Valutazione della stabilità di conservazione delle vescicole extracellulari

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo prontamente applicabile per valutare la stabilità di stoccaggio delle vescicole extracellulari, un gruppo di nanoparticelle naturali prodotte dalle cellule. Le vescicole sono caricate con glucuronidasi come un enzima modello e immagazzinate in condizioni diverse. Dopo la conservazione, vengono valutati i loro parametri fisico-chimici e l'attività dell'enzima incapsulato.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono obiettivi promettenti nella ricerca corrente, da utilizzare come farmaci, portatori di droghe e biomarcatori. Per il loro sviluppo clinico, non solo la loro attività farmaceutica è importante, ma anche la loro produzione deve essere valutata. In questo contesto, la ricerca si concentra sull'isolamento degli EV, sulla loro caratterizzazione e sulla loro conservazione. Il presente manoscritto mira a fornire una facile procedura per la valutazione dell'effetto delle diverse condizioni di conservazione sugli EV, senza manipolazione genetica o saggi funzionali specifici. In questo modo è possibile ottenere rapidamente una prima impressione della stabilità dei veicoli elettrici in una determinata condizione di conservazione e i veicoli elettrici derivati da diverse fonti cellulari possono essere confrontati facilmente. La misurazione della stabilità si basa sui parametri fisico-chimici degli EV (dimensioni, concentrazione delle particelle e morfologia) e sulla conservazione dell'attività del loro carico. Quest'ultimo è valutato dall'incapsulamento mediato da saponina dell'enzima beta-glucuronidasi nel svi. La glucuronidasi agisce come surrogato e consente una facile quantificazione attraverso la scissione di una molecola reporter fluorescente. Il presente protocollo potrebbe essere uno strumento per i ricercatori nella ricerca di condizioni di conservazione che conservino in modo ottimale le proprietà EV per far avanzare la ricerca EV verso l'applicazione clinica.

Introduzione

Gli EV sono nanoparticelle legate a membrana prodotte da quasi tutti i tipi di cellule. Per le cellule di mammifero, i veicoli elettrici possono essere suddivisi in due gruppi principali con percorsi di produzione distinti^1,2. Le vescicole di membrana, con una gamma di dimensioni da circa 100-1000 Nm, sono prodotte da erba diretta dalla membrana cellulare. Gli esosomi, di dimensioni 30-200 Nm, derivano da corpi multivesicolari formati dall'interno in erba in endosomi che successivamente si fondono con la membrana cellulare per rilasciare più esosomi contemporaneamente. La funzione principale di queste vescicole è il trasporto di informazioni tra le cellule³. A questo scopo, i carichi come RNA, DNA e proteine sono attivamente ordinati in loro. I veicoli elettrici possono trasmettere una varietà di effetti sui loro bersagli, con implicazioni sia per la salute che per lo stato di malattia. Da un lato, essi mediano effetti positivi come la rigenerazione dei tessuti, presentazione di antigene, o effetti antibiotici, che li rende obiettivi propizi per il loro sviluppo come Therapeutics^4,5. Dall'altro lato, gli EV possono promuovere la vascolarizzazione tumorale⁶, indurre gli effetti spettatore nelle risposte di stress⁷, e potrebbe svolgere un ruolo nelle malattie autoimmuni⁸ e malattie infiammatorie⁹. Così, potrebbero essere un componente chiave per una migliore comprensione di molti effetti patologici. Tuttavia, la presenza di EV alterati in molteplici malattie, come il cancro^10,11,12 e disturbi cardiovascolari¹³, e la loro facile accessibilità nel sangue e nelle urine li rende ideali Biomarcatori. Infine, la loro buona biocompatibilità¹⁴ e la loro intrinseca capacità di targeting rendono gli EVS anche interessanti per la consegna di farmaci¹⁵. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per la valutazione della stabilità di stoccaggio dei veicoli elettrici derivati da cellule di mammiferi, una proprietà importante che è ancora poco indagata.

Per lo sviluppo clinico di EV, ci sono ancora molti ostacoli per superare¹⁶, tra cui la valutazione dei loro effetti terapeutici, produzione, purificazione, e stoccaggio¹⁷. Mentre-80 ° c è ampiamente visto come il gold standard per lo stoccaggio di EV¹⁸, i congelatori necessari sono costosi, e mantenere la catena di freddo necessaria dalla produzione al paziente può essere impegnativo. Inoltre, alcune segnalazioni indicano che la conservazione a-80 ° c non conserva in modo ottimale le SVE e induce una perdita della funzionalità EV^19,20. Altri metodi, come la liofilizzazione^21,22 o l'essiccazione a spruzzo²³, sono stati proposti come potenziali alternative alla conservazione congelata di EVS.

Il modo ottimale per valutare la stabilità dello stoccaggio sarebbe quello di testare i veicoli elettrici in saggi funzionali o la valutazione di un marcatore specifico, ad esempio, la loro attività antibatterica¹⁹. Questo è possibile quando l'effetto desiderato delle vescicole è noto e quando un gruppo distinto di EV deve essere studiato. Se i veicoli elettrici provenienti da diverse fonti cellulari devono essere confrontati (ad esempio, per l'incapsulamento dei farmaci) o se non esiste una lettura funzionale nota, non è più possibile valutare le modifiche dovute allo stoccaggio in modo diretto.

D'altra parte, semplicemente valutando i cambiamenti nei loro parametri fisico-chimici, come la dimensione, il recupero delle particelle, e la concentrazione proteica, non sempre prevedere i cambiamenti nell'attività EV, come è stato dimostrato in un recente brevetto²⁰.

Qui, forniamo un protocollo prontamente applicabile per misurare la stabilità di stoccaggio dei veicoli elettrici valutando i loro parametri fisico-chimici combinati con l'attività di un enzima beta-glucuronidasi incapsulato come surrogato per il carico dei veicoli elettrici. Il carico dell'enzima è fatto da incubazione di saponina, un metodo delicato stabilito con EVS da diverse fonti^21,24,25. La saponina forma i pori transitori nella membrana EV, che consente l'assorbimento enzimatico nella vescicola. Poiché gli enzimi sono inclini a perdere la loro attività se sottoposti a condizioni di conservazione sfavorevoli, sono un surrogato ideale per la valutazione della conservazione dei carichi funzionali dei veicoli elettrici.

Abbiamo dimostrato che l'applicazione di questo protocollo agli EVs derivati da cellule staminali mesenchimali umane (MSC), cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) e cellule epiteliali alveolari dell'adenocarcinoma umano (A549) si traducono in grandi differenze nel stabilità di stoccaggio tra le diverse linee cellulari, che dovrebbe essere presa in considerazione quando si sceglie la sorgente EV²¹.

Protocollo

1. coltura cellulare e produzione di supporti cellulari condizionati

1. In genere, coltivare le cellule nelle condizioni individuali necessarie per la rispettiva linea cellulare.
2. Coltivare le cellule per 24-72 h in condizioni prive di siero o in media contenenti siero bovino fetale impoverito EV (FBS).
   Nota: se si utilizza FBS EV-impoverito, impiegare un metodo provato a esaurire efficacemente il siero, per prevenire la contaminazione con i bovini derivati da siero bovino²⁶.
3. Raccogli il supporto dalle palloni. Centrifugare a 300 x g per 10 min per pellet le cellule. Raccogliere con cautela il fluido cellulare condizionato (CCM), senza disturbare le cellule pellettate. Preferibilmente, utilizzare direttamente la CCM o conservarla durante la notte a 4 ° c.
   Nota: è sempre preferibile utilizzare CCM appena prodotto. Se la conservazione per periodi di tempo più lunghi non può essere aggirata, tutti i parametri pertinenti devono essere registrati in conformità alle linee guida MISEV2018²⁶e i potenziali pregiudizi dei risultati acquisiti devono essere presi in considerazione.
4. Protocollo di esempio per HUVECs
   1. Coltivare le cellule HUVEC per 120 h nel mezzo EGM-2 contenente FBS e altri supplementi.
   2. Coltivare le cellule HUVEC per 48 h in medio basale EBM-2 privo di eventuali supplementi aggiuntivi.
   3. Raccogliere il supporto dalle palloni ed eseguire la fase di centrifugazione come sopra indicato (passo 1,3). In genere, utilizzare 100 mL di mezzo per un isolamento EV.

2. ultracentrifugazione della CCM

1. Immediatamente prima dell'ultracentrifugazione (UC), centrifugare la CCM per 15 minuti a 3.000 x g e 4 ° c per rimuovere i detriti cellulari e i grandi agglomerati.
2. Trasferire con cautela il supernatante ai tubi UC. Se si utilizza un rotore ad angolo fisso, contrassegnare l'orientamento dei tubi nella centrifuga per facilitare il recupero del pellet EV dopo l'UC. Centrifugare per 2 h a 120.000 x g, con un fattore k di 259,4.
3. Dopo UC, eliminare con cautela il supernatante utilizzando un Pipet sierologico, per evitare il disturbo dei EV pellettati.
   Nota: il pellet potrebbe essere invisibile.
4. Aggiungere 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato di 0,2 μm (PBS) al primo tubo e utilizzare PBS e il surnatante residuo per risospendere il pellet pipettando su e giù. Trasferire la sospensione EV risultante al tubo successivo del rispettivo campione e utilizzarlo per la risospensione. Procedere in questo modo per risospendere tutte le EVs del campione in un volume finale di circa 300-350 μL.
5. Dopo la risospensione, confermare la presenza di particelle mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Utilizzare le impostazioni ottimizzate per il tipo di EV specificato, ad esempio le impostazioni riportate di seguito (passaggio 2.5.1).
   Nota: le carte di Gardiner et al.²⁷ e vestad et al.²⁸ contengono preziose informazioni su come ottimizzare i parametri per la misurazione degli svi.
   1. Per riprodurre i risultati descritti di seguito, utilizzare strumenti (ad esempio, NanoSight LM14) dotati di un laser verde. Registra tre video di 30 s con un guadagno dello schermo di 1,0 e un livello di fotocamera di 13. Per l'analisi, utilizzare un guadagno dello schermo di 1,0 e una soglia di rilevamento di 5.
6. Utilizzare il pellet immediatamente, se possibile; in caso contrario, conservarlo a 4 ° c durante la notte.

3. incapsulamento della glucuronidasi in EVs

1. Al pellet risospeso, aggiungere la beta-glucuronidasi (10 mg/mL in PBS) ad una concentrazione finale di 1,5 mg/mL e saponina (10 mg/mL in H₂O) a una concentrazione finale di 0,1 mg/ml. Mescolare bene con vortex per 3 s.
2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con miscelazione intermitted agitando delicatamente il tubo. Dopo l'incubazione, purificare direttamente per cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) (vedere paragrafo 5).
   Nota: non ricongelare i campioni di glucuronidasi una volta scongelati, per prevenire la degradazione enzimatica a causa del congelamento.

4. produzione di liposoma

1. Per preparare i liposomi per il confronto con EVs, sciogliere 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-foshocholine (DMPC) e 1,2-dipalmitoyl-sn-glicerolo-3-FOSHOCHOLINE (DPPC) in una razione molare 2:3 in cloroformio a una concentrazione finale di 5 mm. Preparare le aliquote da 1 mL nei flaconcini di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e lasciarle asciugare durante la notte per formare un film lipidico.
   Attenzione: il cloroformio è tossico e sospettato di essere cancerogeno. Prendere le dovute precauzioni durante la manipolazione.
2. Reidratare il film lipidico con 1 mL di PBS contenente 1,5 mg/mL di glucuronidasi. Riscaldalo a 42 ° c e vortice per 1 min. riscaldare il gruppo estrusore a 42 ° c ed estungere la sospensione lipidica 11x attraverso una membrana in policarbonato 200 Nm. Purificare direttamente da SEC (vedere paragrafo 5).

5. purificazione per SEC

1. Preparare la colonna SEC utilizzando il seguente protocollo.
   1. Utilizzare solo acqua depurata fresca e tamponi appena preparati. Filtrare tutti i buffer attraverso un filtro a membrana 0,2 μm e Degas per evitare la formazione di bolle d'aria nella colonna.
   2. Per la preparazione di una colonna SEC, utilizzare una matrice a base di filtrazione in gel di agarosio (ad es. Sepharose CL-2B) o un altro mezzo SEC idoneo a separare gli EV e i liposomi dalle impurità proteiche e dall'enzima in eccesso. In primo luogo, rimuovere la soluzione di EtOH 20% il mezzo è memorizzato in, per evitare la formazione di bolle d'aria nella colonna. A tal fine, centrifugare il mezzo SEC a 3.000 x g per 10 min, togliere l'ETOH e sostituirlo con acqua degassata.
   3. Riempire una colonna di vetro (con un diametro interno di 10 mm) con il SEC medio al segno 15 mL.
      Nota: i volumi saranno diversi per le colonne con dimensioni diverse. Assicuratevi di lasciare che il gel si deposita completamente.
   4. Prima di una corsa, equilibrare la colonna con almeno due volumi di colonna di PBS. Per memorizzare la colonna, prima lavarla con un volume di colonna di acqua, seguita da almeno due volumi di colonna del 20% EtOH. Dopo lo stoccaggio, lavare la colonna prima con un volume di colonna di acqua prima di equilibrare con PBS.
   5. Utilizzare fino a 400 μL di sospensione EV o liposoma in una sola separazione. Raccogli frazioni da 1 mL. Dopo la SEC, conservare i EV purificati (vedere paragrafo 7) o sottoporre a un saggio glucuronidasi (vedere paragrafo 6).
2. Confermare la separazione di EVs e liposomi dalle proteine contaminanti e dalla glucuronidasi libera. A tal fine, correlare le concentrazioni di particelle delle frazioni raccolte con la concentrazione proteica e l'attività glucuronidasi.
   1. Valutare la concentrazione di particelle mediante NTA (vedere 2,5)
   2. Valutare il contenuto proteico con un saggio di acido bicinchoninico (BCA) o un altro saggio di quantificazione delle proteine appropriato. Eseguire il test secondo il protocollo del produttore.
   3. Valutare l'attività della glucuronidasi mediante il saggio glucuronidasi (vedere paragrafo 6).
3. Facoltativamente, valutare la morfologia EV mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e microscopia elettronica a scansione (SEM).
   1. Per la preparazione dei campioni TEM, aggiungere 10 μL di sospensione EV a una griglia TEM, incubare per 10 minuti, quindi asciugare il liquido in eccesso utilizzando una carta filtrante. Eseguire la fissazione per 10 min con 10 μL di 4% paraformaldeide e cancellare qualsiasi eccesso. Lavare 3x con acqua. Macchia le vescicole di incubazione 20 s con 30 μL di acido fosforoso-tungstico 1% idrato. Dopo aver blotting via l'eccesso, asciugare le vescicole durante la notte. Visualizza per TEM.
      Attenzione: l'acido FoSho-tungstico è altamente caustico; quindi, proteggere la pelle e gli occhi.
   2. Per SEM, fissare i campioni TEM precedentemente preparati su dischi di carbonio e polverizzazione catodica con uno strato di oro di spessore 50 Nm. Visualizza di SEM.

6. dosaggio di glucuronidasi

1. Per consentire un confronto tra i diversi campioni e le condizioni di conservazione correlando il numero di particelle e l'attività enzimatica, misurare prima la concentrazione di particelle del campione per NTA (vedere il passo 2,5).
2. Preparare una soluzione funzionante di fluoresceina di-β-D-glucuronide aggiungendo 1 μL di composto (10 mg/mL in H₂O) a 199 ΜL di PBS. Aggiungere 25 μL di questa soluzione a 125 μL di EVs purificati per ottenere una concentrazione finale di 8,3 μg/mL. Pipet il campione in una piastra nera 96-pozzetto. Misurare il punto di tempo 0 h con un lettore di piastre, utilizzando 480 nm come eccitazione e 516 nm come lunghezza d'onda di emissione.
3. Coprire saldamente la piastra (ad es. con pellicola di plastica trasparente utilizzata per le piastre PCR) per minimizzare l'evaporazione e incubare al buio per 18 ore a 37 ° c. Misurare la produzione di fluoresceina utilizzando i parametri del lettore di piastre elencati al punto 6,2.

7. conservazione di EVs e liposomi

Nota: per tutti gli scopi di stoccaggio, è consigliabile utilizzare tubi a bassa legatura per ridurre la perdita di EV dovuta all'adsorbimento.

1. Seguire i parametri in questa sezione per riprodurre i risultati rappresentativi riportati di seguito. Utilizzare campioni costituiti da 400 μL di sospensione EV.
   1. Conservare a 4 ° c o-80 ° c o procedere ai passaggi elencati di seguito.
   2. Lyophilize gli EVs.
      1. Aggiungere trealosio (40 mg/mL in H₂O) fino ad una concentrazione finale di 4 mg/ml per i EV purificati. Congelare i campioni a-80 ° c per almeno 1 ora.
      2. Lyophilize i campioni utilizzando i seguenti parametri. Per l'essiccazione principale, impostare la temperatura del ripiano a 15 ° c e la pressione a 0,180 mbar e lasciare asciugare i campioni per 46 h. Per l'essiccazione finale, impostare la temperatura del ripiano a 25 ° c e la pressione a 0,0035 mbar e lasciare asciugare i campioni per 2 h. conservare i campioni liofilizzati a 4 ° c.
      3. Per reidratare i campioni, aggiungere H₂O, uguale alla quantità di sospensione EV presente all'inizio (tipicamente, 400 μl). Non utilizzare alcun tampone per la reidratazione.

8. analisi dopo lo stoccaggio

1. Per valutare l'attività enzimatica, rimuovere prima la glucuronidasi libera, che può essere trapelato dagli EV durante lo stoccaggio. Raggiungere questo scopo con un ulteriore passaggio di purificazione che viene effettuato sia da SEC (vedere passo 5) o flusso asimmetrico campo-flusso frazione (AF4) (vedere passo 8.1.2).
   Nota: si prega di notare che entrambi i metodi portano ad una diluizione del campione EV; quindi, utilizzare concentrazioni EV sufficienti prima dello stoccaggio per evitare di muoversi al di sotto del limite di quantificazione NTA. Aspettatevi una diluizione 1:10 delle particelle dovute a SEC o AF4.
   1. Per la purificazione SEC, seguire il protocollo sopra descritto (vedere paragrafo 5).
   2. Eseguire la purificazione AF4.
      1. Impostare lo strumento utilizzando un piccolo canale con un distanziatore 350 μm e una membrana di cellulosa cut-off di peso molecolare 30 kD. Collocare un filtro di dimensione pori 0,1 μm tra la pompa HPLC e il canale AF4. Utilizzare PBS appena preparato 0,1 μm-filtrato come la fase mobile per ridurre il carico di particelle e il rumore nei rivelatori luce-dispersione.
      2. Rilevare le proteine utilizzando un rilevatore UV impostato a 280 Nm. Per rilevare le particelle, utilizzare la dispersione della luce multiangolare con il laser impostato a 658 nm.
      3. Utilizzare il seguente metodo di esecuzione. Pre-messa a fuoco per 1 min con un flusso di messa a fuoco di 1 mL/min; quindi, iniettare 300 μL del campione ad una velocità di 0,2 mL/min e mantenere il flusso di messa a fuoco per 10 min. Dopo l'iniezione, eluire il campione a 1 ml/min durante l'applicazione di un flusso trasversale che diminuisce da 2 ml/min a 0,1 ml/min nel corso di 8 min. eluire per altri 10 min senza flusso incrociato. Raccogliere frazioni di 1 mL, iniziando dopo 12,5 minuti e continuando fino a 27 min.
   3. Eseguire il saggio glucuronidasi come descritto sopra (vedere paragrafo 6).
2. Per valutare le dimensioni e la concentrazione, utilizzare l'NTA come descritto sopra (vedere il passo 2,5).
3. Facoltativamente, eseguire TEM e SEM per valutare la morfologia degli EV dopo lo stoccaggio (vedere 5,3).

Risultati

Nella Figura 1 sono visualizzate le caratteristiche di memorizzazione degli EVS isolate da HUVECs. Gli EV sono stati isolati da UC, la glucuronidasi è stata incapsulata e, dopo la SEC, le EVs purificate sono state valutate per le loro proprietà fisico-chimiche da parte della NTA. Un campione delle vescicole è stato successivamente sottoposto a purificazione AF4 e l'attività glucuronidasi è stata misurata.

Le vescicole sono state poi conservate per 7 d a 4 ° c o-80 ° c e...

Discussione

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo per studiare la stabilità dei veicoli elettrici in diverse condizioni di conservazione. Con la combinazione di glucuronidasi incapsulata come lettura funzionale e la valutazione dei parametri fisico-chimici degli EV, il protocollo consente una semplice valutazione della stabilità dello stoccaggio dei veicoli elettrici e il confronto di EVs da diverse cellule Linee. SEM e TEM come metodi complementari consentono una panoramica dei cambiamenti dei veicoli elettric...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks	Corning	431082	Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane	Wyatt Technology Europe	1854
350 µm spacer	Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Chloroform	Fisher scientific	C/4966/17
Column oven	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector	Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm	Merck	VVLP04700	Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162	Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers	R&D Systems	DY992	used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol	Fisher scientific	E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC	Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR international	525-0255	the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser	Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes	Whatman/GE Healthcare	110406	used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder	Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate	Sigma-Aldrich	79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Assay Kit	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM copper grids with carbon film	Plano	S160-4
Small AF4 channel	Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES	Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
UV detector	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter	Whatman/GE Healthcare	10401712	Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC