Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires

Résumé

Nous présentons ici un protocole facilement applicable pour évaluer la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires, un groupe de nanoparticules naturelles produites par les cellules. Les vésicules sont chargées de glucuronidase en tant qu’enzyme modèle et stockées dans des conditions différentes. Après le stockage, leurs paramètres physicochimiques et l’activité de l’enzyme encapsulée sont évalués.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des cibles prometteuses dans la recherche actuelle, à utiliser comme médicaments, porteurs de médicaments et biomarqueurs. Pour leur développement clinique, non seulement leur activité pharmaceutique est importante, mais aussi leur production doit être évaluée. Dans ce contexte, la recherche se concentre sur l’isolement des véhicules électriques, leur caractérisation et leur stockage. Le présent manuscrit vise à fournir une procédure facile pour l’évaluation de l’effet des différentes conditions de stockage sur les véhicules électriques, sans manipulation génétique ou essais fonctionnels spécifiques. Cela permet d’obtenir rapidement une première impression de la stabilité des véhicules électriques sous une condition de stockage donnée, et les EVs dérivées de différentes sources de cellules peuvent être comparées facilement. La mesure de stabilité est basée sur les paramètres physicochimiques des EVs (taille, concentration des particules et morphologie) et la préservation de l’activité de leur cargaison. Ce dernier est évalué par l’encapsulation médiée par la saponine de l’enzyme bêta-glucuronidase dans les EVs. La glucuronidase agit comme un substitut et permet une quantification facile par le clivage d’une molécule de reporter fluorescente. Le présent protocole pourrait être un outil pour les chercheurs dans la recherche de conditions de stockage qui conservent de manière optimale les propriétés EV pour faire progresser la recherche EV vers l’application clinique.

Introduction

Les EVs sont des nanoparticules liées à la membrane produites par presque tous les types de cellules. Pour les cellules de mammifères, EVS peut être subdivisé en deux groupes principaux avec des voies de production distinctes^1,2. Les vésicules membranaires, d’une taille allant d’environ 100 à 1000 nm, sont produites par le bourgeonnement direct de la membrane cellulaire. Les exosomes, de taille 30-200 nm, sont dérivés de corps multivésiculaires formés par le bourgeonnement vers l’intérieur en endosomes qui fusionnent ensuite avec la membrane cellulaire pour libérer plusieurs exosomes à la fois. La fonction principale de ces vésicules est le transport de l’information entre les cellules³. À cette fin, les cargaisons tels que l’ARN, l’ADN et les protéines sont activement triés en eux. EVs peut transmettre une variété d’effets sur leurs cibles, avec des implications pour la santé et l’état de la maladie. D’un côté, ils médient des effets positifs tels que la régénération tissulaire, la présentation de l’antigène ou les effets antibiotiques, ce qui en fait des cibles propices à leur développement en tant que thérapeutique^4,5. De l’autre côté, EVs peut favoriser la vascularisation tumorale⁶, induire des effets de spectateur dans les réponses de stress⁷, et pourrait jouer un rôle dans les maladies auto-immunes⁸ et les maladies inflammatoires⁹. Ainsi, ils pourraient être un élément clé pour une meilleure compréhension de nombreux effets pathologiques. Cependant, la présence de EVS altérés dans les maladies multiples, comme le cancer^10,11,12 et les troubles cardiovasculaires¹³, et leur accessibilité facile dans le sang et l’urine les rend idéales Biomarqueurs. Enfin, leur bonne biocompatibilité¹⁴ et leur capacité de ciblage intrinsèque rendent les EVS aussi intéressants pour la livraison de médicaments¹⁵. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’évaluation de la stabilité de stockage des EVs dérivées de cellules de mammifères, une propriété importante qui est encore peu étudiée.

Pour le développement clinique des EVs, il y a encore beaucoup d’obstacles à surmonter¹⁶, y compris l’évaluation de leurs effets thérapeutiques, la production, la purification, et le stockage¹⁷. Alors que-80 ° c est largement considéré comme la norme d’or pour le stockage EV¹⁸, les congélateurs requis sont coûteux, et le maintien de la chaîne de froid requis de la production au patient peut être difficile. De plus, certains rapports indiquent que le stockage à-80 ° c ne préserve pas encore de manière optimale EVS et induit une perte dans la fonctionnalité ev^19,20. D’autres méthodes, comme le lyophilisation^21,22 ou le séchage par pulvérisation²³, ont été proposées comme alternatives potentielles au stockage congelé des véhicules électriques.

La meilleure façon d’évaluer la stabilité du stockage serait de tester les EVs dans les essais fonctionnels ou par l’évaluation d’un marqueur spécifique, par exemple, leur activité antibactérienne¹⁹. Ceci est possible lorsque l’effet désiré des vésicules est connu et quand un groupe distinct d’EVs doit être étudié. Si des EVs provenant de différentes sources cellulaires doivent être comparées (p. ex. pour l’encapsulation de médicaments) ou s’il n’y a pas de lecture fonctionnelle connue, il n’est plus possible d’évaluer les changements dus au stockage de manière directe.

D’autre part, l’évaluation simple des changements dans leurs paramètres physicochimiques, tels que la taille, la récupération des particules et la concentration des protéines, ne prédit pas toujours les changements dans l’activité EV, comme cela a été démontré dans un brevet récent²⁰.

Ici, nous fournissons un protocole facilement applicable pour mesurer la stabilité de stockage des EVs en évaluant leurs paramètres physicochimiques combinés avec l’activité d’une enzyme bêta-glucuronidase encapsulée comme substitut pour la cargaison du EVs. Le chargement de l’enzyme se fait par incubation de saponine, une méthode légère établie avec des EVS provenant de différentes sources^21,24,25. La saponine forme des pores transitoires dans la membrane EV, ce qui permet l’absorption enzymatique dans la vésicule. Comme les enzymes sont sujettes à perdre leur activité si elles sont soumises à des conditions de stockage défavorables, elles constituent un substitut idéal pour l’évaluation de la préservation des cargaisons fonctionnelles des véhicules électriques.

Nous avons démontré que l’application de ce protocole à des EVs dérivées de cellules souches métréchymateuses humaines (MSCs), de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et d’adénocarcinome des cellules épithéliales alvéolaires (A549), en effet, entraîne de grandes différences dans stabilité de stockage entre les différentes lignées cellulaires, qui doivent être prises en considération lors du choix de la source EV²¹.

Protocole

1. culture cellulaire et production de milieu cellulaire

1. En général, cultiver des cellules dans les conditions individuelles requises pour la lignée cellulaire respective.
2. Cultiver les cellules pendant 24-72 h dans des conditions exemptes de sérum ou dans un milieu contenant du sérum bovin foetal (FBS) appauvri en EV.
   Remarque: si le FBS appauvri en EV est utilisé, utiliser une méthode éprouvée pour épuiser efficacement le sérum, afin de prévenir la contamination par des EVs de bovins dérivés du sérum²⁶.
3. Recueillir le support des flacons. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min pour pellets les cellules. Recueillir soigneusement le milieu cellulaire (CCM), sans déranger les cellules granulées. De préférence, utilisez le CCM directement ou rangez-le une nuit à 4 ° c.
   Remarque: il est toujours préférable d’utiliser des CCM fraîchement produites. Si le stockage pour des périodes plus longues ne peut pas être contourné, tous les paramètres pertinents doivent être consignés conformément aux directives MISEV2018²⁶, et les biais potentiels des résultats obtenus doivent être pris en considération.
4. Exemple de protocole pour HUVECs
   1. Cultiver des cellules HUVEC pour 120 h dans le milieu EGM-2 contenant FBS et d’autres suppléments.
   2. Cultiver les cellules HUVEC pour 48 h dans le milieu de base EBM-2 exempt de suppléments supplémentaires.
   3. Prélever le support des flacons et effectuer l’étape de centrifugation comme indiqué ci-dessus (étape 1,3). En général, utilisez 100 mL de milieu pour une isolation EV.

2. ultracentrifugation de CCM

1. Immédiatement avant l’ultracentrifugation (UC), Centrifugez le CCM pendant 15 min à 3 000 x g et 4 ° c pour éliminer les débris cellulaires et les grands agglomérats.
2. Transférez délicatement le surnageant aux tubes UC. Si vous utilisez un rotor à angle fixe, marquez l’orientation des tubes dans la centrifugeuse pour faciliter la récupération du pellet EV après l’UC. Centrifuger pendant 2 h à 120 000 x g, avec un facteur k de 259,4.
3. Après UC, jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’un pipetage sérologique, pour éviter la perturbation des EVs pelletés.
   Remarque: le culot peut être invisible.
4. Ajouter 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) filtrée à 0,2 μm dans le premier tube et utiliser le PBS et le surnageant résiduel pour Resuspendre le culot en pipetant de haut en bas. Transférer la suspension EV résultante au tube suivant de l’échantillon respectif et l’utiliser pour la remise en suspension. Procédez de cette façon pour resuspendre tous les véhicules électriques de l’échantillon dans un volume final d’environ 300-350 μL.
5. Après la remise en suspension, confirmer la présence de particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Utilisez les paramètres optimisés pour le type EV donné, tels que les paramètres ci-dessous (étape 2.5.1).
   NOTE: les documents de Gardiner et coll.²⁷ et vestad et al.²⁸ contiennent des informations précieuses sur la façon d’optimiser les paramètres de mesure des véhicules électriques.
   1. Pour reproduire les résultats décrits ci-dessous, utilisez des instruments (par exemple, NanoSight LM14) équipés d’un laser vert. Enregistrez trois vidéos de 30 s avec un gain d’écran de 1,0 et un niveau de caméra de 13. Pour l’analyse, utilisez un gain d’écran de 1,0 et un seuil de détection de 5.
6. Utilisez le pellet immédiatement, si possible; Sinon, rangez-le à 4 ° c pendant la nuit.

3. encapsulation de glucuronidase en EVs

1. À la granule resuspendue, ajouter la bêta-glucuronidase (10 mg/mL dans le PBS) à une concentration finale de 1,5 mg/mL et de saponine (10 mg/mL en H₂O) à une concentration finale de 0,1 mg/ml. Mélangez bien par vortex pour 3 s.
2. Incuber pendant 10 min à température ambiante avec un mélange interadmis en faisant doucement clignoter le tube. Après incubation, purifier directement par chromatographie d’exclusion de la taille (SEC) (voir rubrique 5).
   Remarque: ne pas recongeler les échantillons de glucuronidase une fois décongelés, afin de prévenir la dégradation des enzymes due au gel.

4. production de liposomes

1. Pour préparer des liposomes pour comparaison avec EVs, dissoudre la 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) et la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC) dans une ration molaire 2:3 dans le chloroforme jusqu’à une concentration finale de 5 mm. Préparer des aliquotes de 1 mL dans des flacons de chromatographie liquide haute performance (HPLC) et les laisser sécher pendant la nuit pour former un film lipidique.
   ATTENTION: le chloroforme est toxique et soupçonné d’être cancéreux. Prenez les précautions appropriées lors de la manipulation.
2. Réhydrater le film lipidique avec 1 mL de PBS contenant 1,5 mg/mL de glucuronidase. Chauffer à 42 ° c et faire tourbillonner pendant 1 min. chauffer l’ensemble de l’extrudeuse à 42 ° c et extrudeuse la suspension lipidique 11x à travers une membrane en polycarbonate de 200 nm. Purifier directement par SEC (voir rubrique 5).

5. purification par SEC

1. Préparez la colonne SEC à l’aide du protocole suivant.
   1. N’utilisez que de l’eau fraîche purifiée et des tampons fraîchement préparés. Filtrer tous les tampons à travers un filtre à membrane de 0,2 μm et les dégazer pour empêcher la formation de bulles d’air dans la colonne.
   2. Pour la préparation d’une colonne SEC, utiliser la matrice de filtration à base de gel d’d’agarose (par exemple, Sepharose CL-2b) ou un autre milieu SEC approprié pour séparer les EVs et les liposomes des impuretés protéiques et de l’excès d’enzyme. Tout d’abord, retirez la solution de 20% EtOH le milieu est stocké dans, pour empêcher la formation de bulles d’air dans la colonne. À cette fin, Centrifugez le milieu SEC à 3 000 x g pendant 10 min, enlevez l’EtOH et remplacez-le par de l’eau dégazée.
   3. Remplissez une colonne de verre (avec un diamètre intérieur de 10 mm) avec le milieu SEC à la marque de 15 mL.
      Remarque: les volumes diffèrent pour les colonnes de dimensions différentes. Assurez-vous de laisser le gel s’arranger complètement.
   4. Avant une course, Equilibrer la colonne avec au moins deux volumes de colonne de PBS. Pour stocker la colonne, lavez-la d’abord avec une colonne de volume d’eau, suivie d’au moins deux volumes de colonne de 20% EtOH. Après le stockage, laver la colonne d’abord avec un volume d’eau de colonne avant d’équilibrer avec PBS.
   5. Utiliser jusqu’à 400 μL de suspension EV ou Liposome en une seule séparation. Prélever des fractions de 1 mL. Après la SEC, stockez les EVs purifiés (voir rubrique 7) ou les soumettre à un dosage de glucuronidase (voir rubrique 6).
2. Confirmer la séparation des EVs et des liposomes des protéines contaminantes et de la glucuronidase libre. À cette fin, corréler les concentrations de particules des fractions recueillies avec la concentration protéique et l’activité de la glucuronidase.
   1. Evaluer la concentration de particules par NTA (voir 2,5)
   2. Évaluez la teneur en protéines par dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) ou un autre dosage approprié de quantification des protéines. Effectuer le dosage selon le protocole du fabricant.
   3. Évaluer l’activité de la glucuronidase par dosage de la glucuronidase (voir rubrique 6).
3. Si vous le souhaitez, évaluez la morphologie des EV par microscopie électronique à transmission (TEM) et microscopie électronique à balayage (SEM).
   1. Pour la préparation des échantillons TEM, ajouter 10 μL de suspension EV à une grille TEM, incuber pendant 10 min, puis éponger tout excès de liquide à l’aide d’un papier filtre. Effectuer la fixation pendant 10 min avec 10 μL de 4% de paraformaldéhyde et éponger tout excès. Laver 3x avec de l’eau. Tacher les vésicules par 20 s d’incubation avec 30 μL d’hydrate d’acide Phosphor-tungstique à 1%. Après avoir effacé l’excès, sécher les vésicules pendant la nuit. Visualisez par TEM.
      ATTENTION: l’acide phospho-tungstique est très caustique; ainsi, protéger la peau et les yeux.
   2. Pour le SEM, fixez les échantillons TEM préalablement préparés sur des disques de carbone et pulvérisez-les avec une couche d’or épaisse de 50 nm. Visualisez par SEM.

6. dosage de la glucuronidase

1. Pour permettre une comparaison entre les différents échantillons et les conditions de stockage par corrélation entre le nombre de particules et l’activité enzymatique, mesurez d’abord la concentration particulaire de l’échantillon par NTA (Voir l’étape 2,5).
2. Préparer une solution de travail de la fluorescéine di-β-D-glucuronide en ajoutant 1 μL du composé (10 mg/mL en H₂O) à 199 ΜL de PBS. Ajouter 25 μL de cette solution à 125 μL d’EVs purifiés pour obtenir une concentration finale de 8,3 μg/mL. Pipetonner l’échantillon dans une plaque noire 96-well. Mesurer le point de temps 0 h avec un lecteur de plaque, en utilisant 480 nm comme excitation et 516 nm comme longueur d’onde d’émission.
3. Recouvrir fermement la plaque (par exemple, avec une feuille de plastique transparente utilisée pour les plaques PCR) pour minimiser l’évaporation et incuber dans l’obscurité pendant 18 h à 37 ° c. Mesurez la production de fluorescéine à l’aide des paramètres du lecteur de plaque énumérés à l’étape 6,2.

7. stockage des EVs et des liposomes

Remarque: pour tous les besoins de stockage, il est conseillé d’utiliser des tubes à faible liaison pour réduire la perte de EV due à l’adsorption.

1. Suivez les paramètres de cette section pour reproduire les résultats représentatifs donnés ci-dessous. Utiliser des échantillons constitués de 400 μL de suspension EV.
   1. Conserver à 4 ° c ou-80 ° c ou passer aux étapes énumérées ci-dessous.
   2. Lyophiliser les véhicules électriques.
      1. Ajouter le tréhalose (40 mg/mL en H₂O) jusqu’à une concentration finale de 4 mg/ml pour les EVS purifiés. Congeler les échantillons à-80 ° c pendant au moins 1 h.
      2. Lyophiliser les échantillons en utilisant les paramètres suivants. Pour le séchage principal, réglez la température de l’étagère à 15 ° c et la pression à 0,180 mbar et laissez les échantillons sécher pendant 46 h. Pour le séchage final, régler la température de l’étagère à 25 ° c et la pression à 0,0035 mbar et laisser les échantillons sécher pendant 2 h. conserver les échantillons lyophilisés à 4 ° c.
      3. Pour réhydrater les échantillons, ajouter H₂O, égal à la quantité de suspension ev présente au début (typiquement, 400 μl). Ne pas utiliser de tampon pour la réhydratation.

8. analyse après stockage

1. Pour évaluer l’activité enzymatique, retirez d’abord la glucuronidase libre, qui peut avoir fui les EVs pendant le stockage. Réaliser ceci par une étape supplémentaire de purification qui est effectuée soit par SEC (voir étape 5) ou par fractionnement de flux de champ asymétrique (AF4) (Voir l’étape 8.1.2).
   Remarque: Veuillez noter que les deux méthodes conduisent à une dilution de l’échantillon EV; ainsi, utiliser suffisamment de concentrations EV avant le stockage pour éviter de se déplacer en deçà de la limite de quantification NTA. Attendez-vous à une dilution 1:10 des particules en raison de SEC ou AF4.
   1. Pour la purification SEC, suivre le protocole décrit ci-dessus (voir section 5).
   2. Effectuer la purification AF4.
      1. Installer l’instrument à l’aide d’un petit canal avec une entretoise de 350 μm et une membrane de cellulose de 30 kD à coupure de poids moléculaire. Placez un filtre de taille de pores de 0,1 μm entre la pompe HPLC et le canal AF4. Utilisez du PBS filtré à 0,1 μM fraîchement préparé comme phase mobile pour réduire la charge de particules et le bruit dans les détecteurs de diffusion de la lumière.
      2. Détectez les protéines à l’aide d’un détecteur UV réglé sur 280 nm. Pour détecter les particules, utilisez la diffusion de la lumière multiangulaire avec le laser réglé à 658 nm.
      3. Utilisez la méthode d’exécution suivante. Pré-Focus pendant 1 min avec un flux de mise au point de 1 mL/min; Ensuite, injecter 300 μL de l’échantillon à un taux de 0,2 mL/min et maintenir le flux de mise au point pendant 10 min. Après l’injection, éluer l’échantillon à 1 ml/min pendant l’application d’un flux croisé qui diminue de 2 ml/min à 0,1 ml/min au cours de 8 min. éluer pour une autre 10 min sans écoulement croisé. Prélever des fractions de 1 mL, en commençant après 12,5 min et en continuant jusqu’à 27 min.
   3. Effectuer le dosage de la glucuronidase comme décrit ci-dessus (voir rubrique 6).
2. Pour évaluer la taille et la concentration, utilisez le NTA comme décrit ci-dessus (Voir l’étape 2,5).
3. Éventuellement, exécutez TEM et SEM pour évaluer la morphologie des EVs après le stockage (voir 5,3).

Résultats

La figure 1 affiche les caractéristiques de stockage des véhicules électriques isolés des HUVECs. Les EVs ont été isolés par UC, la glucuronidase a été encapsulée et après la SEC, les EVs purifiées ont été évaluées pour leurs propriétés physicochimiques par NTA. Un échantillon des vésicules a ensuite été soumis à la purification AF4 et l’activité de la glucuronidase a été mesurée.

Les vésicules ont ensuite été entreposées pour 7 d à 4 ° c ou-...

Discussion

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet pour étudier la stabilité des véhicules électriques dans des conditions de stockage différentes. Avec la combinaison de glucuronidase encapsulée comme lecture fonctionnelle et l’évaluation des paramètres physicochimiques des EVs, le protocole permet une évaluation simple de la stabilité du stockage des véhicules électriques et la comparaison des EVs de différentes cellules Lignes. SEM et TEM en tant que méthodes complémentaires permettent un aperç...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks	Corning	431082	Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane	Wyatt Technology Europe	1854
350 µm spacer	Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Chloroform	Fisher scientific	C/4966/17
Column oven	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector	Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm	Merck	VVLP04700	Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162	Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers	R&D Systems	DY992	used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol	Fisher scientific	E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC	Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR international	525-0255	the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser	Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes	Whatman/GE Healthcare	110406	used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder	Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate	Sigma-Aldrich	79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Assay Kit	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM copper grids with carbon film	Plano	S160-4
Small AF4 channel	Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES	Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
UV detector	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter	Whatman/GE Healthcare	10401712	Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC