In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Riepilogo

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

Abstract

La conoscenza della connettività sinaptica specifica di tipo cellulare è un prerequisito fondamentale per comprendere i circuiti neuronali a livello di cervello. Lo studio funzionale delle connessioni a lungo raggio richiede registrazioni mirate di singoli neuroni combinati con la stimolazione specifica di input distanti identificati. Questo è spesso difficile da ottenere con tecniche di stimolazione convenzionali ed elettriche, perché gli assoni provenienti da aree cerebrali a monte convergenti possono mescolarsi nella regione bersaglio. Il targeting stereotassico di una regione cerebrale specifica per l'espressione mediata da virus dei canali ionici sensibili alla luce consente una stimolazione selettiva degli assoni provenienti da quella regione con la luce. Le iniezioni stereotassiche intracerebrali possono essere utilizzate in strutture ben delimitate, come i nuclei talamici anteriori, oltre ad altre aree subcorticali o corticali in tutto il cervello.

Descritto qui è un insieme di tecniche per l'iniezione stereotassica precisa di vettori virali che esprimono channelrhodopsin nel cervello del topo, seguita da fotostimolazione dei terminali assoni nella preparazione della fetta del cervello. Questi protocolli sono semplici e ampiamente applicabili. In combinazione con la registrazione di morsetto di cervo a tutta cellula da un neurone postsynaptaptically collegato, la fotostimolazione degli assoni consente il rilevamento di connessioni sinaptiche funzionali, la caratterizzazione farmacologica e la valutazione della loro forza. Inoltre, il riempimento della biocitina del neurone registrato può essere utilizzato per l'identificazione morfologica post-hoc del neurone post-sinaptico.

Introduzione

La definizione della connettività tra le regioni del cervello è necessaria per comprendere i circuiti neurali. I classici metodi di tracciamento anatomico consentono di stabilire la connettività interregionale e gli studi di lesione aiutano a comprendere l'organizzazione gerarchica del flusso di informazioni. Ad esempio, i circuiti cerebrali per l'orientamento spaziale e la segnalazione della direzione della testa coinvolgono il flusso direzionale di informazioni dal talamo al presubiculum. Ciò è stato dimostrato da studi di lesioni di nuclei talamici cioco-dorsalici (ADN) che degradano il segnale di direzione della testa nel presubiculum dorsale a valle, così come il segnale della rete della griglia paraippocampale^1,2.

La connettività funzionale tra le aree del cervello è più difficile da stabilire a livello cellulare e subcellulare. Nell'ippocampo, un'anatomia altamente organizzata permette di studiare le connessioni sinaptiche specifiche del percorso utilizzando la simulazione elettrica nella preparazione della fetta. Gli elettrodi di stimolazione collocati nel radiato stratificato di CA1 possono essere utilizzati specificamente per stimolare l'input collaterale di Schaffer da CA3³. Stimolando gli elettrodi collocati nella molecolare di lacunoso stratificante di CA1 attiverà l'ingresso del percorso perforante a CA1^4,5. La stimolazione elettrica attiva il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali assoni; tuttavia, attiva i neuroni con somata vicino al sito di stimolazione e assoni di passaggio. È quindi di uso limitato per studiare gli afferenti da regioni cerebrali definite quando le fibre di diverse regioni di origine si mescolano nella struttura bersaglio, come è tipicamente il caso nella neocorteccia.

I neuroni possono anche essere stimolati con la luce. I metodi ottici includono la fotoattivazione del glutammato in gabbia, che può essere combinato con la scansione laser a uno o due fotoni. Più siti strettamente distanziati possono essere stimolati in sequenza, senza danni meccanici al tessuto⁶. Questo è stato utilizzato con successo per mappare i recettori sinaptici così come attivare i singoli neuroni⁷. Mentre lo sblocco del glutammato può essere utilizzato per l'analisi del circuito locale, non consente l'attivazione specifica di input a lungo raggio.

Un metodo di scelta per lo studio della connettività a lungo raggio nei circuiti neuronali è l'uso dell'espressione channelrhodopsin mediata da virus. Utilizzando iniezioni stereotassiche in vivo come descritto qui, l'espressione dei canali ionici illuminati può essere mirata e limitata spazialmente a una regione del cervello desiderata. In questo modo, le channelrhodopsins sono efficaci per mappare la connettività eccitatoria o inibitoria da una regione al suo obiettivo. I terminali degli assoni transettati possono essere stimolati con la luce nella preparazione di una fetta di cervello, e le registrazioni patch-clamp come una lettura consente l'esame delle funzioni e dei punti di forza di specifici componenti del circuito nel cervello⁸. L'approccio optogenetico combinato con l'iniezione stereotassica di un virus offre una specificità senza precedenti e il controllo genetico⁹. La stimolazione con la luce consente inoltre un'elevata precisione temporale che spaziale^10,11.

Il presubiculum è una struttura corticale a sei strati alla transizione dell'ippocampo e della formazione para-ippocampale^12,13. Riceve un importante input sinaptico dall'ADN¹¹ ma anche da diverse altre regioni corticali e subcorticali¹⁴. Pertanto, la stimolazione selettiva dei terminali degli assoni talamici all'interno di una fetta presubicolare non è possibile con la stimolazione elettrica né con lo sblocco del glutammato. Descritto in questo protocollo sono metodi per determinare la connettività funzionale tra le regioni del cervello (ADN e presubiculum) utilizzando precise iniezioni stereotassiche di vettori virali che esprimono canali illuminati. È stata descritta anche la fotostimolazione dei terminali degli assoni dei neuroni proiettanti nella loro regione bersaglio, insieme alle registrazioni a morsetto a tutta cellula dei neuroni post-sinaptici nella preparazione delle fette cerebrali.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio della Comunità europea (2010/63/UE) e approvate dal comitato etico dell'Università Cartesio di Parigi. Lo sperimentatore deve ottenere l'autorizzazione per la procedura di conformità alle normative locali.

1. Pianificazione dell'esperimento

1. Definire l'area del cervello da prendere di mira. Determinare le coordinate stereotaxiche del sito di iniezione con l'aiuto di un atlante cerebrale del topo¹⁵. Per il nucleo talamico talamico talamico destro (ADN), le coordinate sono: -0,82 posteriore, 0,75 laterali, -3,2 profondità (mm) relative al bregma. Potrebbe essere necessario regolare le coordinate per animali di diversa età, sesso o sforzo.
2. Confermare e documentare l'esattezza delle coordinate iniettando un tracciante fluorescente (150 a 300 nL) osservabile con un microscopio a epifluorescenza in un esperimento pilota (Figura 1A,B).
3. Definire il tipo di virus da iniettare. Conservare il virus in 6 aliquote a -80 gradi centigradi come raccomandato dal produttore. Portare 1 aliquota posta sul ghiaccio nella sala operatoria, per l'iniezione di uno o sei animali in un dato giorno. Le norme sulla biosicurezza per l'uso dell'AAV possono dipendere dal paese o dall'istituzione e può essere richiesto l'uso di una cappa PSM 2.
   NOTA: Qui, usiamo un sierotipo AAV22/5 che esprime Chronos, una variante veloce di channelrhodospin-2, fusa in proteina fluorescente verde sotto il controllo del promotore di Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. Chirurgia stereotassica

1. Installare un telaio stereotaxic dotato di supporto a pompa su un banco di laboratorio standard stabile. Regolare lo stereoscopio in modo da vedere chiaramente la zona in cui verrà posizionata la testa dell'animale. Utilizzare una sorgente luminosa a LED per l'illuminazione. Ruotare lo stereoscopio per accedere al supporto della pompa, che non è necessario per i primi passi dell'intervento chirurgico.
2. Installare una siringa Hamilton da 10 ll dotata di ago metallico smussato da 33 G nel supporto della pompa. Testare il sistema di espulsione con acqua.
3. Anestesizzare un topo C57BL6 di 4-5 settimane con un'iniezione intraperitoneale di una miscela di cloridrato di chetamina e xilola (100 mg/kg e 10 mg/kg, rispettivamente). Preparare un mix di 1 mL di ketamina e 0,5 mL di xilosina in 8,5 mL di 0,9% NaCl. Questo si tradurrà in 10 mg/mL ketamina e 1 mg/mL xilola nel mix. Di questo mix, iniettare intraperittealmente 10 l per grammo del peso corporeo dell'animale. La durata dell'anestesia è di circa 1 h.
4. Verificare che l'animale sia ben anetizzato con un pizzico di dita dei dei diici. Quindi, estrarre la lingua per facilitare la respirazione. Rasa i capelli cranici.
5. Iniettare 20 - L di cloruro di lidocaina (4 mg/mL; 2 mg/kg) sotto la pelle della testa per l'anestesia locale e attendere 5 minuti per l'effetto di iniziare. Per evitare danni agli occhi dovuti alla secchezza, coprire gli occhi con unguento oftalmico topico.
6. Per esporre il cranio, creare un taglio dritto nel cuoio capelluto con piccole forbici chirurgiche. Posizionare l'animale in un telaio stereotassico, inserendo le barre dell'orecchio leggermente rostral all'orecchio reale per poggiare sull'osso e tirare giù la pelle, che dovrebbe creare un buon accesso al cranio. Stringere in posizione. Installare il nose piece.
7. Mantenere il corpo dell'animale orizzontalmente a livello della testa utilizzando un supporto regolato in altezza. Posizionare un cuscinetto di riscaldamento sotto il mouse per mantenerlo a temperatura fisiologica.
8. Pulire il cranio applicando lo 0,9% NaCl con un tampone di cotone per rimuovere i tessuti molli dall'osso. Utilizzare lo stereoscopio per il resto dell'intervento chirurgico.
9. Regolare il cranio in modo che l'asse bregma-lambda sia livellato, muovendosi verso l'alto o verso il basso nel naso e nel pezzo dei denti. Ciò richiede misure iterative di bregma e lamba, in quanto entrambi cambieranno in seguito alla regolazione del livello del naso.
10. Trova la posizione del sito di iniezione sul cranio. Regolare l'ago di iniezione sopra il sito di iniezione in base alle coordinate posteriori e mediali e contrassegnare il cranio con un ago usa e getta. Spostare l'ago di iniezione verso l'alto di 4 cm.
11. Utilizzare una bava da 0,5 mm con un trapano per realizzare una craniotomia di diametro di 1 mm sul marchio, a metà della velocità massima. Swab eventuale sanguinamento con un tessuto di carta.
12. Svuotare l'acqua contenuta nella siringa Hamilton per lo stoccaggio espellendola completamente con la pompa. Solo l'ago sarà ancora riempito con acqua. L'ago viene lavato tra ogni uso con acqua pura deionizzata. La sterilizzazione non è necessaria.
13. Prendete l'aliquota del virus che deve essere utilizzato per questo giorno. Assicurarsi che la soluzione virale non sia più congelata, ma sia rimasta raffreddata (vicino a 0 gradi centigradi, sul ghiaccio). Solo brevemente rimuovere dal ghiaccio per ottenere 700 nL con una micropipetta per piccoli volumi. Depositare la goccia su un pezzo di pellicola di paraffina di 5 cm x 5 cm. Evitare di creare bolle. Rimetti la soluzione virale rimanente sul ghiaccio.
    NOTA: Il volume di caduta deve essere maggiore del volume di iniezione desiderato (700 nL per 200 nL iniettato). Questo darà un margine di sicurezza nel caso in cui una parte del liquido viene persa durante il trasferimento e permette di eseguire una piccola espulsione di prova (passaggio 2.16) prima di procedere.
14. Posizionare la pellicola di paraffina sopra la craniotomia. Immergere l'ago nella goccia della soluzione virale senza cambiare la posizione antero-posteriore e laterale.
15. Utilizzare la funzione "ritiro" della pompa per riempire la siringa con circa 500 nL di soluzione virale smaltita sulla pellicola di paraffina.  Fate questo sotto controllo visivo (stereoscopio), guardare la goccia scomparire, e assicurarsi di non aspirare l'aria.
16. Assicurarsi che la siringa sia stata riempita correttamente. Verificare il funzionamento del sistema di espulsione guidando verso il basso lo stantuffo per testare l'espulsione di una piccola goccia di liquido di 50 nL sotto controllo visivo. Pulisci la goccia.
17. Inserire l'ago nel cervello alla profondità scelta, ruotando la manopola controllando l'asse dorso-ventrale dell'apparato stereotassico in senso orario. Premere il pulsante "run" (velocità 15 nL/min per volume di 150 nL iniettato). Un piccolo volume (50-300 nL, a seconda del virus utilizzato) viene lentamente espulso oltre 10 min con una pompa automatica.
18. Attendere 10 min dopo l'iniezione per evitare perdite dal sito di iniezione. Quindi, rimuovere lentamente l'ago oltre 3-5 min ruotando la manopola controllando l'asse dorso-ventrale in senso antiorario.
19. Ruotare la parte verticale del telaio stereotaxic con la siringa lontano dall'animale. Lavare immediatamente l'ago in acqua pulita distillata riempiendolo più volte, al fine di evitare l'intasamento. Conservare la siringa riempita d'acqua.
20. Rimuovere il mouse dalla cornice stereotaxic. Suturare la pelle con 4-0 filamento di sutura poliammide. Fare tre o quattro stiches, legati con nodi chirurgici standard 2-1-1.
21. Mettere il topo in una gabbia riscaldata fino a quando non si sveglia completamente dall'anestesia e fornire acqua e cibo imbevuto in un piatto Petri posto a terra. Se la fonte di calore è sotto la gabbia, utilizzare una griglia distanziale per evitare il surriscaldamento.
    NOTA: Secondo le linee guida locali, una singola dose di chetoprofene (2-5 mg/kg, sottocutaneamente) o buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, sottocutanea) può essere applicata per prevenire il dolore.
22. Quando l'animale è completamente sveglio, riportarlo nella sua gabbia di casa e monitorarne il benessere, in particolare il giorno successivo all'iniezione. Verificare la presenza di segni di dolore. Se si osserva una modifica comportamentale, l'animale viene pesato per monitorare il suo peso corporeo.
23. A seconda del virus utilizzato, il tempo per l'espressione completa può variare. Qui, permettiamo 3 settimane per l'espressione di AAV5. Syn.Chronos-GFP.

3. Soluzioni per registrazioni e fissazione di fette acute

1. Preparare soluzioni di stock di 10x soluzione di taglio concentrato (125 mM NaCl, 25 mM di saccarosio, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO₃, 1,25 mM NaH₂PO₄ e 2,5 mM D-glucose) e soluzione artificiale di cerebro fluido (ACSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM mM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO₄ e 11 mM D-glucosio) in acqua pura deionizzata prima degli esperimenti di elettrofisiologia. Conservare queste soluzioni a 4 gradi centigradi in bottiglie da 1 L senza CaCl₂ e MgCl₂.
2. Il giorno dell'esperimento, diluire le soluzioni di stock di soluzione di taglio e ACSF 10x ad un volume finale di 0,5 L ciascuno. Agitare con un agitatore magnetico e ossigenare spumeggiando con 95%/5% O₂/CO₂. Aggiungere ioni divalenti per ottenere concentrazioni finali di 0,1 mM CaCl₂ e 7 mM MgCl₂ per la soluzione di taglio e 2 mM CaCl₂ e 2 mM MgCl₂ per ACSF.
3. Preparare la soluzione pipetta a base di glucona di potassio per contenere: 135 mM K-gluconate, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl_2,4 mM MgATP, 0,4 mM Tris-GTP, 10 mM Na 2-phosphocreatine e 2,7–7,1 mM di biocytina per cellule post-hoc rivelazione morfologia. Regolare il pH della soluzione a 7.3 e l'osmolarità a 290 mOsm. Conservare 1 aliquote mL a -20 gradi centigradi.
4. Preparare 0,1 M PBS diluindo sacchetti di polvere BupH PBS a secco in 500 mL di acqua distillata, con conseguente fosfato di sodio da 0,1 M, 0,15 M NaCl, pH 7.2.
5. Per preparare 1 L del 4% di soluzione PFA, diluire 111 mL di 36% PFA liquido e 90 mL di 10x soluzione PBS in acqua distillata.
6. Preparare una soluzione 30% di saccarosio contenente 150 g di saccarosio in 500 mL di 0,1 M PBS.

4. Preparazione di fette cerebrali

1. Preparare lo spazio del banco con carta da banco assorbente prima della perfusione.
2. Installare una flebo a circa 1 m sopra la panca per la perfusione alimentata a gravità. Attacca un ago a farfalla da 24 G.
3. Circondare la camera di taglio del vibratoma con ghiaccio e conservarlo in un congelatore.
4. Anestesizzare il topo con iniezione intraperitoneale della stessa miscela di ketamina-xilizina utilizzata per la chirurgia. Valutare lo stadio dell'anestesia pizzicando la dita dei dei fino a dire con pinze. In modalità completamente addormentata, iniettare 100 l di eparina (5000 U.I./mL) intraperitonealmente.
5. Fissare l'animale con nastro adesivo sulla carta assorbente, sdraiato sulla schiena. Aprire la gabbia toracica tagliando le costole sui lati sinistro e destro con piccole forbici, dal diaframma verso l'alto. Mantenere la gabbia toracica aperta con l'aiuto di nastro adesivo.
6. Bloccare l'aorta discendente con un emolaro e perfuso attraverso il ventricolo sinistro del cuore con 4 gradi centigradi raffreddati e ossigenati (95%/5% O₂/CO_2),tagliando la soluzione attraverso l'ago delle farfalle da 24 G. Dopo 5 s, aprire l'atrio destro con piccole forbici.
7. Dopo 5 min di perfusione, quando gli organi sono senza sangue, fermare la perfusione. Decapitare l'animale con grandi forbici e immergere la testa in 4 gradi centigradi raffreddato e ossigenato soluzione di taglio in un piatto Petri.
8. Per estrarre il cervello, tagliare la pelle dal collo al naso, quindi sezionare le ultime vertebre dal cranio con le forbici. Ritrarre manualmente la pelle e utilizzare piccole forbici per aprire il cranio, tagliandolo lungo la linea mediana, da caudala a rostral, verso l'alto e tra gli occhi.
9. Rimuovere con attenzione l'osso parietale e la parte caudale dell'osso frontale con pinze curve o ossee. Estrarre il cervello con una piccola spatola arrotondata inserendo lo strumento tra il cervello e il pavimento cranico, sezionando il bulbo olfattivo, nervo ottico e altri nervi cranici, e cervelletto.
10. Immergere delicatamente il cervello in una soluzione di taglio ghiacciata (4 gradi centigradi) in un bicchiere. Posizionare il cervello sulla carta da filtro per asciugare delicatamente la superficie corticale. Incollare la corteccia cerebrale verso il basso al portacampioni di un vibratoma, con il lato caudale rivolto verso la lama, al fine di tagliare le fette cerebrali orizzontali.
11. Riempire la camera di taglio con soluzione di taglio ossigenata ghiacciata in modo che il cervello sia completamente immerso. Effettuare un taglio sull'emisfero sinistro (contralaterale al lato iniettato) per evitare una potenziale ambiguità sinistra-destra sulle sezioni.
    AVVISO: ossigenare sempre la soluzione e proteggere le fette dall'esposizione alla luce.
12. Tagliare 300 fette spesse 300 m con il vibratome, ad una velocità di 0,07 mm/s con un'ampiezza di 1 mm. In questa fase, si consiglia di controllare brevemente l'espressione Chronos-GFP nel talamo utilizzando una torcia fluorescente (440-460 nm) e gli occhiali da filtro corrispondenti (500 nm long pass).
13. Isolare la regione dell'ippocampo con un bisturi e trasferirlo in una camera posizionata in un becher pieno di bagno riscaldato (34 gradi centigradi), ossigenato (95%/5% O₂/CO₂) ACSF.
14. Dopo 15 min, prendere la camera dal bagno d'acqua riscaldata e lasciare riposare le fette a temperatura ambiente, ancora ossigenate per almeno 45 min fino all'uso.

5. Registrazione patch-clon a cella intera

1. Trasferire delicatamente una fetta di cervello contenente il complesso ippocampale con una pipetta di trasferimento del vetro su misura alla camera di registrazione montata al microscopio verticale. Una pipetta di trasferimento è costituita da una pipetta Pasteur accorciata (diametro interno 6,5 mm) attaccata a una lampadina di pipetta di gomma. Perfuso continuamente la camera di registrazione (3 mL) con 34 gradi centigradi (riscaldato) ACSF bollente con 95%/5% O₂/CO₂. Impostare la velocità della pompa peristaltica a 2-3 mL/min.
2. Esaminare brevemente l'espressione Chronos-GFP nei terminali assoni nella regione di interesse con l'illuminazione a LED blu (470 nm) e osservare con un obiettivo 4x. La fluorescenza GFP viene visualizzata tramite un filtro di emissione appropriato, con un'immagine della telecamera CCD visualizzata sullo schermo di un computer.
3. Posizionare un'ancora a fette costituita da un filo di platino a forma di U con corde di nylon strettamente distanziate ("arpa") sulla fetta per mantenerla.
4. Passare a un obiettivo di immersione 63x e regolare la messa a fuoco. Verificare la presenza di assoni che esprimono Chronos-GFP e scegliere un neurone piramidale per la registrazione delle patch.
5. Spostare l'obiettivo verso l'alto.
6. Tirare pipette utilizzando un estrattore di elettrodo Brown-Flaming dal vetro borosilicate. L'emittente è impostato per produrre pipette con circa 1 m di diametro della punta. Riempire le pipette con una soluzione interna a base di K-gluconate.
7. Montare la pipetta nel supporto della pipetta sul palco della testa. Abbassare la pipetta nella camera e trovare la punta sotto l'obiettivo. La resistenza alle pipette dovrebbe essere compresa tra 3 e 8 M. Applicare una leggera pressione positiva con una siringa in modo da vedere un cono di flusso di soluzione fuori dalla pipetta e abbassare progressivamente la pipetta e l'obiettivo alla superficie della fetta.
8. Applicare la patch alla cella nella configurazione del morsetto di tensione: avvicinare il neurone identificato e premere delicatamente la punta della pipetta sul soma. La pressione positiva dovrebbe produrre una fossetta sulla superficie della membrana. Rilasciare la pressione per creare un sigillo giga-ohm (>1 resistenza G. Una volta sigillato, impostare la tensione di mantenimento su -65 mV. Rompere la membrana con un forte impulso di pressione negativa: questo si ottiene applicando una forte aspirazione a un tubo collegato al supporto pipette.
9. Registrare in modalità di morsetto corrente a tutta cell le risposte del neurone all'iperpolarizzazione e alla depolarizzazione dei passi correnti (Figura 2A).
   NOTA: questo protocollo verrà utilizzato per determinare le proprietà intrinseche attive e passive della cella. Le routine MATLAB scritte su misura vengono utilizzate per l'analisi off-line^10,16.
10. Registrare nelle risposte post-naptiche di corrente o di morsa di tensione alla stimolazione LED da 475 nm per tutto il campo delle fibre afferenti che esprimono Chronos. Stimolare con treni di 10 stimolazioni di 2 ms di durata a 20 Hz(Figura 2B,C). L'intensità della luce può variare da 0,1 a 2 mW.
    NOTA: l'intensità della luce è stata misurata con una console di alimentazione ottica portatile digitale dotata di un sensore fotodiodo, posizionato sotto l'obiettivo. Le latenze di risposta di 2-4 ms sono caratteristiche per una connessione monossinaptica.
11. Per studiare la natura della trasmissione sinaptica tra gli afferenti a lungo raggio e il neurone registrato, possono essere utilizzati diversi agenti farmacologici. Per distinguere farmacologicamente le risposte dirette e monosintiche dalle risposte indirette tramite l'attivazione della rete, aggiungere all'ACSF 1 TTX e 100 M 4-AP.
    NOTA: l'applicazione bath dei recettori del glutammato permette di determinare la natura del neurotrasmettitore che viene rilasciato e l'identità dei recettori post-sinaptici. Ad esempio, i recettori del glutammato di tipo AMPA saranno bloccati dai recettori NBQX (10 m) e NMDA da APV (100 M). A seconda dello scopo dello studio, i protocolli possono essere concepiti per studiare la dipendenza dalla tensione delle risposte sinaptiche o delle dinamiche di risposta nel tempo.
12. Lavare con soluzione ACSF originale per correggere un'altra cellula, o trasferire la fetta contenente un neurone pieno di biocitina in una piccola fiala riempita con 4% PFA.
13. Dopo una fissazione notturna in 4% PFA, lavare la fetta in 0,1 M PBS (2x per 5 min, 1x per 20 min).
14. Conservare in saccarosio del 30% a 4 gradi centigradi.

6. Rivelazione biocitina

1. Trasferire le fette fisse contenenti neuroni riempiti di biocitina su una lama di vetro in una goccia del 30% di saccarosio ed eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento: mettere la lama sul ghiaccio secco smaltito in una scatola di polistirolo per 1 min fino a quando le gocce di saccarosio sono completamente congelate, quindi premere la lama contro il palmo della mano per scongelare.
2. Lavare la fetta 3x in 0,1 M PBS (2x per 5 min, 1x per 1 h e 50 min), delicatamente agitata. Non superare 2 h per l'ultimo lavaggio.
3. Pre-incubare la fetta a RT per 2 h in una soluzione tampone agitata contenente 2% latte in polvere (0,4 g in 20 mL) per saturare siti non specifici e 0,5% Triton X100 (0,1 mL in 20 mL) per permeabilizzare le membrane in PBS da 0,1 M.
4. Incubare pernottamento a 4 gradi centigradi in una soluzione contenente il 2% di latte in polvere, 1% Triton X100, coniugato streptavidin-Cy5 (1/500) e DAPI (1/1000) in 0,1 M PBS, delicatamente agitato.
5. Lavare la fetta tre volte in 0,1 M PBS (2x per 5 min, 1x per 2 h). L'ultimo lavaggio può durare più a lungo, fino a 4 h, per ridurre la colorazione dello sfondo.
6. Prima di montare la fetta, utilizzare un microscopio a epifluorescenza a ingrandimento 10x configurato per osservare i marcatori fluorescenti Cy5 al fine di identificare il lato della fetta contenente la cella contrassegnata in una camera piena di PBS.
7. Trasferire la fetta su una lama, lato cellulare verso l'alto, asciugarla con un tessuto di carta e montarla utilizzando un supporto di montaggio ad alta resistenza.
8. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza a ingrandimento 10x nella configurazione Cy5 e DAPI per esaminare la posizione del corpo cellulare, e nella configurazione GFP per osservare gli afferenti marcati, o un microscopio confocale ad alta risoluzione a 20x per dettagliato somatico, assonale, e morfologia dendritica (Figura 2D,E). Le impostazioni del filtro sono descritte in dettaglio nella Tabella dei materiali.

Risultati

La procedura qui presentata è stata utilizzata per esprimere una channelrhodopsin (Chronos) blu sensibile alla luce fusa alla GFP nel nucleo antero-dorsale del talamo (ADN), mediante iniezione stereotassica di virus anterogrado adeno-associato. Le coordinate stereotassiche sono state determinate secondo un atlante cerebrale del topo e testate iniettando 200 nL di fluoro-ruby fluorescente. L'animale è stato sacrificato 10 min dopo l'iniezione, e il cervello è stato estratto e fissato durante la notte. Le sezioni cerebr...

Discussione

L'iniezione virale in vivo per esprimere le opsine sensibili alla luce in un'area del cervello definita è un metodo di scelta per l'analisi optogenetica della connettività funzionale a lungo raggio^10,11,17,18. Le iniezioni stereotassiche offrono la possibilità di indirizzare con precisione una specifica area del cervello. La coespressione di un opsino con un reporter fluorescente permette co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm bur	Harvard Apparatus	724962
10 µL Hamilton syringe	Hamilton	1701 RN - 7653-01
10X PBS solution	Thermofisher Scientific	AM9624	text
36% PFA	Sigma-Aldrich	F8775
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED  DC/59022m	use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
All chemicals	Sigma
Bath temperature controler	Luigs & Neumann	SM7	Set at 34°C
beveled metal needle	Hamilton	7803-05	33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors	Dahle Allround	50038
Biocytin	Sigma	B4261	final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries	Havard Apparatus	GC150-10	1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller	Sutter Instruments	P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack	Thermofisher Scientific	28372
butterfly needle for perfusion	Braun	Venofix A	24G
CCD Camera	Andor	DL-604M
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710	20X
curved forceps	FST	11011-17
CY5 configuration (confocal)			Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633
CY5 configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI	Sigma	D9542
DAPI configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A	Axon Instruments
Digital handheld optical meter	ThorLabs	PM100D	Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight	Nightsea	DFP-1	excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA	Sigma	E4368	final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE-2000E	10 or 20X
Filter paper	Whatman
Fluoro-Ruby 10%	Millipore	AG335	disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate	Physitemp	HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml	Sanofi		5 ml vial
HEPES	Sigma	H3375	final 10 mM
High speed rotary micromotor kit	Foredom	K.1070	maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
KCl	Sigma	P4504	final 1,2 mM
Ketamine 1000	Virbac
Ketofen 10%	Merial		100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine)	MSD		16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery	Photonic (via Phymep)	10044
LED Power Supply	Cairn Research	OptoLED Light Source
Manipulators	Luigs & Neumann	SM-7
Mg-ATP 2H20	Sigma	A9187	final 4 mM
MgCl2	Sigma	63069	final 2 mM
Micro temperature controler	Physitemp	MTC-1
Milk powder	Carnation
MultiClamp 700B	Axon Instruments
Na Phosphocreatine	Sigma	P7936	final 10 mM
Na3-GTP 2H20	Sigma	G9002	final 0.4 mM
needle holder/hemostat	FST	13005-14
pClamp acquisition software	Axon Instruments
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	14-16 on the display for 2-3 ml/min
Potassium gluconate (K-gluconate)	Sigma	G4500	Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium	Thermofisher Scientific	P36390
Rompun 2% (xylazine)	Bayer
small scissors	FST	14060-09
Sodium chloride 0.9%	Virbac		dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT	VWR	630-1584
Stereotaxic frame with digital display	Kopf	Model 940	Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate	Life technologies	434315
Streptavidin-Cy5 conjugate	Thermofisher Scientific	S32357
Superglue3 Loctite	Dutscher	999227	1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid	Ethicon	F3210
Syringe pump	kdScientific	Legato 130 - 788130	Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer	Leica	VT1200S	speed 0.07, amplitude 1.
tubing	Gilson	F117942, F117946	Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope	Olympus	BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper	Nalgene