АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает набор методов для определения клеточного типа специфического функционального подключения долгосрочных входов из отдаленных областей мозга с помощью оптогенетических стимуляций в ломтиках мозга ex vivo.

Аннотация

Знание клеточного типа специфических синаптических связей является важнейшей предпосылкой для понимания нейронных цепей в масштабах всего мозга. Функциональное исследование соединений дальнего радиуса действия требует целевых записей одиночных нейронов в сочетании с специфической стимуляцией выявленных удаленных входов. Это часто трудно достичь с помощью обычных и электрических методов стимуляции, потому что аксоны от сходящихся вверх по течению областей мозга может смешение в целевой области. Стереотаксическая ориентация на конкретную область мозга для опосредованного вирусом выражения светочувствительных ионных каналов позволяет селективной стимуляции аксонов, происходящих из этой области со светом. Внутримозговые стереотаксические инъекции могут быть использованы в хорошо разграниченных структурах, таких как передние таламические ядра, в дополнение к другим подкорковышам или корковым областям по всему мозгу.

Описан освоен здесь набор методов для точного стереотаксической инъекции вирусных векторов, выражающих channelrhodopsin в мозге мыши, а затем фотостимуляция аксонтерминалов в подготовке ломтик мозга. Эти протоколы просты и широко применимы. В сочетании с цельноклеточной записи зажима патча с постсинаптически связанного нейрона, фотостимуляция аксонов позволяет обнаруживать функциональные синаптические связи, фармакологическую характеристику и оценивать их прочность. Кроме того, биоцитиновый наполнение записанного нейрона может быть использован для пост-специальной морфологической идентификации постсинаптического нейрона.

Введение

Определение связи между областями мозга необходимо для понимания нейронных цепей. Классические методы анатомического отслеживания позволяют установить межрегиональную связь, а исследования поражений помогают понять иерархическую организацию информационного потока. Например, мозговые схемы для пространственной ориентации и сигнализации направления головы включают направленный поток информации от таламуса до пресубикула. Это было продемонстрировано исследования поражения антеро-дорсал саломных ядер (ADN), которые ухудшают сигнал направления головы в вниз по течению дорсальный presubiculum, а также парагиппокампальной сетки сигнала ячейки1,2.

Функциональную связь между областями мозга труднее установить на клеточном и субклеточном уровне. В гиппокампе, высокоорганизованная анатомия позволяет исследовать пути конкретных синаптические соединения с помощью электрического моделирования в срез подготовки. Стимулирующие электроды, помещенные в радиат сточки CA1, могут быть использованы специально для стимулирования ввода залога Schaffer от CA33. Стимулирующие электроды, помещенные в молекулярный слой лачуносума CA1, активируют перфорантный вход пути в CA14,5. Электрическая стимуляция активирует высвобождение нейромедиатора из аксонных терминалов; однако, он активирует нейроны с somata вблизи места стимуляции, а также аксоны прохода. Поэтому он имеет ограниченное применение для изучения афферентов из определенных областей мозга, когда волокна различных регионов происхождения перемешивается в целевой структуре, как это обычно бывает в неокортексе.

Нейроны также могут быть стимулированы светом. Оптические методы включают фотоактивацию глутамата в клетке, который можно комбинировать с одно- или двухфотонным лазерным сканированием. Несколько близко расположенных участков могут быть стимулированы последовательно, без механических повреждений ткани6. Это было успешно использовано для картирования синаптических рецепторов, а также активировать отдельные нейроны7. Хотя глутамат неприкосновения могут быть использованы для локального анализа цепи, это не позволяет для конкретной активации дальнего ввода.

Методом выбора для исследования дальнего подключения в нейронных цепях является использование вирусо-опосредованного выражения channelrhodopsin. Используя виво стереотаксические инъекции, описанные здесь, выражение световых ионных каналов может быть целенаправленным и пространственно ограничено желаемой областью мозга. Таким образом, channelrhodopsins эффективны для картирования возбуждающих или ингибирующих подключения из одного региона в свою цель. Трансинфицированные аксоны терминалы могут быть стимулированы светом в подготовке ломтик мозга, и патч-зажим записи как считывание позволяют изучить функции и сильные стороны конкретных компонентов цепи в мозге8. Оптогенетический подход в сочетании со стереотаксической инъекцией вируса предлагает беспрецедентную специфичность и генетический контроль9. Стимулирование со светом дополнительно позволяет как высокой временной и пространственной точности10,11.

Пресубикул является шестислойной корковой структурой при переходе гиппокампа и парагиппокампа формирования12,13. Он получает важный синаптический вход от ADN11, но и от нескольких других корковых и подкорковых областей14. Таким образом, селективная стимуляция таламических аксонов терминалов в пределах presubicular ломтик не представляется возможным с электрической стимуляции, ни глутамата uncaging. Описанные в этом протоколе методы для определения функциональной связи между областями мозга (ADN и presubiculum) с использованием точных стереотаксических инъекций вирусных векторов, выражающих световые каналы. Также описана фотостимуляция аксонов терминалов проецирования нейронов в их целевой области, в сочетании с цельноклеточными зажимными записями постсинаптических нейронов в подготовке среза мозга.

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейского сообщества (2010/63/EU) и одобрены комитетом по этике Парижского университета Декарта. Экспериментатор должен получить разрешение на соблюдение правил, установленных местными правилами.

1. Планирование эксперимента

  1. Определите область мозга, которая будет направлена. Определите стереотаксические координаты места инъекции с помощью атласа мозга мыши15. Для правого антеро-дорсального таламиального ядра (ADN) координаты: -0,82 заднего, 0,75 бокового, -3,2 глубины (мм) относительно брегмы. Координаты могут быть скорректированы для животных разного возраста, пола или деформации.
  2. Подтвердите и задокументируйте точность координат путем введения флуоресцентного трассировщика (150-300 нл), наблюдаемого с помощью эпифлюоресцентного микроскопа в экспериментальном эксперименте(рисунок 1A,B).
  3. Определите тип вируса, который будет введен. Храните вирус в 6 аликотах на уровне -80 градусов по Цельсию, как это рекомендовано производителем. Принесите 1 aliquot помещенный на льду к комнате хирургии, для впрыски одного до 6 животных на, котор дали день. Правила биобезопасности для использования AAV может зависеть от страны или учреждения, и использование PSM 2 капот может потребоваться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем серотип AAV2/5, выражающий Chronos, быстрый вариант канала, слитый с зеленым флуоресцентным белком под контролем промотора Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. Стереотаксическая хирургия

  1. Установите стереотаксическая рама, оснащенная держателем насоса, на стабильную стандартную лабораторную скамейку. Отрегулируйте стереоскоп, чтобы четко видеть зону, где будет размещена голова животного. Используйте светодиодный источник света для освещения. Поверните стереоскоп, чтобы получить доступ к держателю насоса, который не нужен для первых шагов операции.
  2. Установите 10 л Шприц Гамильтон оснащен 33 G сбивается металлической иглой в держатель насоса. Проверьте систему выброса с водой.
  3. Анестезия от 4 до 5 недель старых C57BL6 мыши с интраперитонеальной инъекции смеси гидрохлорида кетамина и ксилазина (100 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно). Приготовьте смесь 1 мл кетамина и 0,5 мл ксилазина в 8,5 мл 0,9% NaCl. Это приведет к 10 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазин в смеси. Из этой смеси вводят интраперитонеально 10 л на грамм массы тела животного. Продолжительность анестезии составляет около 1 ч.
  4. Убедитесь, что животное хорошо обезвлеживается с ног щепотку. Затем вытащите язык, чтобы облегчить дыхание. Бритье черепных волос.
  5. Вводят под кожу голову 20 л л/ л гидрохлорида лидокаина (4 мг/мл) и ждите 5 минут, чтобы начать действие. Чтобы избежать повреждения глаз из-за сухости, накройте глаза актуальнымо офтальмологическим мазь.
  6. Чтобы разоблачить череп, создайте прямой разрез на коже головы с помощью небольших хирургических ножниц. Поместите животное в стереотаксической раме, вставляя ухо баров слегка rostral к фактическому уху, чтобы отдохнуть на кости и потяните вниз кожи, которая должна создать хороший доступ к черепу. Затяните на место. Установите кусок носа.
  7. Поддерживайте тело животного горизонтально на уровне головы с помощью регулировки высоты. Поместите грелку под мышь, чтобы держать его при физиологической температуре.
  8. Очистите череп, применяя 0,9% NaCl с ватным тампоном, чтобы удалить мягкие ткани из кости. Используйте стереоскоп для остальной части операции.
  9. Отрегулируйте череп так, чтобы ось брегма-лямбда была ровной, двигаясь вверх или вниз по носу и куску зубов. Это требует итеративных мер брегма и лямба, так как оба будут меняться после корректировки уровня носа.
  10. Найдите место проведения инъекций на черепе. Отрегулируйте иглу инъекции над местом инъекции в соответствии с задними и медиальными координатами и пометьте череп одноразовой иглой. Переместите иглу для инъекций вверх на 4 см.
  11. Используйте 0,5 мм заусенец с дрелью, чтобы реализовать краниотомию диаметром 1 мм на отметке, на половине максимальной скорости. Возможное кровотечение с бумажной тканью.
  12. Опустошить воду, содержащуюся в шприцу Гамильтона для хранения, полностью выбрасывая его с насосом. Только игла все равно будет заполнена водой. Игла промывается между каждым использованием с чистой деионизированной водой. Стерилизация не требуется.
  13. Возьмите aliquot вируса, который должен быть использован в этот день. Убедитесь, что вирусный раствор больше не заморожен, но охлаждается (близко к 0 градусов по Цельсию, на льду). Только кратко удалить со льда, чтобы получить 700 nL с микропипеттом для небольших объемов. Депозит капли на 5 см х 5 см кусок парафина пленки. Избегайте создания пузырьков. Положите оставшийся вирусный раствор обратно на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем падения должен быть больше, чем желаемый объем инъекций (700 nL для 200 nL вводили). Это даст запас прочности в случае, если часть жидкости теряется во время передачи и позволяет выполнить небольшой тестовый выброс (шаг 2.16) перед началом.
  14. Поместите парафина пленка на вершине краниотомии. Окунитесь в иглу вирусного раствора, не меняя антеро-задней и боковое положение.
  15. Используйте функцию "снять" насос для заполнения шприца около 500 нл вирусного раствора, утилизированного на парафинапленковой пленке.  Сделайте это под визуальным контролем (стереоскоп), смотреть падение исчезают, и убедитесь, что не аспирировать воздух.
  16. Убедитесь, что шприц был заполнен правильно. Проверьте функционирование системы выброса, съезжая поршень для тестирования извлечь небольшую каплю жидкости 50 нл под визуальным контролем. Протрите каплю.
  17. Вставьте иглу в мозг на выбранную глубину, повернув ручку, контролируя дорсо-вентральную ось стереотаксического аппарата по часовой стрелке. Нажмите кнопку "Бег" (скорость 15 нл/мин на объем 150 nL вводили). Небольшой объем (50-300 нл, в зависимости от используемого вируса) медленно выбрасывается более 10 мин с автоматическим насосом.
  18. Подождите 10 минут после инъекции, чтобы избежать утечки из места инъекции. Затем медленно снимите иглу на 3-5 мин, повернув ручку, контролируя оси дорсо-вентральной против часовой стрелки.
  19. Поверните вертикальную часть стереотаксической рамы со шприцем подальше от животного. Немедленно промойте иглу в чистой дистиллированной воде, заполнив ее несколько раз, чтобы избежать засорения. Храните шприц, наполненный водой.
  20. Удалите мышь из стереотаксической рамы. Шов кожи с 4-0 полиамидный шов нити. Сделайте три или четыре stiches, связанные с 2-1-1 стандартных хирургических узлов.
  21. Поместите мышь в отапливаемой клетке, пока она полностью не проснется от анестезии, и обеспечить водой и пропитанной пищи в чашку Петри размещены на земле. Если источник тепла находится ниже клетки, используйте сетку для прокладки, чтобы избежать перегрева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с местными руководящими принципами, одна доза кетопрофена (2-5 мг/кг, подкожно) или бупренорфина (0,05-0,1 мг/кг, подкожно) может быть применена для предотвращения боли.
  22. Когда животное полностью проснется, верните его в домашнюю клетку и следите за его самочувствием, особенно на следующий день после инъекции. Проверьте наличие признаков боли. При наблюдении каких-либо поведенческих изменений животное взвешивается для контроля массы тела.
  23. В зависимости от используемого вируса время полного выражения может варьироваться. Здесь мы позволяем 3 недели для выражения AAV5. Син.Хронос-ГФП.

3. Решения для острых записей срезов и фиксации

  1. Подготовьте стоковые растворы 10x концентрированного режущего раствора (125 мМ NaCl, 25 мм сахароза, 2,5 мм КЛ, 25 мМ NaHCO3,1,25 мМ2PO4, и 2,5 мМ D-глюкоза) и искусственный спинномозговой спинномозговой жидкости (ACSF) NaHCO3, 1 мМ2PO4 и 11 мМ D-глюкоза) в чистой деионизированной воде до экспериментов по электрофизиологии. Храните эти решения при 4 градусах по Цельсию в бутылках по 1 л без CaCl2 и MgCl2.
  2. В день эксперимента разбавьте запасные растворы режущего раствора и ACSF 10x до конечного объема 0,5 л каждый. Агитировать с помощью магнитного мешалки и ожигать при пузырянии с 95%/5% O2/CO2. Добавьте divalent ионы для получения конечной концентрации 0,1 мм CaCl2 и 7 мМ MgCl2 для режущего раствора, и 2 мМ CaCl2 и 2 мМ MgCl2 для ACSF.
  3. Подготовка калий-глюконат на основе пипетки раствор содержать: 135 мМ K-глюконат, 1,2 мМ KCl, 10 мм HEPES, 0,2 мм EGTA, 2 мМ MgCl2, 4 мМ MgATP, 0,4 мм Tris-GTP, 10 мм Na2-фосфокреатин, и 2,7-7,1 мм биоцититин для пост-хок-клеток морфология откровения. Отрегулируйте рН раствора до 7,3 и осмоляритность до 290 мОсм. Храните 1 мл aliquots при -20 градусах по Цельсию.
  4. Приготовьте 0,1 М PBS путем разбавления сухих порошковых порошокBB BupH PBS в 500 мл дистиллированной воды, в результате чего 0,1 м фосфат натрия, 0,15 М NaCl, рН 7,2.
  5. Для приготовления 1 л 4% раствора PFA разбавьте 111 мл 36% жидкой PFA и 90 мл 10-x раствора PBS в дистиллированной воде.
  6. Приготовьте 30% сахарозный раствор, содержащий 150 г сахарозы в 500 мл 0,1 М ПБС.

4. Подготовка ломтиков мозга

  1. Подготовьте скамейку с абсорбирующим скамейке бумаги перед перфузией.
  2. Установите капельницу примерно на 1 м над скамейкой для перфузии, питаемых гравитацией. Прикрепите иглу бабочки 24 G.
  3. Окружите режущей камерой вибратом со льдом и храните его в морозильной камере.
  4. Анестезия мыши с интраперитонеальной инъекции той же смеси кетамин-ксилазин используется для хирургии. Оцените стадию анестезии, защипывая нос щипцы щипками. При полном сне вводят 100 л гепарина (5000 U.I./mL) интраперитонеально.
  5. Закрепите животное клейкой лентой на абсорбируемой бумаге, лежащей на спине. Откройте грудную клетку, разрезая ребра на левой и правой сторонах с небольшими ножницами, от диафрагмы вверх. Поддерживайте грудную клетку открытой с помощью клейкой ленты.
  6. Зажим нисходящей аорты с hemostat и perfuse через левый желудочек сердца с 4 КС охлажденных и оксигенированных (95%/5% O2/CO2), резка раствора через 24 G бабочка иглы. После 5 с, открыть правое предсердие с небольшими ножницами.
  7. После 5 мин перфузии, когда органы бескровны, остановить перфузию. Обезглавить животное большими ножницами и погрузить голову в охлажденный и насыщенный кислородом разделочный раствор в чашке Петри.
  8. Чтобы извлечь мозг, вырежьте кожу с шеи на нос, затем разделите последние позвонки из черепа ножницами. Вручную втягивайте кожу и используйте небольшие ножницы, чтобы открыть череп, разрезая его вдоль средней линии, от каудаля до рострала, вверх, между глазами.
  9. Тщательно удалите теменной кости и каудальной части лобной кости с изогнутыми или костными щипками. Извлеките мозг с небольшим округлым шпателем, вставив инструмент между мозгом и черепным полом, разделив обонятельную луковицу, зрительный нерв и другие черепные нервы, и мозжечок.
  10. Аккуратно погрузите мозг в ледяной режущий раствор (4 кВС) в стакан. Расположите мозг на фильтровальной бумаге, чтобы аккуратно высушить корковую поверхность. Клей коры головного мозга вниз к образцу держатель вибратом, с каудальной стороны перед лезвием, для того, чтобы сократить горизонтальные ломтики мозга.
  11. Заполните режущую камеру ледяным кислородом разрезающим раствором, чтобы мозг полностью погружался. Сделайте разрез на левом полушарии (контралатеральный с привитой стороны), чтобы избежать потенциальной лево-правой двусмысленности на ломтиках.
    ВНИМАНИЕ: Всегда окисните раствор и защитите ломтики от воздействия света.
  12. Вырезать 300 мкм толщиной ломтиками с вибратом, со скоростью 0,07 мм / с на 1 мм амплитуда. На этом этапе рекомендуется кратко проверить экспрессию Chronos-GFP в таламусе с помощью флуоресцентного фонарика (440-460 нм) и соответствующих фильтровальных стаканов (500 Нм в длину).
  13. Изолировать гиппокампа области с кальпельи и передать его в камеру, расположенную в стакане заполнены ванной нагревается (34 кВ), кислородом (95%/5% O2/CO2) ACSF.
  14. После 15 минут, взять камеру из нагретой водяной бане и пусть ломтики отдыха при комнатной температуре, по-прежнему кислородом, по крайней мере 45 мин до использования.

5. Цельно-клеточная запись патч-зажима

  1. Аккуратно перенесите ломтик мозга, содержащий гиппокампа комплекса с заказным стеклом передачи пипетки на записи камеры, установленной на вертикальном микроскопе. Передаваемый пипетка изготовлен из укороченной пипетки Pasteur (внутренний диаметр 6,5 мм), прикрепленной к резиновой лампе пипетки. Непрерывно пронизывает запись камеры (3 мл) с 34 C (подогретый) ACSF пузырились с 95%/5% O2/CO2. Установите скорость перистальтический насос до 2-3 мл/мин.
  2. Кратко изучите экспрессию Chronos-GFP в аксонных терминалах в интересуемом регионе с помощью синего светодиодного освещения (470 нм) и наблюдайте с 4x-целью. Флуоресценция GFP визуализируется с помощью соответствующего фильтра выбросов, с изображением камеры CCD отображается на экране компьютера.
  3. Поместите на срез якорь, сделанный из U-образной платиновой проволоки с плотно расставленными нейлоновыми струнами («арфа»), на срез, чтобы сохранить его.
  4. Измените сьюк с целью погружения 63x и отрегулируйте фокус. Проверьте аксоны, выражающие Chronos-GFP, и выберите пирамидальный нейрон для записи патча.
  5. Перемещение цели вверх.
  6. Вытяните пипетки с помощью электрода коричневого электрода из боросиликатного стекла. Выдвижной установлен для производства пипетки с примерно 1 мкм в диаметре кончика. Заполните пипетки внутренним раствором на основе K-глюконата.
  7. Смонтировать пипетку в держателе пипетки на головной ступени. Опустите пипетку в камеру и найдите наконечник под целью. Устойчивость к пипетке должна сосугова от 3 до 8 МЗ. Нанесите легкое положительное давление шприцем, чтобы увидеть конус изсывающего раствора из пипетки и постепенно снизить пипетку и объективно выложиться на поверхность среза.
  8. Патч клетки в конфигурации напряжения-зажима: подход определены нейрона и деликатно нажмите пипетки наконечник на сома. Положительное давление должно производить ямку на поверхности мембраны. Отпустите давление, чтобы создать гига-ому уплотнительное (сопротивление гига-ома). После герметичной установки установите удерживая напряжение до -65 мВ. Перерыв мембраны с резким пульсом отрицательного давления: это достигается путем применения сильного всасывания к трубке, подключенной к держателю пипетки.
  9. Запись в режиме зажима цельноклеточного тока реакции нейрона на гиперполяризацию и деполяризацию текущих шагов(рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол будет использоваться для определения активных и пассивных внутренних свойств клетки. Пользовательские написанные процедуры MATLAB используются для автономного анализа10,16.
  10. Запись в текущем или напряжение зажима postsynaptic ответы на цельное поле 475 нм светодиодной стимуляции афферентных волокон, выражающих Chronos. Стимулировать с поездами 10 стимуляций 2 мс продолжительности на 20 Гц(Рисунок 2B, C). Интенсивность света может варьироваться от 0,1-2 мВт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность света была измерена с помощью цифровой портативной оптической силовой консоли, оснащенной фотодиодным датчиком, расположенным под целью. Реакции опоздания 2-4 мс характерны для моносинаптической связи.
  11. Для изучения характера синаптической передачи между афферентами дальнего действия и записанным нейроном могут использоваться различные фармакологические агенты. Чтобы фармакологически различать прямые, моносинаптические ответы от косвенных ответов через сетевую активацию, добавьте в ACSF 1 МКм TTX и 100 МКм 4-AP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Применение в ванной блокаторов рецепторов глутамата позволяет определить характер высвобожденного нейромедиатора и личность постсинаптических рецепторов. Например, рецепторы глутамата типа АМРА будут заблокированы рецепторами NB-X (10 мкм) и NMDA -1M- apV (100 мкм). В зависимости от цели исследования, протоколы могут быть задуманы для изучения зависимости напряжения синаптической реакции или динамики реакции с течением времени.
  12. Вымойте оригинальным раствором ACSF, чтобы залатать другую клетку, или перенести ломтик, содержащий биоцитин заполненный нейрон в небольшой флакон заполнен ы 4% PFA.
  13. После ночной фиксации в 4% PFA, мыть ломтик в 0,1 М PBS (2x на 5 мин, 1x на 20 мин).
  14. Хранить в 30% сахарозы при 4 градусах Цельсия.

6. Откровение биоцитина

  1. Перенесите фиксированные ломтики, содержащие биоцитин заполненные нейроны на стеклянную лезвие в капле 30% сахарозы и выполнить три цикла замораживания оттаивания: место лезвие на сухой лед утилизируется в пенополистирола поле в течение 1 мин, пока капли сахарозы полностью заморожены, то прижмите лезвие к ладоням, чтобы оттаять.
  2. Вымойте ломтик 3x в 0,1 М PBS (2x на 5 мин, 1x на 1 ч и 50 мин), осторожно взволнован. Не превышать 2 ч для последней стирки.
  3. Предварительно инкубировать ломтик на RT на 2 ч в возбужденном буферном растворе, содержащем 2% сухого молока (0,4 г в 20 мл) для насыщения неспецифических участков и 0,5% Triton X100 (0,1 мл в 20 мл) для пермяки мемелинв в 0,1 М ПБС.
  4. Инкубировать ночь при 4 градусах Цельсия в растворе, содержащем 2% сухого молока, 1% Тритон X100, стрептавидин-Cy5 конъюгировать (1/500), и DAPI (1/1000) в 0.1 M PBS, мягко взволнован.
  5. Вымойте ломтик три раза в 0,1 M PBS (2x за 5 мин, 1x на 2 ч). Последняя стирка может длиться дольше, до 4 ч, чтобы уменьшить фоновое окрашивание.
  6. Перед монтажом ломтика используйте микроскоп эпифлюоресценции при 10-кратном увеличении, настроенном для наблюдения за флуоресцентными маркерами Cy5, чтобы определить сторону среза, содержащего отмеченную клетку в камере, заполненной PBS.
  7. Перенесите ломтик на лезвие, высушите его бумажной тканью и установите с помощью монтажной среды с высоким уровнем сопротивления.
  8. Используйте микроскоп эпифлюоресценции при 10-кратном увеличении в конфигурации Cy5 и DAPI для изучения местоположения тела клетки, а в конфигурации GFP для наблюдения за отмеченными афферентами, или конфокальным микроскопом с высоким разрешением в 20раз для детального соматического, аксонального и дендритной морфологии (Рисунок 2D, E). Настройки фильтра подробно описаны в таблице материалов.

Результаты

Процедура, представленная здесь, была использована для выражения синего светочувствительного канала (Chronos), слитого с GFP в антеро-дорсальном ядре таламуса (ADN), стереотаксической инъекцией антероградного адено-ассоциированного вируса. Стереотаксические координаты были определены в со?...

Обсуждение

In vivo вирусная инъекция для выражения светочувствительных опсинов в определенной области мозга является методом выбора для оптогенетического анализа дальнего функционального подключения10,11,17,18. Стереотаксические ?...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Мы благодарим Бертрана Матона, Мери Нассара, Ли-Вэнь Хуанга и Джина Симоннет за помощь в разработке предыдущих версий протокола стереотаксических инъекций и Марин Мануэль и Патрис аджегузо за техническую помощь. Эта работа была поддержана Французским министерством образования и исследований (L. R., L. S.), Национальным центром Этюдес Spatiales (M. B.), и Национальным agence de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (Д. Ф.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mm bur Harvard Apparatus724962
10 µL Hamilton syringeHamilton1701 RN - 7653-01
10X PBS solutionThermofisher ScientificAM9624 text
36% PFASigma-AldrichF8775
470 nm LED Cairn ResearchP1105/470/LED  DC/59022muse with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGHPenn Vector CoreAV-5-PV3446lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicalsSigma
Bath temperature controlerLuigs & NeumannSM7Set at 34°C 
beveled metal needleHamilton7803-0533 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissorsDahle Allround50038
BiocytinSigmaB4261final 1-3 mg/ml
Borosilicate CapillariesHavard ApparatusGC150-101.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode pullerSutter InstrumentsP-87
BupH Phosphate Buffered Saline packThermofisher Scientific28372
butterfly needle for perfusionBraun Venofix A24G
CCD CameraAndor DL-604M
Confocal MicroscopeZeissLSM71020X
curved forcepsFST 11011-17
CY5 configuration (confocal)Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo)Nikon/ChromaFluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPISigmaD9542
DAPI configuration (epifluo)Nikon/ChromaFluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440AAxon Instruments
Digital handheld optical meterThorLabsPM100DParametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor bladesElectron Microscopy Sciences72000Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein FlashlightNightseaDFP-1excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTASigmaE4368final 0,2 mM
Epifluorescence MicroscopeNikonEclipse TE-2000E10 or 20X
Filter paperWhatman
Fluoro-Ruby 10%MilliporeAG335disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo)Nikon/ChromaFluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
HeatingplatePhysitempHP4M
Heparin choay 5000 U.I./mlSanofi5 ml vial
HEPESSigmaH3375final 10 mM
High speed rotary micromotor kitForedomK.1070maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse StimulatorA-M Systems2100
KClSigmaP4504final 1,2 mM
Ketamine 1000Virbac
Ketofen 10%Merial100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine)MSD16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgeryPhotonic (via Phymep)10044
LED Power SupplyCairn ResearchOptoLED Light Source
ManipulatorsLuigs & NeumannSM-7
Mg-ATP 2H20SigmaA9187final 4 mM
MgCl2Sigma63069final 2 mM
Micro temperature controlerPhysitempMTC-1
Milk powderCarnation
MultiClamp 700BAxon Instruments
Na PhosphocreatineSigmaP7936final 10 mM
Na3-GTP 2H20SigmaG9002final 0.4 mM
needle holder/hemostatFST13005-14
pClamp acquisition softwareAxon Instruments
Peristaltic pumpGilsonMinipuls 314-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate)SigmaG4500Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting mediumThermofisher ScientificP36390
Rompun 2% (xylazine)Bayer
small scissorsFST14060-09
Sodium chloride 0.9% Virbacdilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZTVWR630-1584
Stereotaxic frame with digital displayKopfModel 940Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugateLife technologies 434315
Streptavidin-Cy5 conjugateThermofisher ScientificS32357
Superglue3 LoctiteDutscher9992271g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamidEthiconF3210
Syringe pumpkdScientificLegato 130 - 788130Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicerLeicaVT1200Sspeed 0.07, amplitude 1.
tubingGilsonF117942, F117946Yellow/Black, Purple/Black
upright microscopeOlympusBX51W1
Versi-dry bench absorbant paperNalgene

Ссылки

  1. Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
  2. Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
  3. Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
  4. Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
  5. Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
  6. Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
  7. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
  8. Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
  9. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
  10. Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
  11. Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
  12. Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
  13. Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
  14. Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
  15. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  16. Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
  19. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
  20. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  21. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  22. Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены