sie die Scheibe auf eine Klinge, zellseitig nach oben, trocknen Sie sie mit einem Papiergewebe und montieren Sie sie mit hochbefestem Montagemedium.
8. Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop mit 10-facher Vergrößerung in Cy5- und DAPI-Konfiguration, um die Position des Zellkörpers zu untersuchen, und in gfK-Konfiguration, um die markierten Afferents zu beobachten, oder ein hochauflösendes konfokales Mikroskop mit 20x für detaillierte somatische, axonale und dendritische Morphologie (Abbildung 2D,E). Die Filtereinstellungen sind in der Materialtabelleaufgeführt.

Ergebnisse

Das hier vorgestellte Verfahren wurde verwendet, um ein blaues lichtempfindliches Kanalrhodopsin (Chronos) auszudrücken, das mit GFP im antero-dorsalen Kern des Thalamus (ADN) durch stereotaxic-Injektion des anterogradeaden Adeno-assoziierten Virus verschmolzen wird. Die stereotaxic-Koordinaten wurden nach einem Maus-Gehirnatlas ermittelt und durch Injektion von 200 nL fluoreszierendem Tracer Fluor-Rubin getestet. Das Tier wurde 10 min nach der Injektion geopfert, und das Gehirn wurde über Nacht extrahiert und fixiert....

Diskussion

In vivo virale Injektion, um lichtempfindliche Opsine in einem definierten Gehirnbereich auszudrücken, ist eine Wahlmethode für die optogenetische Analyse der langfristigen funktionellen Konnektivität^10,11,17,18. Stereotaxie-Injektionen bieten die Möglichkeit, einen bestimmten Bereich des Gehirns genau anzusprechen. Die Koexpression eines Opsins mit einem fluoreszierenden Reporter ermöglic...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm bur	Harvard Apparatus	724962
10 µL Hamilton syringe	Hamilton	1701 RN - 7653-01
10X PBS solution	Thermofisher Scientific	AM9624	text
36% PFA	Sigma-Aldrich	F8775
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED  DC/59022m	use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
All chemicals	Sigma
Bath temperature controler	Luigs & Neumann	SM7	Set at 34°C
beveled metal needle	Hamilton	7803-05	33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors	Dahle Allround	50038
Biocytin	Sigma	B4261	final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries	Havard Apparatus	GC150-10	1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller	Sutter Instruments	P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack	Thermofisher Scientific	28372
butterfly needle for perfusion	Braun	Venofix A	24G
CCD Camera	Andor	DL-604M
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710	20X
curved forceps	FST	11011-17
CY5 configuration (confocal)			Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633
CY5 configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI	Sigma	D9542
DAPI configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A	Axon Instruments
Digital handheld optical meter	ThorLabs	PM100D	Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight	Nightsea	DFP-1	excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA	Sigma	E4368	final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE-2000E	10 or 20X
Filter paper	Whatman
Fluoro-Ruby 10%	Millipore	AG335	disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate	Physitemp	HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml	Sanofi		5 ml vial
HEPES	Sigma	H3375	final 10 mM
High speed rotary micromotor kit	Foredom	K.1070	maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
KCl	Sigma	P4504	final 1,2 mM
Ketamine 1000	Virbac
Ketofen 10%	Merial		100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine)	MSD		16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery	Photonic (via Phymep)	10044
LED Power Supply	Cairn Research	OptoLED Light Source
Manipulators	Luigs & Neumann	SM-7
Mg-ATP 2H20	Sigma	A9187	final 4 mM
MgCl2	Sigma	63069	final 2 mM
Micro temperature controler	Physitemp	MTC-1
Milk powder	Carnation
MultiClamp 700B	Axon Instruments
Na Phosphocreatine	Sigma	P7936	final 10 mM
Na3-GTP 2H20	Sigma	G9002	final 0.4 mM
needle holder/hemostat	FST	13005-14
pClamp acquisition software	Axon Instruments
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	14-16 on the display for 2-3 ml/min
Potassium gluconate (K-gluconate)	Sigma	G4500	Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium	Thermofisher Scientific	P36390
Rompun 2% (xylazine)	Bayer
small scissors	FST	14060-09
Sodium chloride 0.9%	Virbac		dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT	VWR	630-1584
Stereotaxic frame with digital display	Kopf	Model 940	Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate	Life technologies	434315
Streptavidin-Cy5 conjugate	Thermofisher Scientific	S32357
Superglue3 Loctite	Dutscher	999227	1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid	Ethicon	F3210
Syringe pump	kdScientific	Legato 130 - 788130	Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer	Leica	VT1200S	speed 0.07, amplitude 1.
tubing	Gilson	F117942, F117946	Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope	Olympus	BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper	Nalgene