בזריקות Vivo גרם סטריאוטקאית לגירוי מגנטי של תשומות לטווח ארוך בפרוסות המוח של העכבר

Summary

פרוטוקול זה מתאר ערכה של שיטות לזיהוי הקישוריות הפונקציונלית הספציפית של כניסות לטווח ארוך מאזורי מוח רחוקים באמצעות הגירוי בתוך המוח בפרוסות מvivo לשעבר.

Abstract

ידיעת הקישוריות הסינפטית הספציפית לסוג תא היא תנאי מוקדם להבנת המעגלים העצביים הכלל-מהותיים. החקירה תפקודית של חיבורים ארוכי טווח דורש הקלטות ממוקדות של נוירונים בודדים בשילוב עם גירוי ספציפי של קלט מרחוק מזוהה. לעתים קרובות קשה להגיע לטכניקות גירוי מקובלות וחשמליות, משום שהאקטונים מאזורי המוח המתקונים עשויים להתערבב באזור המטרה. המיקוד הסטריאוטקאלי של אזור מוחי מסוים לביטוי וירוס-מתווך של ערוצי יון רגישים לאור מאפשר גירוי סלקטיבי של אקטונים שמקורם באותו אזור באור. זריקות סטריאוטקאיות גרם ניתן להשתמש במבנים מופרדים היטב, כגון הגרעין התלמי הקדמי, בנוסף לאזורים משניים או קורטיקליים אחרים ברחבי המוח.

המתואר כאן היא סדרה של טכניקות הזרקה סטריאוטקאית מדויקת של וקטורים וקטורי המבטא המתקשרים במוח העכבר, ואחריו גירוי של מסופי אקסון בהכנת פרוסת המוח. פרוטוקולים אלה הם פשוטים וחלים באופן נרחב. בשילוב עם מהדק תיקון תא שלם הקלטה מתוך תא עצב מחובר postsynaptically, גירוי של אקסונים מאפשר זיהוי של קשרים פונקציונלית סינפטית, אפיון תרופתי, והערכה של כוחם. בנוסף, מילוי ביוציטוטין של תא העצב המוקלט יכול לשמש לזיהוי מורפולוגית שלאחר-הוק של תא העצב הפוסטסינפטית.

Introduction

הגדרת הקישוריות בין אזורי המוח. נחוצה כדי להבין את המעגלים העצביים שיטות האיתור האנטומי הקלאסיות מאפשרות יצירת קישוריות בין-אזורית, ולימודי הנגעים מסייעים להבנת הארגון ההיררכי של זרימת המידע. לדוגמה, מעגלי המוח לאוריינטציה מרחבית וכיוון הראש מעורבים בזרימה כיוונית של מידע מתלמוס ל-presubiculum. זה הוכח על ידי מחקרים נגעים של הגרעין של אנארטרו-טתלמי (adn) כי לבזות את האות בכיוון הראש במורד הזרם presubiculum, כמו גם את המוח של הפרהיפוקאמאל תא^1,2.

הקישוריות הפונקציונלית בין אזורי המוח קשה יותר ליצור ברמה התאית והתת-תאית. בהיפוקמפוס, אנטומיה מאורגנת מאוד מאפשר לחקור קשרים סינפטית ספציפיים מסלול באמצעות סימולציה חשמלית בהכנה פרוסה. אלקטרודות גירוי להציב שכבה רדיואטום של CA1 ניתן להשתמש במיוחד לעורר את הקלט הנלווה של שייפר מ CA3³. אלקטרודות מעוררות מונחה בשכבה lacunosum מCA1 מפעילים את הכניסה לנתיב הנקבים לCA1^4,5. גירוי חשמלי מפעיל שחרור נוירוטרנסמיטר ממסופי אקסון; עם זאת, הוא מפעיל נוירונים עם somata ליד האתר גירוי, כמו גם אקסונים של מעבר. לכן, השימוש המוגבל לחקר האפפראנטים מאזורי המוח המוגדרים כאשר סיבים של אזורים שונים של מוצא מתערבבים במבנה היעד, כפי שבדרך כלל המקרה בקליפת הקליפה.

נוירונים יכולים גם להיות מגורה עם אור. שיטות אופטיות כוללות את ההפעלה של גלוטמט בכלוב, אשר ניתן לשלב עם סריקת לייזר אחת או שתיים-פוטון. אתרים מרובים במרווחים מקרוב עשויים להיות מגורה ברציפות, ללא נזק מכני לרקמה⁶. זה נעשה בהצלחה למפות קולטני סינפטית, כמו גם להפעיל נוירונים בודדים⁷. בעוד גלוטמט שימוש הזדקנות יכול לשמש ניתוח מעגל מקומי, זה לא מאפשר הפעלה ספציפית של תשומות לטווח ארוך.

שיטת בחירה לחקירת קישוריות ארוכת טווח במעגלים עצביים היא השימוש בביטוי מתווך של וירוסים בתיווך. שימוש בזריקות vivo סיטקאיות כפי שמתואר כאן, ביטוי של ערוצי יונים מגודרת באור יכול להיות ממוקד ומוגבל לאזור המוח הרצוי. בדרך זו, מתקשרים הם יעילים למיפוי התקשרות מתוך מחוז אחד למטרה. מסופי מסופים מתוונים עשויים להיות ממריצים עם אור בהכנה לחיתוך המוח, והקלטות הדבקה מהדק כקריאה מאפשרת בדיקה של הפונקציות והעוצמות של רכיבי מעגל ספציפיים במוח⁸. הגישה האופגנטית בשילוב עם הזרקת סטריאוטקאית של וירוס מציעה ספציפיות ללא תקדים ושליטה גנטית⁹. גירוי באור מאפשר בנוסף לדיוק בזמן התיכון ומרחבית^10,11.

Presubiculum הוא שישה שכבות מבנה קורטיקלית במעבר של ההיפוקמפוס ואת היווצרות פרה-היפוקמאל^12,13. הוא מקבל קלט סינפטית חשוב מן ADN¹¹ אבל גם מכמה אזורים אחרים קליפת המוח הקליפת המוח¹⁴. לפיכך, הגירוי הסלקטיבי של המסופים התאלתלמי בתוך פרוסה מפרה-משנית אינו אפשרי עם גירוי חשמלי ולא מגלוטמט הזדקנות. המתואר בפרוטוקול זה הם שיטות לקביעת קישוריות תפקודית בין אזורי המוח (ADN ו presubiculum) באמצעות זריקות סטריאוטקאית מדויקת של וקטורים ויראליות המבטא ערוצים מגודרת אור. כמו כן תיאר את הגירוי של מסופי אקסונים של הקרנת נוירונים באזור היעד שלהם, בשילוב עם הקלטות של תאים שלמים הקלטה-קלאמפ של נוירונים פוסט סינפטית בהכנה לחיתוך המוח.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות מועצת הקהילה האירופית (2010/63/האיחוד האירופי) ואושרה על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פריז דקארט. הניסויים חייבים לקבל אישור על ההליך לקיים את התקנות המקומיות.

1. תכנון הניסוי

1. הגדירו את אזור המוח. שמיועד למטרה לקבוע את הקואורדינטות סטריאוטקאיות של אתר ההזרקה בעזרת המוח העכבר אטלס¹⁵. בשביל הזכות הימנית הזאת (ADN), הקואורדינטות הן:-0.82 אחורי, 0.75 לרוחב,-3.2 עומק (mm) ביחס לברגמה. ייתכן שיהיה צורך להתאים קואורדינטות לבעלי חיים בגילאים שונים, במין או במתח.
2. לאשר ולתעד את הקואורדינטות של נקודות הציון על ידי הזרקת מעקב פלורסנט (150 כדי 300 nL) הנצפה עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בניסוי פיילוט (איור 1א, ב).
3. הגדר את סוג הווירוס שיש להזריק. אחסן את הווירוס בשש μL-80 ° c, כפי שמומלץ על ידי המפיק. מביאים 1 סדרת מחלקים על הקרח לחדר הניתוח, להזרקה של אחד עד שישה בעלי חיים ביום נתון. תקנות ביוטיחות לשימוש ב-AAV עשויות להיות תלויות במדינה או במוסד, והשימוש ב-PSM 2 כיפה עשוי להידרש.
   הערה: כאן, אנו משתמשים סוג AAV2/5 המבטא כרונו, משתנה channelrhodospin-2 מהיר, התמזגו חלבון פלורסנט ירוק תחת השליטה של היזם סינפסין: AAV5. צין. כרונו-GFP.

2. כירורגיה סטריאוטקאית

1. התקן מסגרת סטריאוטקאית מצויד במחזיק משאבה על ספסל יציב מעבדה סטנדרטי. התאם סטריאוסקופ כדי לראות בבהירות את האזור שבו ימוקם ראשו של בעל החיים. השתמש במקור אור LED לתאורה. סובב את סטריאוסקופ כדי לגשת למחזיק המשאבה, אשר אינו נדרש עבור הצעדים הראשונים של הניתוח.
2. התקנת 10 μL המילטון מזרק מצויד מחט מתכת 33 G משופע במחזיק המשאבה. בדוק את מערכת הפליטה עם המים.
3. באמצעות הזרקת הצפק של שילוב של קטמין הידרוכלוריד ו-xylazine (100 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה), הC57BL6 בעכבר 4 עד 5 שבועות. הכינו תערובת של 1 מ ל של קטמין ו 0.5 mL של xylazine ב 8.5 mL של 0.9% הנאל. זה יגרום 10 מג mg/mL קטמין ו 1 מ"ג/mL xylazine בתמהיל. של תערובת זו, להזריק intraperitoneally 10 μL לכל גרם של משקל הגוף של בעל החיים. משך ההרדמה הוא בערך 1 h.
4. ודאו שהחיה מורדם היטב. עם צביטה בבוהן אז, תוציא את הלשון. כדי להקל על הנשימה . תגלח את השיער הגולגולתי
5. הכנס 20 μL של לידוקאין הידרוכלוריד (4 מ"ג/mL; 2 מ"ג/ק"ג) תחת העור של הראש עבור הרדמה מקומית ולחכות 5 דקות כדי להתחיל את האפקט. כדי למנוע נזק העין עקב יובש, לכסות את העיניים עם משחה אופטלמולוגית אקטואלי.
6. כדי לחשוף את הגולגולת, ליצור חתך ישר בקרקפת עם מספריים ניתוח קטן. מניחים את החיה בתוך מסגרת סטריאוטקאית, החדרת מוטות האוזניים מעט rostral אל האוזן בפועל כדי לנוח על העצם להוריד את העור, אשר צריך ליצור גישה טובה לגולגולת. . הדקו את המקום . התקינו את האף
7. שמור על גוף החיה בצורה אופקית ברמת הראש באמצעות תמיכה מותאמת גובה. מניחים משטח חימום מתחת לעכבר כדי לשמור אותו בטמפרטורה פיזיולוגית.
8. נקה את הגולגולת על ידי החלת 0.9% הנאגל עם מסיר כותנה להסרת רקמות רכות מן העצם. השתמש בסטריאוסקופ. לשאר הניתוח
9. כוונן את הגולגולת כך שהציר ברז-למדא הוא רמה, הנע למעלה או למטה בחלק האף והשיניים. הדבר מחייבת צעדים איטרטיביים של ברגמה ולאמבה, כפי ששניהם ישתנו בהתאם לרמת האף.
10. מצא את המיקום של אתר ההזרקה על הגולגולת. להתאים את המחט ההזרקה מעל אתר ההזרקה בהתאם קואורדינטות האחורי המדיאלי ולסמן את הגולגולת עם מחט חד פעמית. להזיז את המחט ההזרקה כלפי מעלה על ידי 4 ס מ.
11. השתמש בבור 0.5 מ"מ עם מקדחה כדי להגשים פתיחת גולגולת בקוטר 1 מ"מ על הסימן, במחצית של מהירות מקסימלית. לנקות דימום בסופו של דבר עם רקמת נייר.
12. לרוקן את המים הכלולים במזרק המילטון לאחסון על ידי הוצאת לחלוטין את זה עם המשאבה. רק המחט עדיין. תתמלא במים המחט נשטף בין כל שימוש. במים מוהים טהורים עיקור אינו נדרש.
13. קח את סדרת מחלקים של וירוס כי יש להשתמש ליום זה. ודא שהפתרון הנגיפי אינו מוקפא עוד, אך נשאר מקורר (קרוב ל -0 ° c, על הקרח). רק בקצרה להסיר מן הקרח כדי להשיג 700 nL עם מיקרופיפטה עבור כרכים קטנים. הפקדה את הירידה על פיסת 5 ס מ x 5 ס מ של סרט פרפין. להימנע מיצירת בועות. שים את הפתרון הנגיפי שנותר בחזרה על הקרח.
    הערה: אמצעי האחסון של השחרור צריך להיות גדול יותר מעוצמת הזריקה הרצויה (700 nL עבור 200 nL מוזרק). זה ייתן מרווח בטיחות במקרה שחלק מהנוזל יאבד במהלך ההעברה ומאפשר ביצוע הוצאה בדיקה קטנה (צעד 2.16) לפני שתמשיך.
14. הניחו את סרט הפרפין על גבי פתיחת הגולגולת. לצלול את המחט בירידה של הפתרון הנגיפי מבלי לשנות את המיקום האחורי של האנארטרו ולרוחב.
15. השתמש בפונקציה "משיכה" של המשאבה כדי למלא את המזרק עם כ 500 nL של פתרון נגיפי הושלך על הסרט פרפין.  לעשות את זה תחת שליטה חזותית (סטריאוסקופ), לצפות את הירידה נעלמים, ולוודא לא לבשל אוויר.
16. ודא שמזרק התמלא כראוי. בדוק את תפקוד מערכת הפליטה על ידי נהיגה במורד הבוכנה כדי לבדוק הוצאת טיפה קטנה של נוזל של 50 nL תחת בקרה חזותית. . תמחק את המסירה
17. הכנס את המחט לתוך המוח לעומק הנבחר, על-ידי הפיכת הידית לשליטה על הציר הנוריק של המנגנון הסטריאוטקאלי בכיוון השעון. ללחוץ על כפתור "לרוץ" (מהירות 15 nL/מינימום לכרך של 150 nL הוזרק). נפח קטן (50-300 nL, בהתאם וירוס בשימוש) הוא הנפלט לאט מעל 10 דקות עם משאבה אוטומטית.
18. לחכות 10 דקות לאחר הזריקה כדי למנוע דולף מאתר ההזרקה. לאחר מכן, לאט להסיר את המחט מעל 3-5 דקות על ידי הפיכת כפתור שליטה על הציר dorso-הגחוני נגד כיוון השעון.
19. סובב את החלק האנכי של המסגרת הסטריאוטקאית עם המזרק הרחק מהחיה. לשטוף מיד את המחט במים מזוקקים נקי על ידי מילוי-ריקון זה מספר פעמים, כדי למנוע סתימת. . אחסן את המזרק מלא במים
20. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקאית. תפר את העור עם. חוט תפירה 4-0 פוליאמיד לעשות שלושה או ארבעה סטיצ'ים, קשור עם 2-1-1 קשרים כירורגיים סטנדרטיים.
21. מניחים את העכבר בכלוב מחומם עד שהוא מתעורר לחלוטין מהרדמה, ומספקים מים ומזון שנספג בצלחת פטרי הממוקמת על הקרקע. אם מקור החום נמצא מתחת לכלוב, השתמש ברשת מרווח כדי למנוע התחממות יתר.
    הערה: על פי הנחיות מקומיות, מנה אחת של ketoprofen (2-5 mg/kg, תת-עורי) או בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) ניתן להחיל על מנת למנוע כאב.
22. כאשר בעל החיים ער לגמרי, החזר אותו אל כלוב הבית שלו ונטר את רווחתם, במיוחד ביום שלאחר ההזרקה. . בדוק אם יש סימני כאב אם השינוי התנהגותי מוצג, החיה שקלה לעקוב אחר משקל גופו.
23. בהתאם לווירוס שבשימוש, הזמן לביטוי מלא עשוי להשתנות. כאן, אנו מאפשרים 3 שבועות לביטוי של AAV5. צין. כרונוס-גFP

3. פתרונות להקלטות וקיבוע של פרוסות חדות

1. הכנת פתרונות מניות של מרוכז 10x הפתרון חיתוך (125 מ"מ היום, 25 מ"מ סוכות, 2.5 mM KCl, 25 mM נחקו₃, 1.25 mm נה₂PO_4, ו 2.5 mm D-גלוקוז) ו נוזל מלאכותי בעובי השדרה (acsf) פתרון (124 mm הנאקל, 2.5 מילימטר kcl, 26 מ"מ נחקו₃, 1 מ"מ₂פו_4, ו 11 מ"מ D-גלוקוז) במים מוכי טהור לפני ניסויים אלקטרופיזיולוגיה. אחסן את הפתרונות הללו ב-4 ° c בבקבוקים 1 L ללא CaCl₂ ו-MgCl₂.
2. ביום הניסוי, לדלל את פתרונות המניה של פתרון גזירה ו-ACSF 10x לנפח הסופי של 0.5 L כל. מתפרעים עם מערבב מגנטי וחמצן על ידי מבעבע עם 95% או 5% O₂/co₂. הוסף יונים_{דיאטתיים} כדי להשיג ריכוזים סופיים של 0.1 Mm cacl 2 ו 7 מ"מ mgcl₂ עבור פתרון החיתוך, ו 2 מ"מ cacl₂ ו 2 מ"מ MGCL₂ עבור acsf.
3. הכינו את פתרון הפיפטה המבוסס על אשלגן-גלוקונאט שיכיל: 135 mM K-גלוקונאט, 1.2 mM KCl, 10 מ"מ HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 מ"מ MgCl₂, 4 מ"מ mgcl, 0.4 mm טריס-gtp, 10 מ"מ Na₂-פוספולקראטין, ו 2.7 – 7.1 מ"מ ביולוציטין עבור תא post-הוק מורפולוגיה ההתגלות. התאם את ה-pH של הפתרון ל 7.3 ו-osmolarity ל 290 mOsm. מאגר 1 מ"ל משמאל ל -20 ° c.
4. להכין 0.1 M PBS ידי לדלל BupH בתערובת שקיות האבקה מיזוג יבש ב 500 מ ל של מים מזוקקים, וכתוצאה מכך 0.1 M נתרן פוספט, 0.15 M הנאל, pH 7.2.
5. כדי להכין 1 L של 4% בתחתית הפתרון, לדלל 111 mL של 36% בתחתית נוזלי ו 90 mL של 10 x PBS פתרון במים מזוקקים.
6. הכינו 30% הפתרון המכיל 150 גרם של סוכרוז ב 500 מ ל של 0.1 M PBS.

4. הכנת פרוסות מוח

1. הכינו את מרחב הספסל עם נייר הספסל הסופג לפני הפרזיה.
2. התקן טפטוף כ 1 מ' מעל הספסל עבור perfusion ההזנה הכבידה. לצרף המחט פרפר 24 G.
3. הקף את החדר חיתוך של הרטט עם קרח ולאחסן אותו במקפיא.
4. הזרקת את העכבר עם הזרקה תוך הצפק של אותו תערובת של קטמין-קסיטין המשמש לניתוח. להעריך את השלב של ההרדמה ידי צובט את הבוהן עם מלקחיים. כאשר ישן לגמרי, להזריק 100 μL של הפארין (5000 U.I./mL) intraperitoneally.
5. לתקן את החיה עם דבק דביק על נייר סופג, שוכב על גבו. פתח את כלוב החזה על ידי חיתוך הצלעות בצד שמאל וימין עם מספריים קטנים, מן הסרעפת כלפי מעלה. שמור על כלוב החזה פתוח בעזרת דבק סלוטייפ.
6. הצמד את העורקים היורדים עם הדימום והשם דרך החדר השמאלי של הלב עם 4 ° c מקורר ו חמצן (95% O₂/CO₂), חיתוך הפתרון דרך מחט פרפר 24 G. לאחר 5 s, לפתוח את האטריום הימני עם מספריים קטנים.
7. לאחר 5 דקות של הפרזיה, כאשר האיברים חסרי דם, לעצור את הפרזיה. ראשו של בעל החיים עם מספריים גדולים ומלא מיזוג הראש לתוך 4 ° c מקורר ותמיסת החיתוך חמצן בצלחת פטרי.
8. כדי לחלץ את המוח, לחתוך את העור מהצוואר אל האף, ואז לחלק את החוליה האחרונה מהגולגולת עם מספריים. באופן ידני למשוך את העור ולהשתמש מספריים קטנים כדי לפתוח את הגולגולת, חיתוך אותו לאורך קו האמצע, מ caudal אל rostral, כלפי מעלה בין העיניים.
9. הסר בזהירות את עצם הקודקוד ואת החלק caudal של העצם הקדמית עם מלקחיים מעוקל או עצם. לחלץ את המוח עם מרית מעוגל קטן על ידי החדרת המכשיר בין המוח לבין רצפת הגולגולת, הפרדת נורת הריח, עצב הראייה ועצבי הגולגולת אחרים, והמוח הזעיר.
10. הכנס בעדינות את המוח בתמיסה לחיתוך קרח קר (4 ° c) בגביע. מקמו את המוח על נייר מסנן כדי לייבש בעדינות את משטח הקורטיפה. הדבק את קליפת המוח-למטה למחזיק הדגימה של הרטט, עם הצד caudal מול להב, כדי לחתוך פרוסות המוח האופקי.
11. ממלאים את חדר החיתוך עם פתרון חיתוך חמצן קר, כך שהמוח אינו ממוזג לחלוטין. לחתוך את האונה השמאלית (הצידה הצלעות בצד המוזרקים) כדי למנוע בהירות פוטנציאלית שמאל על פרוסות.
    התראה: תמיד חמצן הפתרון ולהגן על פרוסות מפני חשיפה באור.
12. גזור 300 יקרומטר פרוסות עבה עם הרטט, במהירות של 0.07 מ"מ/s בשרעת 1 מ"מ. בשלב זה, מומלץ לבדוק בקצרה את הביטוי כרונו-GFP בתלמוס באמצעות פנס פלורסנט (440-460 nm) ומשקפיים המקביל מסנן (500 ננומטר לעבור ארוך).
13. לבודד את אזור ההיפוקמאל עם אזמל ולהעביר אותו לחדר ממוקם בגביע מלא אמבטיה-מחומם (34 ° c), חמצן (95% או 5% O₂/co₂) acsf.
14. לאחר 15 דקות, קחו את החדר מתוך מרחץ המים המחומם והנח לפרוסות לנוח בטמפרטורת החדר, עדיין חמצן לפחות 45 דקות עד השימוש.

5. הקלטה מדבקת של תאים שלמים

1. מעבירים בעדינות פרוסת מוח המכילה את מתחם ההיפוקמאל עם פיפטה בהזמנה מותאמת זכוכית לחדר ההקלטה רכוב על מיקרוסקופ זקוף. פיפטה העברה עשוי מצינורות פסטר מקוצרים (קוטר פנימי 6.5 מ"מ) המחובר לנורת הצינורות גומי. באופן רציף את חדר ההקלטה (3 מ"ל) עם 34 ° צ' (מחומם) ACSF בוקבלד עם 95% או 5% O₂/co₂. הגדר את המהירות של המשאבה הפריסטטית ל 2-3 mL/min.
2. לבחון בקצרה את הביטוי כרונו-gfp במסופים אקסון באזור הריבית עם תאורה LED כחולה (470 nm) ולהתבונן עם מטרה 4x. הקרינה הפלואורסצנטית GFP הוא דמיינו דרך מסנן פליטה המתאים, עם תמונת מצלמה CCD מוצג על מסך המחשב.
3. מניחים עוגן פרוסה מחוט פלטינה בצורת U עם מחרוזות ניילון מרווח בחוזקה ("נבל") על הפרוסה כדי לשמור עליו.
4. שנה למטרת טבילה של 63 x וכוונן את המוקד. בדקו את האקטונים המבטאים את כרונו-GFP ובחרו תא עצב-על מסלול להקלטה מדבקת.
5. . הזיזו את המטרה כלפי מעלה
6. משוך את הפיפטות בעזרת להבות אלקטרודות. חומות מזכוכית בורוסיליקט הפולר מוגדר לייצר פיפטות עם כ 1 יקרומטר בקוטר קצה. ממלאים את הפיפטות בפתרון פנימי מבוסס ק gluconate.
7. הבהר את הפיפטה במחזיק הצינורות בראש הבמה. הורידו את הפיפטה בחדר. ומצאו את המידע מתחת למטרה התנגדות הפיפטה צריכה להיות בין 3 – 8 MΩ. החילו לחץ חיובי קל עם מזרק כדי לראות חרוט של הפתרון יוצא מתוך הפיפטה ובהדרגה הנמך את הפיפטה והמטרה למשטח הפרוסה.
8. לתקן את התא בתצורת קלאמפ מתח: גישה לעצב מזוהה ולחץ בעדינות את העצה הפיפטה על הסומה. הלחץ החיובי אמור לייצר גומה על משטח הקרום. שחררו את הלחץ כדי ליצור חותם giga-אוהם (> 1 GΩ התנגדות). לאחר שנחתם, הגדר את מתח ההחזקה ל-65 mV. לשבור את הקרום עם דופק חד של לחץ שלילי: זה מושגת על ידי הפעלת יניקה חזקה צינור מחובר מחזיק הפיפטה.
9. הקלטה במצב תא שלם מלחציים הנוכחי את התגובות של תא העצב כדי להקטפולזציה והקטפולאת הצעדים הנוכחיים (איור 2א).
   הערה: פרוטוקול זה ישמש לקביעת המאפיינים הפנימיים הפעילים והפאסיביים של התא. שגרות MATLAB כתובות מותאמות אישית משמשות לניתוח לא מקוון^10,16.
10. שיא התגובה הנוכחית או מתח הצבת התגובות הפוסט המלא-שדה 475 ננומטר LED גירוי של סיבי כלי לימפה המבטא כרונו. לעורר עם רכבות של 10 ממריצים של 2 ms משכים ב 20 הרץ (איור 2ב, ג). עוצמת האור עשויה להשתנות מ-0.1 – 2 mW.
    הערה: עוצמת האור נמדדה עם קונסולת חשמל אופטי כף-יד דיגיטלי המצויד בחיישן פוטודיודה, הממוקם תחת המטרה. השהיות תגובה של 2 – 4 אלפיות השני מאפיינים לחיבור מונוסינפטית.
11. כדי לחקור את האופי של השידור הסינפטית בין afferents ארוכי טווח לבין העצב המוקלט, סוכני תרופתי שונים ניתן להשתמש. כדי פרמקוסליטיות הבחנה ישירה, תגובות monosynaptic מתגובות עקיפות באמצעות הפעלת הרשת, להוסיף 1 μM TTX ו-100 μM 4-AP ל-ACSF.
    הערה: היישום אמבטיה של חוסמי קולטן גלוטמט מאפשר לקבוע את טבעו של הנוירוטרנסמיטור כי הוא שוחרר ואת זהותו של קולטנים פוסט-סינפטית. לדוגמה, קולטני גלוטמט סוג אמפא ייחסמו על ידי NBQX (10 μM) ו NMDA קולטנים על ידי APV (100 μM). בהתאם למטרת המחקר, ניתן לתכנן פרוטוקולים כדי לחקור את התלות המתח של תגובות סינפטיות או הדינמיקה תגובה לאורך זמן.
12. לשטוף עם הפתרון ACSF המקורי כדי לתקן תא אחר, או להעביר את הפרוסה המכילה תא ממולא בביוציטוטין בבקבוקון קטן מלא עם 4% כולייתי.
13. לאחר קיבוע הלילה ב 4% בכיוון הערוץ, לשטוף את הפרוסה ב 0.1 M PBS (2x עבור 5 דקות, 1x עבור 20 דקות).
14. החנות ב-30% סוכרוז ב -4 ° c.

6. התגלות ביוציטוטין

1. העבירו את הפרוסות הקבועות המכילות נוירונים ממולאים בביולוציטין על להב זכוכית בטיפה של 30% סוכרוז ובצעו שלושה מחזורים של הקפאת הקפאה: מניחים את הלהב על הקרח היבש הושלך בקופסת קלקר במשך 1 דקות עד שטיפות של סוכרוז קפואות לחלוטין, ואז לחץ על הלהב כנגד כף היד כדי להפשיר.
2. לשטוף את הפרוסה 3x ב 0.1 M PBS (2x עבור 5 דקות, 1x עבור 1 h ו 50 דקות), נסער בעדינות. אין לחרוג 2 h עבור הכביסה האחרונה.
3. Pre-מודאט פרוסה ב RT עבור 2 h בפתרון מאגר נסער המכיל 2% אבקת חלב (0.4 g ב 20 מ ל) כדי הרוויה אתרים שאינם ספציפיים ו 0.5% טריטון X100 (0.1 mL ב 20 מ ל) כדי לחלחל את הקרומים ב 0.1 M PBS.
4. דגירה לילה ב 4 ° c בפתרון המכיל 2% אבקת חלב, 1% טריטון X100, streptavidin-Cy5 המשלים (1/500), ו DAPI (1/1000) ב 0.1 M PBS, נסער בעדינות.
5. לשטוף את הפרוסה שלוש פעמים ב 0.1 M PBS (2x עבור 5 דקות, 1x עבור 2 h). השטיפה האחרונה יכולה להימשך זמן רב יותר, עד 4 שעות, כדי להפחית את צביעת הרקע.
6. לפני שאתם ממלאים את הפרוסה, השתמשו במיקרוסקופ אפידלנטית בהגדלה של 10x שהוגדר להתבונן בסמני פלורסנט Cy5 כדי לזהות את הצד של הפרוסה המכילה את התא המסומן בתא מלא ב-PBS.
7. העבר את הפרוסה ללהב, לצד התא כלפי מעלה, ייבש אותו ברקמת נייר וטען אותו באמצעות מדיום הרכבה עם עמידות גבוהה.
8. השתמש במיקרוסקופ אפידלנטית בהגדלה של 10x ב-Cy5 ו-dapi כדי לבחון את מיקום הגוף התא, ובתצורת gfp כדי להתבונן afferents מסומנים, או מיקרוסקופ קונפוקלית ברזולוציה גבוהה ב 20x עבור מפורטים הסומלית, axonal, ו מורפולוגיה דנדריטית (איור 2D, E). הגדרות הסינון מפורטות בטבלת החומרים.

תוצאות

ההליך המוצג כאן שימש כדי לבטא באור כחול רגיש המתקשר (כרונו) התמזגו GFP ב הגרעין האנארטרו-מתלמוס (ADN), על ידי הזרקת סטריאוטקאית של החדרת וירוס adn הקשורים. הקואורדינטות הסטריאוטקאיות נקבעו על פי אטלס המוח של העכבר ונבדק על ידי הזרקת 200 nL של מעקב פלורסנט פלואורו-אודם. החיה הוקרבה 10 דקות לאחר הזריק?...

Discussion

בהזרקה vivo נגיפית כדי לבטא opsins רגישים לאור באזור המוח המוגדר היא שיטת בחירה עבור הניתוח אלקטרואופטיקה של קישוריות ארוכת טווח פונקציונליות של^10,11,17,18. זריקות סטריאוטקאיות מציעות את האפשרות למטרה מדויקת של אזור מסוים במוח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm bur	Harvard Apparatus	724962
10 µL Hamilton syringe	Hamilton	1701 RN - 7653-01
10X PBS solution	Thermofisher Scientific	AM9624	text
36% PFA	Sigma-Aldrich	F8775
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED  DC/59022m	use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
All chemicals	Sigma
Bath temperature controler	Luigs & Neumann	SM7	Set at 34°C
beveled metal needle	Hamilton	7803-05	33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors	Dahle Allround	50038
Biocytin	Sigma	B4261	final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries	Havard Apparatus	GC150-10	1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller	Sutter Instruments	P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack	Thermofisher Scientific	28372
butterfly needle for perfusion	Braun	Venofix A	24G
CCD Camera	Andor	DL-604M
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710	20X
curved forceps	FST	11011-17
CY5 configuration (confocal)			Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633
CY5 configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI	Sigma	D9542
DAPI configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A	Axon Instruments
Digital handheld optical meter	ThorLabs	PM100D	Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight	Nightsea	DFP-1	excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA	Sigma	E4368	final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE-2000E	10 or 20X
Filter paper	Whatman
Fluoro-Ruby 10%	Millipore	AG335	disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo)	Nikon/Chroma		Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate	Physitemp	HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml	Sanofi		5 ml vial
HEPES	Sigma	H3375	final 10 mM
High speed rotary micromotor kit	Foredom	K.1070	maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
KCl	Sigma	P4504	final 1,2 mM
Ketamine 1000	Virbac
Ketofen 10%	Merial		100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine)	MSD		16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery	Photonic (via Phymep)	10044
LED Power Supply	Cairn Research	OptoLED Light Source
Manipulators	Luigs & Neumann	SM-7
Mg-ATP 2H20	Sigma	A9187	final 4 mM
MgCl2	Sigma	63069	final 2 mM
Micro temperature controler	Physitemp	MTC-1
Milk powder	Carnation
MultiClamp 700B	Axon Instruments
Na Phosphocreatine	Sigma	P7936	final 10 mM
Na3-GTP 2H20	Sigma	G9002	final 0.4 mM
needle holder/hemostat	FST	13005-14
pClamp acquisition software	Axon Instruments
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	14-16 on the display for 2-3 ml/min
Potassium gluconate (K-gluconate)	Sigma	G4500	Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium	Thermofisher Scientific	P36390
Rompun 2% (xylazine)	Bayer
small scissors	FST	14060-09
Sodium chloride 0.9%	Virbac		dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT	VWR	630-1584
Stereotaxic frame with digital display	Kopf	Model 940	Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate	Life technologies	434315
Streptavidin-Cy5 conjugate	Thermofisher Scientific	S32357
Superglue3 Loctite	Dutscher	999227	1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid	Ethicon	F3210
Syringe pump	kdScientific	Legato 130 - 788130	Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer	Leica	VT1200S	speed 0.07, amplitude 1.
tubing	Gilson	F117942, F117946	Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope	Olympus	BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper	Nalgene