JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لتقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية ، وهي مجموعه من الجسيمات النانويه التي تحدث بشكل طبيعي التي تنتجها الخلايا. يتم تحميل الحويصلات مع جلوكوروداز كانزيم نموذج وتخزينها في ظل ظروف مختلفه. بعد التخزين ، يتم تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية ونشاط الانزيم المغلف.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) هي أهداف واعده في البحوث الحالية ، لاستخدامها كادويه ، وناقلات المخدرات ، والمؤشرات الحيوية. لتطويرهم السريري ، ليس فقط نشاطهم الصيدلاني مهم ولكن أيضا إنتاجهم يحتاج إلى تقييم. وفي هذا السياق ، تركز البحوث علي عزل المركبات الخاصة ، وتوصيفها ، وتخزينها. تهدف المخطوطة الحالية إلى توفير اجراء لتقييم تاثير ظروف التخزين المختلفة علي المركبات الحيوية ، دون التلاعب بالجينات أو المقايسات الوظيفية المحددة. وهذا يجعل من الممكن الحصول بسرعة علي الانطباع الأول من استقرار المركبات التي تحت حاله تخزين معينه ، ويمكن مقارنه المركبات التي تستمد من مصادر الخلايا المختلفة بسهوله. ويستند قياس الاستقرار علي المعلمات الفيزيائية الكيميائية للمركبات (الحجم ، وتركيز الجسيمات ، والمورفولوجية) والحفاظ علي نشاط حمولتها. يتم تقييم هذا الأخير من قبل التغليف بوساطة سابونين من انزيم بيتا جلوكوروداز في المركبات أليفه. جلوكوروداز يعمل كبديل ويسمح للقياس الكمي سهله عن طريق انشقاق جزيء مراسل الفلورسنت. يمكن ان يكون هذا البروتوكول أداه للباحثين في البحث عن ظروف التخزين التي تحتفظ علي النحو الأمثل خصائص EV لدفع البحوث EV إلى التطبيق السريري.

Introduction

المركبات أليفه هي جسيمات نانويه الغشاء التي تنتجها تقريبا جميع أنواع الخلايا. للخلايا الثدييات ، يمكن تقسيم المركبات الاساسيه إلى مجموعتين رئيسيتين مع مسارات إنتاج متميزة1،2. وتنتج الحويصلات غشاء ، مع نطاق حجم من تقريبا 100-1000 نانومتر ، من قبل الناشئة مباشره من غشاء الخلية. وتستمد exosomes ، الحجم 30-200 نانومتر ، من الهيئات متعددة الخلايا التي شكلتها الداخل في مهدها إلى التنظير الداخلي الذي فتيل في وقت لاحق مع غشاء الخلية للإفراج عن التماثيل المتعددة في وقت واحد. الوظيفة الرئيسية لهذه الحويصلات هو نقل المعلومات بين الخلايا3. لهذا الغرض ، يتم فرز الشحنات مثل RNA والحمض النووي والبروتينات بنشاط في نفوسهم. المركبات التي يمكن ان تنقل مجموعه متنوعة من الآثار علي أهدافها ، مع الآثار المترتبة علي كل من الحالة الصحية والمرض. علي جانب واحد, انها التوسط الآثار الايجابيه مثل تجديد الانسجه, العرض مستضد, أو اثار المضادات الحيوية, مما يجعلها أهداف الميمون لتنميتها كما التداوي4,5. علي الجانب الآخر, المركبات النارية يمكن ان تعزز الاوعيه الدموية الورم6, حمل اثار المارة في الاستجابات الإجهاد7, وقد تلعب دورا في امراض المناعة الذاتية8 والامراض التهابيه9. التالي ، فانها قد تكون عنصرا رئيسيا لفهم أفضل للعديد من الآثار المرضية. ومع ذلك ، فان وجود المركبات المتغيرة في الامراض المنوعة ، مثل السرطان10،11،12 واضطرابات القلب والاوعيه الدموية13، وسهوله الوصول اليها في الدم والبول يجعلها مثاليه حيوي. وأخيرا ، والتوافق البيولوجي جيده14 وقدرتها علي استهداف المتاصله جعل المركبات الحيوية أيضا مثيره للاهتمام لتسليم المخدرات15. في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف بروتوكول لتقييم استقرار التخزين للمركبات المركبة التي تستمد من خلايا الثدييات ، وهي خاصيه هامه لا يزال التحقيق فيها قليلا.

للتطوير السريري للمركبات المركبات الخاصة ، لا تزال هناك العديد من العقبات للتغلب علي16، بما في ذلك تقييم اثارها العلاجية ، والإنتاج ، وتنقيه ، وتخزين17. بينما-80 درجه مئوية وينظر علي نطاق واسع علي انها معيار الذهب لتخزين EV18، والمجمدات المطلوبة مكلفه ، والحفاظ علي سلسله الباردة المطلوبة من الإنتاج إلى المريض يمكن ان تكون صعبه. وعلاوة علي ذلك ، تشير بعض التقارير إلى ان التخزين في-80 درجه مئوية لا يزال لا يحفظ علي النحو الأمثل المركبات أليفه ويدفع خسارة في وظيفة EV19,20. وقد اقترحت طرق أخرى ، مثل تجميد التجفيف21أو22 أو التجفيف بالرذاذ23، كبدائل محتمله للتخزين المجمد للمركبات المركبة.

والطريقة المثلي لتقييم استقرار التخزين هي اختبار المركبات الحيوية في المقايسات الوظيفية أو من خلال تقييم علامة محدده ، علي سبيل المثال ، نشاطها المضاد للبكتيريا19. وهذا ممكن عندما يكون التاثير المطلوب من الحويصلات المعروفة وعندما مجموعه واحده متميزة من المركبات التي يمكن دراستها. وإذا ما قورنت المركبات التي من مصادر مختلفه للخلايا (علي سبيل المثال ، بالنسبة لتغليف المخدرات) أو إذا لم تكن هناك قراءات وظيفية معروفه ، فانه لم يعد من الممكن تقييم التغيرات الناجمة عن التخزين بطريقه مباشره.

من ناحية أخرى ، ببساطه تقييم التغييرات في المعلمات الفيزيائية الكيميائية ، مثل الحجم ، واستعاده الجسيمات ، وتركيز البروتين ، لا يتنبا دائما التغيرات في نشاط EV ، كما هو مبين في براءة اختراع الاخيره20.

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لقياس استقرار التخزين من المركبات أليفه من خلال تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية جنبا إلى جنب مع نشاط انزيم بيتا جلوكوروداز مغلفه كبديل للبضائع من المركبات أليفه. يتم تحميل الانزيم من قبل حضانة سابونين ، طريقه معتدله التي أنشئت مع المركبات الخاصة من مصادر مختلفه21،24،25. يشكل سابونين المسام العابرة في غشاء EV ، والذي يسمح بامتصاص الانزيم في الحويصلة. كما الانزيمات عرضه لتفقد نشاطها إذا تعرضت لظروف التخزين غير المواتية ، فهي بديل مثالي لتقييم الحفاظ علي الشحنات الوظيفية للمركبات المركبات الخاصة.

وقد أثبتنا ان تطبيق هذا البروتوكول علي المركبات التي تستمد من الخلايا الجذعية البشرية (MSCs) ، والخلايا المبطنة بالوريد السري البشري (HUVECs) ، والخلايا الظهاريه السرطانية البشرية (A549) تؤدي في الواقع إلى اختلافات كبيره في استقرار التخزين بين خطوط الخلايا المختلفة ، والتي ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار عند اختيار مصدر EV21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-ثقافة الخلية وإنتاج الخلايا المتوسطة المكيفة

  1. عموما ، زراعه الخلايا تحت الظروف الفردية المطلوبة لخط الخلية المعنية.
  2. زراعه الخلايا ل 24-72 h في ظروف خاليه من المصل أو في المتوسطة التي تحتوي علي مصل الأبقار الجنينية المنضب EV.
    ملاحظه: إذا تم استخدام المستنفدة للمركبات اليورانيوم المنضب ، وتوظيف طريقه ثبت ان تستنفد بكفاءة المصل ، لمنع التلوث مع الأبقار المشتقة مصل المركبات26.
  3. جمع المتوسطة من قوارير. الطرد المركزي في 300 x g ل 10 دقيقه لبيليه الخلايا. بعناية جمع المتوسطة الخلية المكيفة (CCM) ، دون إزعاج الخلايا التي تغلف. يفضل, استخدام CCM مباشره, أو تخزينه بين عشيه وضحيها في 4 ° c.
    ملاحظه: من الأفضل دائما استخدام CCM المنتجة حديثا. وإذا تعذر التحايل علي التخزين لفترات زمنيه أطول ، فينبغي تسجيل جميع البارامترات ذات الصلة وفقا للمبادئ التوجيهية MISEV201826، ويجب ان تؤخذ في الاعتبار التحيزات المحتملة للنتائج المكتسبة.
  4. مثال بروتوكول ل HUVECs
    1. زراعه خلايا HUVEC ل 120 h في غير عادي-2 المتوسطة التي تحتوي علي والمكملات الأخرى.
    2. زراعه الخلايا HUVEC ل 48 h في EBM-2 القاعدية المتوسطة خاليه من اي ملاحق اضافيه.
    3. جمع المتوسطة من قوارير وتنفيذ الخطوة طرد كما هو مبين أعلاه (الخطوة 1.3). عاده ، استخدم 100 مل من المتوسطة لعزل EV واحد.

2-الحلول الخاصة بالذخائر العنقودية

  1. مباشره قبل نبذ حلول (UC) ، الطرد المركزي CCM لمده 15 دقيقه في 3,000 x g و 4 درجه مئوية لأزاله الحطام الخلية والاجلمرتر الكبيرة.
  2. نقل بعناية ماده طافي إلى أنابيب UC. إذا كان استخدام الدوار زاوية ثابته ، وضع علامة علي اتجاه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لتسهيل استعاده بيليه EV بعد UC. الطرد المركزي لمده 2 ح في 120,000 x g، مع k-عامل من 259.4.
  3. بعد UC ، وتجاهل بعناية ماده طافي باستخدام pipet المصلية ، لتجنب اضطراب المركبات الحيوية التي تغلف.
    ملاحظه: قد يكون بيليه غير مرئية.
  4. أضافه 200 μl من 0.2 μm-تصفيه الفوسفات-مخزنه المالحة (التلفزيونية الخاصة) إلى الأنبوب الأول واستخدام التلفزيونية والمتبقية ماده طافي لأعاده تعليق بيليه عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا. نقل تعليق EV الناتجة إلى الأنبوب التالي من العينة المعنية واستخدامه لأعاده التعليق. المضي قدما بهذه الطريقة لأعاده تعليق جميع المركبات التي من العينة في حجم النهائي من حوالي 300-350 μL.
  5. بعد أعاده التعليق ، وتاكيد وجود الجزيئات عن طريق تحليل تتبع جسيمات متناهي (NTA). استخدم الإعدادات المحسنة لنوع EV المعطي ، مثل الإعدادات الموجودة أدناه (الخطوة 2.5.1).
    ملاحظه: الأوراق من جاردينر وآخرون27 و vestad وآخرون28 تحتوي علي معلومات قيمه عن كيفيه تحسين المعلمات لقياس المركبات الحيوية.
    1. لأعاده إنتاج النتائج الموصوفة أدناه ، استخدام الاداات (علي سبيل المثال ، نانوسايت LM14) مجهزه بالليزر الأخضر. تسجيل ثلاثه أشرطه الفيديو من 30 s مع كسب الشاشة من 1.0 ومستوي الكاميرا من 13. للتحليل ، استخدم كسب الشاشة 1.0 وعتبه الكشف عن 5.
  6. استخدام بيليه علي الفور ، إذا كان ذلك ممكنا ؛ والا ، تخزينه في 4 °C بين عشيه وضحيها.

3. جلوكوروداز التغليف في المركبات الخاصة

  1. إلى بيليه أعاده تعليق ، أضافه بيتا جلوكوروداز (10 ملغ/مل في تلفزيوني) إلى تركيز النهائي من 1.5 ملغ/مل و سابونين (10 ملغ/مل في ح2س) إلى تركيز نهائي من 0.1 ملغ/مل. اخلط جيدا بواسطة فورتيكنج لمده 3 ليالي.
  2. احتضان لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع خلط شكل متقطع عن طريق التحريك برفق الأنبوب. بعد الحضانة ، تنقيه مباشره بواسطة الفصل اللوني الاستبعاد الحجم (SEC) (انظر القسم 5).
    ملاحظه: لا تقم باعاده تجميد عينات جلوكوروداز مره واحده أذابه ، لمنع تدهور الانزيم بسبب التجمد.

4. إنتاج الليليسوم

  1. لاعداد الشحمية للمقارنة مع المركبات الليفية ، حل 1 ، 2-ديميريستوريل-sn-غليسرو-3-فوسفولكولين (dmpc) و1 ، 2-ديبالميتويل--------3-فوسفونوكولين (dppc) في التموينية المولي 2:3 في كلوروفورم إلى تركيز نهائي من 5 ملم. قم بتحضير 1 مل من الكوبوتس في قوارير السائل اللوني عالي الأداء (HPLC) واتركها تجف بين عشيه وضحيها لتشكل فيلما دهنيا.
    تحذير: كلوروفورم سام ويشتبه في ان يكون الانحلال. اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل معها.
  2. أعاده ترطيب الفيلم الدهني مع 1 مل من الأفلام التي تحتوي علي 1.5 ملغ/مل جلوكوروداز. يسخن إلى 42 درجه مئوية ودوامه لمده 1 دقيقه. تسخين الجمعية الطارد إلى 42 درجه مئوية وقذف الدهون تعليق 11x من خلال غشاء البولي 200 nm. تنقيه مباشره بواسطة SEC (انظر القسم 5).

5. تنقيه بواسطة SEC

  1. اعداد العمود SEC باستخدام البروتوكول التالي.
    1. استخدم فقط المياه النقية الطازجة والمخازن المؤقتة المحضرة حديثا. تصفيه جميع المخازن المؤقتة من خلال فلتر غشاء 0.2 μm و ديغا لهم لمنع تشكيل فقاعات الهواء في العمود.
    2. لاعداد العمود SEC ، استخدم المصفوفة القائمة علي الترشيح هلام (علي سبيل المثال ، السفبرز Cl-2b) أو آخر SEC المتوسطة مناسبه لفصل المركبات الخاصة والدهنية من شوائب البروتين والانزيم الزائد. أولا ، قم بازاله الحل EtOH 20 ٪ يتم تخزين المتوسطة في ، لمنع تشكيل فقاعه الهواء في العمود. لهذه الغاية ، والطرد المركزي المتوسط SEC في 3,000 x g لمده 10 دقيقه ، وأزاله etoh ، واستبدالها مع المياه الغازية.
    3. أملا عمودا زجاجيا (بقطر داخلي يبلغ 10 ملم) مع متوسط SEC إلى علامة 15 مل.
      ملاحظه: ستختلف وحدات التخزين للاعمده ذات الابعاد المختلفة. تاكد من السماح للهلام يستقر تماما.
    4. قبل تشغيل ، تتوازن العمود مع مجلدين العمود علي الأقل من تلفزيوني. لتخزين العمود ، اغسله أولا بحجم عمود واحد من الماء ، متبوعا بمجلدين علي الأقل من الاعمده بنسبه 20% EtOH. بعد تخزين, يغسل العمود اولي مع واحده عمود حجم الماء قبل تولد مع [ببس].
    5. استخدام ما يصل إلى 400 μL من EV أو تعليق ليبوسوم في فصل واحد. جمع الكسور من 1 مل. بعد SEC ، اما تخزين المركبات الحيوية المنقية (انظر القسم 7) أو إخضاعها لفحص جلوكورونيداز (انظر القسم 6).
  2. تاكيد فصل المركبات الخاصة والشحمية من تلويث البروتينات والجلوكوروداز الحرة. وتحقيقا لهذه الغاية ، ربط تركيزات الجسيمات من الكسور التي تم جمعها مع تركيز البروتين والنشاط جلوكورونيداز.
    1. تقييم تركيز الجسيمات من قبل NTA (انظر 2.5)
    2. تقييم محتوي البروتين عن طريق فحص حمض ثنائي اللون (BCA) أو فحص كمي آخر مناسب للبروتين. قم باجراء الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. تقييم النشاط جلوكوروداز بواسطة فحص جلوكوروداز (انظر القسم 6).
  3. اختياريا ، وتقييم المورفولوجية EV عن طريق المجهر الكترون الإرسال (TEM) والمسح المجهري الكترون (SEM).
    1. لاعداد عينات TEM ، أضافه 10 μL من تعليق EV إلى شبكه TEM ، احتضان لمده 10 دقيقه ، ومن ثم لطخه بعيدا اي السائل الزائد باستخدام ورقه فلتر. أداء التثبيت لمده 10 دقيقه مع 10 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد ولطخه بعيدا اي فائض. غسل 3x مع الماء. وصمه عار الحويصلات من قبل الحاضنة 20 ق مع 30 μL من 1 ٪ هيدرات حمض تونغستيك الفوسفور. بعد التنقيط بعيدا الزائدة ، تجف الحويصلات بين عشيه وضحيها. تصور من قبل TEM.
      تحذير: الفوسفات-حمض tungstic هو الكاوية للغاية. التالي ، حماية الجلد والعينين.
    2. لوزارة شؤون المعوقين ، وإصلاح عينات TEM المعدة مسبقا علي أقراص الكربون و بصق لهم مع طبقه ذهبيه سميكه 50 nm. تصور من قبل SEM.

6. فحص جلوكوروداز

  1. ان يسمح مقارنه بين عينات مختلفه وتخزين شروط ب [كوردد] جسيم رقم وانزيم نشاط, اولي يقيس الجسيم تركيز من العينة ب [ا] (يري خطوه 2.5).
  2. اعداد حل العمل من فلوريسئين دي-β-د جلوكورونيد عن طريق أضافه 1 μL من المجمع (10 ملغ/مل في ح2س) إلى 199 ΜL من تلفزيوني. أضافه 25 μL من هذا الحل إلى 125 μL من المركبات الخاصة المنقية للحصول علي تركيز نهائي من 8.3 ميكروغرام/مل. Pipet العينة في لوحه سوداء 96-بئر. قياس نقطه الوقت 0 h مع قارئ لوحه ، وذلك باستخدام 480 nm كما الاثاره و 516 nm كما الطول الموجي الانبعاثات.
  3. تغطيه لوحه باحكام (علي سبيل المثال ، مع رقائق بلاستيكية شفافة تستخدم للواح PCR) للتقليل من التبخر واحتضان في الظلام ل 18 ح في 37 درجه مئوية. قياس إنتاج فلوريسئين باستخدام معلمات قارئ لوحه المدرجة في الخطوة 6.2.

7. تخزين المركبات الكترونيه والشحمية

ملاحظه: لجميع أغراض التخزين ، فانه من المستحسن استخدام أنابيب منخفضه الربط للحد من خسارة EV بسبب الامتزاز.

  1. اتبع المعلمات في هذا القسم لأعاده إنتاج النتائج التمثيلية الواردة أدناه. استخدام عينات تتكون من 400 μL من تعليق EV.
    1. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية أو-80 درجه مئوية أو انتقل إلى الخطوات المدرجة أدناه.
    2. تجميد المركبات الخاصة.
      1. أضافه تريهالوز (40 ملغ/مل في ح2س) تصل إلى تركيز النهائي من 4 مغ/مل إلى المركبات الدقيقة المنقية. تجميد العينات في-80 درجه مئوية لمده 1 ساعة علي الأقل.
      2. تجميد العينات باستخدام المعلمات التالية. لتجفيف الرئيسية ، تعيين درجه حرارة الرف إلى 15 درجه مئوية والضغط علي 0.180 ميليبار وترك عينات لتجف ل 46 h. لتجفيف النهائي ، وتعيين درجه حرارة الرف إلى 25 درجه مئوية والضغط علي 0.0035 ميليبار وترك عينات لتجف لمده 2 ح. تخزين العينات المجففة بالتجميد في 4 درجه مئوية.
      3. لأعاده هيدرات العينات ، أضف H2O ، يساوي مقدار تعليق EV الموجود في البداية (عاده ، 400 μl). لا تستخدم اي مخزن مؤقت للاماهه.

8. التحليل بعد التخزين

  1. لتقييم نشاط الانزيم ، قم أولا بازاله جلوكوروداز الحرة ، والتي قد تسربت من المركبات الخاصة اثناء التخزين. تحقيق ذلك عن طريق خطوه اضافيه من تنقيه التي يتم تنفيذها اما بواسطة SEC (انظر الخطوة 5) أو لاتناظريه تدفق الحقل تدفق التجزئة (AF4) (انظر الخطوة 8.1.2).
    ملاحظه: يرجى العلم ان كلا الأسلوبين يؤدي إلى تخفيف من عينه EV; التالي ، استخدام تركيزات EV كافيه قبل التخزين لتجنب التحرك تحت حد الكمية NTA. نتوقع 1:10 التخفيف من الجسيمات بسبب SEC أو AF4.
    1. لتنقيه SEC ، اتبع البروتوكول المذكور أعلاه (انظر القسم 5).
    2. اجراء تنقيه AF4.
      1. اعداد الصك باستخدام قناه صغيره مع فاصل 350 μm و 30 دينارا كويتيا الوزن الجزيئي قطع غشاء السليلوز. وضع فلتر حجم المسام 0.1 μm بين مضخة HPLC وقناه AF4. استخدام الطازجة أعدت 0.1 μm--تصفيه التلفزيونية كمرحله متنقلة للحد من حموله الجسيمات والضوضاء في كاشفات تشتت الضوء.
      2. الكشف عن البروتينات باستخدام كاشف الاشعه فوق البنفسجية تعيين إلى 280 نانومتر. للكشف عن الجزيئات ، استخدم تشتت الضوء متعدد الزوايا مع تعيين الليزر إلى 658 نانومتر.
      3. استخدم أسلوب التشغيل التالي. قبل التركيز لمده دقيقه واحده مع تدفق التركيز من 1 مل/دقيقه ؛ ثم ، حقن 300 μL من العينة بمعدل 0.2 mL/min ومواكبه تدفق التركيز لمده 10 دقيقه. بعد الحقن ، الوت العينة في 1 مل/دقيقه في حين تطبيق تدفق الصليب الذي ينخفض من 2 مل/دقيقه إلى 0.1 مل/دقيقه علي مدي 8 دقيقه الوت لمده 10 دقيقه أخرى دون تدفق الصليب. جمع الكسور من 1 مل ، ابتداء من 12.5 دقيقه والاستمرار حتى 27 دقيقه.
    3. اجراء فحص جلوكوروداز علي النحو الموصوف أعلاه (انظر القسم 6).
  2. لتقييم حجم وتركيز ، واستخدام NTA كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.5).
  3. اختياريا ، وأداء TEM وSEM لتقييم المورفولوجية من المركبات التي بعد التخزين (انظر 5.3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الشكل 1 يعرض خصائص التخزين من المركبات التي تم عزلها من HUVECs. تم عزل المركبات الخاصة من قبل جامعه كاليفورنيا ، تم تغليف جلوكورونيداز ، وبعد SEC ، تم تقييم المركبات الكيميائية المنقية لخصائصها الفيزيائية من قبل NTA. وخضعت عينه من الحويصلات لاحقا لتنقيه AF4 وتم قياس نشاط جلوكوروداز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا شاملا لدراسة استقرار المركبات التي تخضع لظروف تخزين مختلفه. مع مزيج من جلوكوروداز مغلفه كما قراءات وظيفية وتقييم المعلمات الفيزيائية للمركبات المركبات الخاصة ، وبروتوكول يسمح لتقييم الاستقرار التخزين مباشره من المركبات الخاصة ومقارنه المركبات الخاصة م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث النانوماتفوتوره المبتدئين الذي قدمته وزاره التعليم والبحوث الاتحادية في ألمانيا (رقم المنحة 13XP5029A). وقد تم دعم ماكسيميليان ريختر من قبل المؤسسة الاكاديميه المانيه للمنح الدراسية من خلال زمالة الدكتوراه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)Sigma-AldrichP2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)Sigma-AldrichP4329-25MG
225 cm² cell culture flasksCorning431082Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membraneWyatt Technology Europe1854
350 µm spacerWyatt Technology Europe
Automated fraction collectorThermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidaseSigma-AldrichG7646-100KU
ChloroformFisher scientificC/4966/17
Column ovenHitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrateSigma-AldrichT9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mmMerckVVLP04700Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3156Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtecWyatt Technology Europe
EGM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3162Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate SealersR&D SystemsDY992used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
EthanolFisher scientificE/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating BlockAvanti Polar Lipids610000-1EA
Filter supportAvanti Polar Lipids610014-1EAused for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronideThermo Fisher ScientificF2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36Thermo Fisher Scientific18912014
Hettich Universal 320 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGUsed for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGUsed for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cellsLonza Verviers, S.p.r.C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CMKimble420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSCChrist
Microcentrifuge Tubes, PolypropyleneVWR international525-0255the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laserMalvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranesWhatman/GE Healthcare110406used for liposome preparation
PEEK Inline filter holderWyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrateSigma-Aldrich79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugationBeckman Coulter355622
QuantiPro BCA Assay KitSigma-AldrichQPBCA-1KT
SaponinSigma-Aldrich47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2bGE Healthcare17014001
SEM copper grids with carbon filmPlanoS160-4
Small AF4 channelWyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ESQuorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotorBeckman Coulter339160
Ultimate 3000 Dionex autosamplerThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pumpThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasserThermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 KBeckman Coulter
UV detectorThermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filterWhatman/GE Healthcare10401712Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

References

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450(2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746(2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356(2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259(2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190(2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465(2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377(2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671(2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved