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요약

여기서 우리는 세포 밖 소포체의 저장 안정성을 평가 하기 위해 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제시 하 고, 세포내에서 생성 되는 자연적으로 발생 하는 나노 입자의 그룹 이다. 소포는 모형 효소로 니드로 적재 되 고 다른 조건 하에서 저장 됩니다. 저장 후,이의 물리 화학적 매개 변수와 캡슐화 된 효소의 활성이 평가 됩니다.

초록

세포 밖 소포 (EVs)는 약물, 약물 운반체 및 바이오 마커로 서 사용 되는 현재 연구에서 유망한 표적 이다. 그들의 임상 발달을 위해, 그들의 약 제 활동은 중요 합니다 뿐만 아니라 그들의 생산은 평가 될 필요가 있습니다. 이 맥락에서 연구는 EVs, 특성 및 저장소의 격리에 중점을 둡니다. 본 원고는 유전 조작 또는 특정 기능 분석 없이 EVs에 대 한 다양 한 저장 조건의 효과를 평가 하기 위한 간편한 절차를 제공 하는 것을 목표로 합니다. 이를 통해 주어진 보관 조건 하에서 EVs의 안정성에 대 한 첫 인상을 신속 하 게 얻을 수 있으며, 다른 셀 소스에서 추출한 EVs는 쉽게 비교 가능 합니다. 안정성 측정은 EVs의 물리 화학적 매개 변수 (크기, 입자 농도 및 형태) 및 화물의 활동 보존에 기반 합니다. 후자는 베타-니드 효소의 사포닌 매개 캡슐화에 의해 Ev로 평가 된다. 니드는 대리로 서 작용 하 고 형광 성 리포터 분자의 절단을 통해 쉬운 정량화를 허용 합니다. 본 프로토콜은 임상 적용에 대 한 EV 연구를 진행 하기 위해 EV 특성을 최적으로 유지 하는 저장 조건 검색에서 연구자를 위한 도구가 될 수 있습니다.

서문

EVs는 거의 모든 세포 유형에 의해 생성 된 멤브레인 결합 나노 입자입니다. 포유류 세포의 경우, EVs는 별개의 생산 경로1,2로 두 개의 주요 그룹으로 세분 될 수 있습니다. 대략 100-1000 nm에서 크기 범위를 가진 막 소포는, 세포 막에서 직접 신진에 의해 생성 됩니다. 크기 30-200 nm의 엑 소 솜은 내 면으로 형성 되 고, 이어서 세포 막과 융합 하 여 여러 개의 엑 소 좀을 한 번에 방출 하는 다발 골 조직 으로부터 유래한 다. 이 소포의 주요 기능은 세포3사이의 정보 전송입니다. 이 목적을 위해, RNA, DNA 및 단백질과 같은 화물는 활발히 그들로 분류 됩니다. EVs는 건강과 질병 상태 모두에 영향을 미치는 다양 한 효과를 대상에 게 전달할 수 있습니다. 한쪽에는 조직 재생, 항 원 제시 또는 항생제 효과와 같은 긍정적 인 효과를 매개 하 여 치료제4,5로 서의 발달에 대 한 길 조 표적을 만듭니다. 다른 측면에서, Ev는 종양 혈관 신생을 촉진할 수있고, 스트레스 반응7에서 바이 스탠 스 효과를 유도 하 고, 자가 면역 질환8 및 염증 성 질환9에서 역할을 할 수도 있다. 따라서, 그들은 많은 병리학 적 효과의 더 나은 이해에 핵심 구성 요소가 될 수 있습니다. 그러나 암10,11,12 및 심혈 관 질환과 같은 매니 폴드 질환에서 변경 된 EVs가 존재하 고 혈액과 소변에서의 손쉬운 접근이 이상적입니다. 바이오 마커. 마지막으로, 그들의 좋은 생체 적합성14 그리고 그들의 내재 된 표적 능력은 ev도 마약 배달에 대 한 흥미로운 만들기15. 이 원고에서, 우리는 포유류 세포 로부터 유래 된 EVs의 저장 안정성을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 하며, 여전히 거의 조사 되지 않는 중요 한 성질 이다.

EVs의 임상 발달을 위해, 그들의 치료 효과, 생산, 정제 및 저장17의 평가를 포함 하 여 극복16에 많은 장애물이 아직도 있습니다. -80 ° c는 EV 저장 장치 (18)의 표준으로 널리 볼 수 있는 반면, 필요한 냉동 고는 비용이 많이 들며, 생산에서 요구 되는 콜드 체인을 환자에 게 유지 하는 것은 쉽지 않은 일입니다. 또한 일부 보고서는-80 ° c에서 스토리지가 EVs를 최적으로 유지 하지 못하고 ev 기능19,20에서 손실을 유발 한다고 표시 합니다. 동결 건조 (21),22 또는 분무 건조 (23)와 같은 다른 방법은 EVs의 냉동 저장에 대 한 잠재적인 대체물로 제안 되었다.

저장 안정성을 평가 하는 최적의 방법은 기능적 분석에서 EVs를 테스트 하거나 특정 마커의 평가 (예를 들어, 항균 활성19)를 검사 하는 것입니다. 이것은 소포에 대 한 원하는 효과가 알려져 있을 때 그리고 하나의 별개의 EVs 그룹이 연구 될 때 가능 합니다. 상이한 세포 공급원 으로부터의 EVs가 비교 될 경우 (예를 들어, 약물 캡슐화) 또는 알려진 기능적 판독 기능이 없는 경우, 저장에의 한 변화를 직접적으로 평가할 수 없게 된다.

한편, 최근 특허20에 나타난 바와 같이, 크기, 입자 회수 및 단백질 농도와 같은 물리 화학적 파라미터의 변화를 평가 하는 것 만으로도 EV 활성의 변화를 항상 예측 하는 것은 아니다.

여기에서, 우리는 EVs의 화물을 위한 대리로 캡슐화 된 베타-니드 효소의 활동과 결합 된 물리 화학적 매개 변수를 평가 함으로써 EVs의 저장 안정성을 측정 하는 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제공 합니다. 효소의 로딩은 상이한 공급원21,24,25로부터의 EVs와 함께 확립 된 온화한 방법으로 사포닌 배양에 의해 이루어진다. 사포닌은 EV 막에 과도 기공을 형성 하 여 소포에 효소 흡수를 허용 합니다. 효소는 불리 한 저장 조건을 복종 하는 경우에 그들의 활동을 분실 하는 경향이 있기 때문에, 그들은 EVs의 기능적인 화물의 보전의 평가를 위한 이상적인 대리입니다.

우리는 인간 간 엽 줄기 세포 (MSCs), 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 및 인간 선 암 폐 포 상피 세포 (A549) 로부터 유도 된 EVs에이 프로토콜을 적용 하는 것이 실제로 큰 차이를 초래 한다는 것을 입증 했습니다 EV 소스 (21)를 선택할 때 고려해 야 할 다른 셀 라인 사이의 저장 안정성.

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프로토콜

1. 세포 배양 및 세포 컨디셔닝 배지 생산

  1. 일반적으로, 각 세포 줄에 필요한 개별적인 조건 하에서 세포를 육성 한다.
  2. 무 혈 청 조건에서 또는 EV-고갈 된 태아 소 혈 청 (FBS)을 포함 하는 매체에서 24-72 h를 위한 세포를 경작 하십시오.
    참고: EV-고갈 된 FBS 사용 되는 경우, 혈 청을 효율적으로 고갈 시키기 위해 입증 된 방법을 채택 하 여 소 세럼 파생 EVs26으로 오염을 방지 하십시오.
  3. 플라스 크에서 배지를 수집 합니다. 원심 분리기를 300 x g 에서 10 분간 세포를 펠 렛 합니다. 모 깎기 된 세포를 방해 하지 않고 셀 컨디셔닝 배지 (CCM)를 조심 스럽게 수집 하십시오. 바람직하게는, CCM을 직접 사용 하거나 4°c에서 밤새 보관 한다.
    참고: 항상 신선 하 게 생산 된 CCM을 사용 하는 것이 좋습니다. 더 긴 기간 동안 스토리지를 우회할 수 없는 경우, 모든 관련 매개 변수는 MISEV2018 가이드라인26에 따라 기록해 야 하며 획득 한 결과의 잠재적 편향이 고려 되어야 합니다.
  4. HUVECs에 대 한 프로토콜 예제
    1. FBS 및 기타 보조 제를 포함 하는 egm-2 배지에 huvec 120 세포 배양.
    2. 추가 보충제를 무료로 EBM-2 기초 배지에서 48 h에 대 한 HUVEC 세포를 육성.
    3. 플라스 크 로부터 배지를 수집 하 고 상기에 나타난 바와 같이 원심 분리 단계를 수행 한다 (단계 1.3). 일반적으로 1 EV-격리에 100 mL의 매체를 사용 합니다.

2. CCM의 초 원심 분리

  1. 초 원심 분리 직전에, 3000 x g 및 4°c에서 15 분 동안 CCM을 원심 분리 하 여 세포 파편과 큰 응집 체를 제거 한다.
  2. 상층 액을 UC 튜브에 조심 스럽게 옮겨 준다. 고정 각도 회전자를 사용 하는 경우, UC 후 EV 펠 릿의 검색을 용이 하 게 하기 위해 원심 분리기에서 튜브의 방향을 표시 합니다. 12만 x g에서 2 시간 동안 원심 분리기로 259.4의 k-팩터를 사용 합니다.
  3. UC를 한 후에, 정 학 피 펫을 사용 하 여 상층 액을 조심 스럽게 버리고, 펠 릿 한 EVs의 교란을 피하십시오.
    참고: 펠 릿이 보이지 않을 수 있습니다.
  4. 추가 200 µ L 0.2의 µm 여과 된 인산 완충 식 염 수 (PBS)를 제 1 튜브에 첨가 하 고 PBS 및 잔류 상층 액을 사용 하 여 피 펫 팅을 통해 펠 렛의 위/아래를 소생 시킵니다. 얻어진 EV 현 탁 액을 각각의 샘플의 다음 튜브로 옮겨 소생에 사용 하십시오. 이 방법을 진행 하 여 샘플의 모든 EVs를 약 300-350 µ L의 최종 볼륨으로 소생 시킵니다.
  5. 소생 후에는 나노 입자 추적 분석 (NTA)에 의해 입자가 존재 하는지 확인 합니다. 아래 설정과 같이 지정 된 EV 유형에 최적화 된 설정을 사용 합니다 (단계 2.5.1).
    참고:가 디너 & 알27 과 베 스타드 외28 의 논문에는 EVs 측정을 위한 매개 변수를 최적화 하는 방법에 대 한 유용한 정보가 들어 있습니다.
    1. 아래에 설명 된 결과를 재현 하려면 녹색 레이저가 장착 된 계측기 (예: NanoSight LM14)를 사용 하십시오. 1.0의 화면 이득 및 카메라 레벨 13의 30 초 동영상 3 개를 녹화 합니다. 분석을 위해 1.0의 화면 이득과 감지 임계값 5를 사용 합니다.
  6. 가능한 경우 즉시 펠 렛을 사용 하십시오. 그렇지 않으면 밤새 4°c에 보관 하십시오.

3. EVs에 캡슐화를 니드

  1. 재현 탁 펠 렛에 니드의 최종 농도로 1.5 mg/ml 및 사포닌 (10mg/ml)을 최종 농도의 0.1 mg/ml에 첨가 하 여 최종적으로 pml/ml을 추가 하였다. 3 초 동안 잘 섞어 줍니다.
  2. Intermitted 혼합 하 여 실 온에서 10 분간 배양 한 후 튜브를 가볍게 쓸으 십시오. 인큐베이션 후에, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 직접 정화 한다 (제 5 항 참조).
    참고: 동결로 인 한 효소 분해를 방지 하기 위해 한 번 해 동 한 후 니드 샘플을 리프레시 하지 마십시오.

4. 리 포 좀 생산

  1. EVs와 비교 하기 위해 리 포 좀을 준비 하려면 2:3에 클로로 폼의 1, 2-dimyristoyl-글 리세 리드 포스 포 콜린) 및 1, 2 dipalmitoylsn-글 리 세로 3 포스 포 콜린 (dmpc)를 용 해 시키고 최종 농도 5mm로 합니다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 바이 알에 1Ml의 분 취 액을 준비 하 고 밤새 건조 시켜 지질 막을 형성 합니다.
    주의: 클로로 포 름은 독성이 있으며 cancerogenic 것으로 의심 됩니다. 취급 시에는 적절 한 주의를 기울여야 합니다.
  2. 1.5 mg/mL 니드를 함유 하는 1 mL의 PBS로 지질 막을 재 수화물. 42 ° c로가 열 하 고 1 분 동안 소용돌이. 압출 기 어셈블리를 42 ° c로가 열 하 고 200 nm 폴 리카 보 네이트 멤브레인을 통해 지질 현 탁 액 11x를 돌출 시킵니다. SEC에 의해 직접 정화 (5 항 참조).

5. SEC에의 한 정화

  1. 다음 프로토콜을 사용 하 여 SEC 열을 준비 합니다.
    1. 신선한 정제 수와 갓 준비 된 완충만을 사용 하십시오. 0.2 µm 멤브레인 필터를 통해 모든 버퍼를 필터링 하 고 열에 기포의 형성을 방지 하기 위해 그들을 탈 가스.
    2. SEC 컬럼의 제조를 위해, 아가 로스 겔 여과 기반 매트릭스 (예: 세파 로즈 Cl-2b) 또는 단백질 불순물과 과잉 효소 로부터 EVs와 리 포 좀을 분리 하기에 적합 한 다른 SEC 배지를 사용 하십시오. 먼저, 배지에 저장 된 20%에 토 에이치 용액을 제거 하 고, 칼럼에서 기포 형성을 방지 한다. 이를 위해, SEC 배지를 10 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 고,에 토를 제거 하 고, 탈 기 된 물로 교체 한다.
    3. 유리 기둥 (내부 지름 10mm)을 SEC 배지와 15ml 마크에 채웁니다.
      참고: 차원이 다른 열에 대해서는 볼륨이 다릅니다. 젤이 완전히 가라앉을 수 있도록 하십시오.
    4. 실행 하기 전에, PBS의 적어도 두 개의 컬럼 볼륨으로 컬럼을 평형 화 합니다. 컬럼을 저장 하려면 먼저 1 개의 컬럼 체적의 물로 세척 한 다음 적어도 두 열 체적의 20%에 토를가 합니다. 저장 후에는 PBS로 equilibrating 전에 1 열 부피의 물을 먼저 세척 하십시오.
    5. 하나의 분리에서 최대 400 µ L의 EV 또는 리 포 좀 현 탁 액을 사용 하십시오. 1 mL의 분 획을 수집 합니다. SEC 이후 정제 된 Ev (섹션 7 참조)를 저장 하거나 니드 분석에 적용 하십시오 (6 항 참조).
  2. EVs와 리 포 좀의 분리가 단백질과 자유 니드을 오염 시키는 것을 확인 합니다. 이를 위해, 수집 된 분 획의 입자 농도와 단백질 농도 및 니드 활성을 상관 한다.
    1. NTA에의 한 입자 농도 평가 (2.5 참조)
    2. 비 인산 (BCA) 분석 법 또는 다른 적합 한 단백질 정량 분석에 의해 단백질 함량을 평가 한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 분석을 수행 합니다.
    3. 니드 분석 법에 의해 니드 활성을 평가 한다 (제 6 항 참조).
  3. 선택적으로, 투과 전자 현미경 (TEM) 및 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 EV 형태학을 평가 한다.
    1. TEM 샘플의 제조를 위해, TEM 그리드에 10 µ L의 EV 현 탁 액을 추가 하 고 10 분 동안 배양 한 다음 여과 지를 사용 하 여 과잉 액체를 털어 냅니다. 10 µ의 4% 파라 포름알데히드를 사용 하 여 10 분 동안 고정을 수행 하 고 초과 하는 것을 닦아 냅니다. 3 배를 물로 씻으십시오. 1% 형광체-텅스텐 산 수화물을 30 µ의 인큐베이션로 소포를 얼룩. 과량으로 블 롯 한 후, 하룻밤 동안 소포를 건조 시키십시오. TEM으로 시각화 합니다.
      주의: 포스 포 텅스텐 산은 높은 부식성; 따라서 피부와 눈을 보호 하십시오.
    2. SEM의 경우, 이전에 준비 된 TEM 샘플을 카본 디스크에 고정 하 고 50 nm 두께의 골드 레이어로 스퍼터 링 합니다. SEM으로 시각화 합니다.

6. 니드 분석

  1. 입자 수와 효소 활성을 상호 연관 시 킴으로써 상이한 샘플 및 저장 조건 간의 비교를 허용 하기 위해, 먼저 NTA에의 한 샘플의 입자 농도를 측정 한다 (2.5 단계 참조).
  2. PBS의 199 µ L에 화합물 10mg/ml)을 1 µ 첨가 하 여 형광 디 β-glucuronide의 작동 용액을 제조 하였다. 125 µ L의 정제 된 EVs에 25 µ L을 추가 하 여 8.3 µ의 최종 농도를 얻습니다. 샘플을 검은색 96 웰 플레이트에 넣습니다. 480 nm를 발광 파장으로 여기 및 516 nm로 사용 하 여 플레이트 리더기로 시간 포인트 0 h를 측정 합니다.
  3. 플레이트를 단단히 덮고 (예: PCR 플레이트에 사용 되는 투명 한 플라스틱 호 일) 37 ° c에서 18 시간 동안 어둠 속에서 증발 및 배양을 최소화 합니다. 6.2 단계에 나열 된 플레이트 리더 파라미터를 사용 하 여 형광 생산을 측정 한다.

7. Ev 및 리 포 좀의 보관

참고: 모든 저장 목적을 위해 저 결합 튜브를 사용 하 여 흡착으로 인 한 EV 손실을 줄이는 것이 좋습니다.

  1. 이 섹션의 매개 변수를 따라 아래에 제공 된 대표적인 결과를 재현 합니다. EV 서 스 펜 션의 400 µ L로 구성 된 샘플을 사용 하십시오.
    1. 4°c 또는-80 ° c에서 보관 하거나 아래 나열 된 단계를 진행 하십시오.
    2. EVs를 동결 건조 합니다.
      1. 정제 된 EVs에 최종 농도 4mg/ml까지trehalose (40)를 첨가 하십시오. 적어도 1 시간 동안-80 ° c에서 샘플을 동결.
      2. 다음 매개 변수를 사용 하 여 샘플을 동결 건조 합니다. 메인 건조의 경우, 선반 온도를 15°c로 설정 하 고 압력을 0.180 mbar로 설정한 후 샘플을 46 h의 건조 상태로 둡니다. 최종 건조의 경우, 선반 온도를 25°c로 설정 하 고 압력을 0.0035 mbar로 설정한 후 샘플을 2 시간 동안 건조 시켜 둡니다. 동결 건조 된 샘플을 4°c에서 보관 한다.
      3. 샘플을 다시 하이드레이션 하려면 시작 부분에있는 EV 서 스 펜 션의 양과 동일 하 게 h2o를 추가 합니다 (일반적으로 400 µ l). 재 수 화를 위해 어떤 완충 제를 사용 하지 마십시오.

8. 저장 후 분석

  1. 효소 활성을 평가 하기 위해, 먼저 저장 중에 EVs에서 유출 되었을 수 있는 무료 니드를 제거 합니다. 이를 위해 SEC에 의해 수행 되는 정제의 추가 단계 (5 단계 참조) 또는 비대칭 유동 장 유동 분별 (AF4 단계 참조)에 의해이를 달성 한다.
    참고: 두 방법 모두 EV 샘플의 희석으로 이어질 수 있음을 알려드립니다. 따라서, NTA 정량 한계 이하로 이동 하는 것을 피하기 위해 저장 전에 충분 한 EV 농도를 사용 한다. SEC 또는 AF4에의 한 입자의 1:10 희석을 기대할 수 있습니다.
    1. SEC 정제의 경우 위에 설명 된 프로토콜을 따르십시오 (5 항 참조).
    2. AF4 정화를 수행 합니다.
      1. 350 µm 스페이서와 30kd 분자량 컷오프 셀 룰로 오 스 멤브레인이 있는 작은 채널을 사용 하 여 계측기를 설정 합니다. 0.1 µm 기 공 크기 필터를 HPLC 펌프와 AF4 채널 사이에 배치 합니다. 신선 하 게 준비 된 0.1 µm-여과 된 PBS를 이동 상으로 사용 하 여 광산 산란 검출기의 입자 하중과 소음을 줄입니다.
      2. 280 nm로 설정 된 UV 검출기를 사용 하 여 단백질을 검출 합니다. 입자를 감지 하려면 레이저를 658 nm로 설정 하 여 다중 각도 광 산란을 사용 합니다.
      3. 다음 run 메서드를 사용 합니다. 1 분의 초점 흐름으로 1 분간 사전 초점; 그런 다음 샘플의 300 µ L을 0.2 mL/min의 비율로 주입 하 고 초점 흐름을 10 분 동안 유지 합니다. 주입 후, 시료를 1ml/min에서 용 해 하 고 크로스 플로우를 사용 하지 않고 다른 10 분 동안 2 분에서 0.1 mL/min으로 감소 하는 교차 흐름을 적용 합니다. 12.5 분 후부터 시작 하 여 1 mL의 분 획을 수집 하 고 27 분까지 계속 합니다.
    3. 전술한 바와 같이 니드 분석을 수행 한다 (제 6 항 참조).
  2. 크기 및 농도를 평가 하기 위해, 전술한 바와 같이 NTA를 사용 한다 (2.5 단계 참조).
  3. 필요에 따라 TEM 및 SEM을 수행 하 여 저장 후 EVs의 형태를 평가할 수 있습니다 (5.3 참조).

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결과

그림 1 은 HUVECs에서 격리 된 EVs의 저장소 특성을 표시 합니다. EVs는 UC에 의해 분리 되었고, 니드 캡슐화 되었고, SEC 후에, 정제 된 EVs는 NTA에 의해 그들의 물리 화학적 성질을 평가 하였다. 샘플을 이어서 AF4 정제를 실시 하 고 니드 활성을 측정 하였다.

소포는 4°c 또는-80 ° c에서 7 d, 그리고 4°c에서 동결 건조 된 형태로 저장 하였으며, 후자의 경우 4% trehalose를 첨가...

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토론

이 원고에서는 다양 한 보관 조건에서 EVs의 안정성을 연구 하기 위한 종합적인 프로토콜을 제시 합니다. 캡슐화 된 니드을 기능적 판독 및 EVs의 물리 화학적 파라미터의 평가와 결합 하 여,이 프로토콜은 EVs의 간단한 저장 안정성 평가와 다른 셀의 EVs 비교를 허용 합니다. 라인. SEM 및 TEM을 보완 방법으로 사용 하면 단일 입자 수준에서 EVs의 변화에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에 제시 된...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

독일 교육 연구 부 (보조금 번호 13XP5029A)의 나노 Matfutur 주니어 연구 프로그램은이 작업을 지원 했다. 막시밀리안 리히터는 박사 펠로 우 십을 통해 유스호스텔 Volkes (독일 학술 장학 재단)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)Sigma-AldrichP2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)Sigma-AldrichP4329-25MG
225 cm² cell culture flasksCorning431082Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membraneWyatt Technology Europe1854
350 µm spacerWyatt Technology Europe
Automated fraction collectorThermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidaseSigma-AldrichG7646-100KU
ChloroformFisher scientificC/4966/17
Column ovenHitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrateSigma-AldrichT9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mmMerckVVLP04700Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3156Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtecWyatt Technology Europe
EGM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3162Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate SealersR&D SystemsDY992used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
EthanolFisher scientificE/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating BlockAvanti Polar Lipids610000-1EA
Filter supportAvanti Polar Lipids610014-1EAused for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronideThermo Fisher ScientificF2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36Thermo Fisher Scientific18912014
Hettich Universal 320 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGUsed for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGUsed for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cellsLonza Verviers, S.p.r.C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CMKimble420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSCChrist
Microcentrifuge Tubes, PolypropyleneVWR international525-0255the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laserMalvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranesWhatman/GE Healthcare110406used for liposome preparation
PEEK Inline filter holderWyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrateSigma-Aldrich79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugationBeckman Coulter355622
QuantiPro BCA Assay KitSigma-AldrichQPBCA-1KT
SaponinSigma-Aldrich47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2bGE Healthcare17014001
SEM copper grids with carbon filmPlanoS160-4
Small AF4 channelWyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ESQuorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotorBeckman Coulter339160
Ultimate 3000 Dionex autosamplerThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pumpThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasserThermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 KBeckman Coulter
UV detectorThermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filterWhatman/GE Healthcare10401712Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

참고문헌

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
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