细胞外囊储存稳定性的评价

摘要

在这里, 我们提出了一个易于应用的协议, 以评估细胞外囊泡的储存稳定性, 一组自然发生的纳米颗粒产生的细胞。囊泡中含有葡萄糖苷酶作为模型酶, 并在不同条件下储存。储存后, 对其理化参数和包封酶的活性进行了评价。

摘要

细胞外囊泡 (Ev) 是目前研究的目标, 可用作药物、药物载体和生物标志物。对于他们的临床发展, 不仅他们的药物活性很重要, 他们的生产也需要评估。在此背景下, 研究的重点是电动车的隔离、特性和存储。本手稿旨在提供一个简单的程序, 以评估不同的存储条件对 Ev 的影响, 而无需基因操纵或特定的功能检测。这样就可以快速获得在给定存储条件下电动车稳定性的第一印象, 并且可以很容易地比较来自不同细胞源的电动车。稳定性测量是基于 Ev 的物理化学参数 (大小、颗粒浓度和形态) 和保持其货物的活性。后者是由皂甙介导的酶β-葡萄糖苷酶封装到 Ev 中进行评估的。葡萄糖苷酶作为一个替代品, 并允许一个简单的定量, 通过荧光记者分子的裂解。目前的协议可以成为研究人员寻找最佳保持 EV 特性的存储条件的工具, 以推进 EV 研究的临床应用。

引言

Ev 是由几乎所有细胞类型产生的膜结合纳米粒子。对于哺乳动物细胞, ev 可以细分为两个主要组, 具有不同的生产途径^1,2。膜囊泡的大小范围约为100-1000 纳米, 是通过细胞膜的直接萌发而产生的。外质体, 大小30-200 纳米, 是从由内芽形成的多囊体形成的外质体, 随后与细胞膜融合, 同时释放多个外质体。这些囊泡的主要功能是细胞³之间的信息传输。为此, 对 RNA、DNA 和蛋白质等货物进行了积极的分类。电动车可以对其目标传递各种影响, 对健康和疾病状态都有影响。一方面, 他们介导阳性效应, 如组织再生, 抗原表达, 或抗生素的影响, 使他们的发展吉祥的目标, 作为治疗方法^4,5。另一方面, Ev 能促进肿瘤血管化⁶, 诱导旁观者在应激反应中的作用 7, 并可能在自身免疫性疾病⁸和炎症性疾病⁹中起到一定作用。因此, 它们可能是更好地了解许多病理影响的关键组成部分。然而, 在癌症^{10、11、12 和}心血管疾病13等多种疾病中, 发生了改变后的电动车, 而且在血液和尿液^中容易获得这些疾病, 使其成为理想的生物 标志 物。最后, 它们良好的生物相容性14和固有的靶向能力使电动车对药物输送也很有趣。在这篇手稿中, 我们描述了一个评估从哺乳动物细胞中提取的 Ev 的存储稳定性的协议, 这是一个重要的性质, 目前还很少被研究。

对于电动车的临床发展, 仍有许多障碍要克服 1⁶, 包括对其治疗效果的评价、生产、净化和储存^{1 7}。虽然-80°c 被广泛视为 EV 存储¹⁸的黄金标准, 但所需的冰柜成本很高, 从生产到患者, 维护所需的冷链可能具有挑战性。此外, 一些报告表明, 在-80°c 下的存储仍然不能最佳地保留电动车, 并导致 ev 功能的损失^19,20。其他方法, 如冷冻干燥^21,22或喷雾^{干燥 23}, 已被提出作为潜在的替代品冷冻储存的电动车。

评估储存稳定性的最佳方法是测试功能检测中的 ev, 或通过评估特定标记 (例如, 其抗菌活性¹⁹) 来测试 ev。当知道水泡的预期效果, 当一个不同的一组电动车要研究时, 这是可能的。如果要比较来自不同细胞源的 Ev (例如, 用于药物封装), 或者没有已知的功能读数, 则无法再直接评估由于存储而产生的变化。

另一方面, 简单地评估其物理化学参数的变化, 如大小、颗粒恢复和蛋白质浓度, 并不总是预测 EV 活性的变化, 最近的专利²⁰就表明了这一点。

在这里, 我们提供了一个易于应用的协议, 通过评估其物理化学参数与封装的β-葡萄糖酶酶作为电动车货物的替代品的活性来测量其储存稳定性。酶的负荷是通过皂甙的培养完成的, 这是一种用来自不同来源^{21、24、25 的}电动车建立的温和方法。皂甙在 EV 膜中形成短暂的毛孔, 使酶被吸收到囊泡中。由于酶在不受储存条件的影响时容易失去活性, 它们是评估电动车功能货物保存情况的理想替代品。

我们已经证明, 该方案的应用对来自人间充质干细胞 (MSCs)、人脐静脉内皮细胞 (Huvec) 和人腺癌肺泡上皮细胞 (A549) 的 Ev 确实导致了巨大的差异。不同细胞系之间的存储稳定性, 在选择 EV 源²¹时应考虑到这一点。

研究方案

1. 细胞培养和细胞调节培养基的生产

1. 一般情况下, 在各自细胞系所需的个别条件下培养细胞。
2. 在无血清条件下或含有 EV-depleted 耗尽的胎儿牛血清 (FBS) 中培养24-72 小时的细胞。
   注: 如果使用 EV-D20E fbs, 请采用一种经证明可以有效耗尽血清的方法, 以防止牛血清衍生的 Ev²⁶污染。
3. 从烧瓶中收集介质。以 300 x g离心10分钟将细胞颗粒状。小心收集细胞条件下的培养基 (CCM), 而不会干扰颗粒状细胞。优选地直接使用 CCM, 或将其存放在4°C 过夜。
   注: 最好使用新鲜生产的 CCM。如果不能规避较长时间的储存, 则应按照 MISEV2018 指南²⁶记录所有相关参数, 并需要考虑所获得结果的潜在偏差。
4. Huvec 的示例协议
   1. 在含有 FBS 和其他补充剂的 EGM-2 培养基中培养 HUVEC 细胞120小时。
   2. 在 EBM-2 基部培养基中培养48小时的 HUVEC 细胞, 不提供任何额外的补充。
   3. 从烧瓶中收集介质, 并执行上述离心步骤 (步骤 1.3)。通常情况下, 使用100毫升的介质进行一次 EV-isolation。

2. CCM 的超离心

1. 在超离心 (UC) 之前, 在 3, 000 x g和4°c 的温度下对 ccm 进行15分钟的离心, 以清除细胞碎片和大型团聚体。
2. 小心地将上清液转移到 UC 管中。如果使用固定角度的转子, 标记在离心机中的管的方向, 以方便电动车颗粒的回收后的 uc。离心 2小时, 120, 000 x克, k 因子为259.4。
3. UC 后, 使用血清学管道小心丢弃上清液, 以避免颗粒电动车的干扰。
   注: 颗粒可能是不可见的。
4. 在第一管中加入200μl 的0.2Μml 过滤磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 并使用 PBS 和剩余上清液通过上下移液重新悬浮颗粒。将产生的 EV 悬架转移到相应样品的下一个管, 并将其用于重新悬浮液。以这种方式以大约300-350μl 的最终体积重新悬挂样品的所有 Ev。
5. 再悬浮后, 通过纳米粒子跟踪分析 (NTA) 确认颗粒的存在。使用针对给定 EV 类型优化的设置, 如下面的设置 (步骤 2.5.1)。
   注: Gardiner 等人的文件^,第27条和 Vestad 等^人, 28 载有关于如何优化测量电动车的参数的宝贵信息。
   1. 要重现下面描述的结果, 请使用配备绿色激光的仪器 (例如 NanoSight LM14)。录制 3个30秒的视频, 屏幕增益为 1.0, 相机级别为13。为了进行分析, 请使用1.0 的屏幕增益和5的检测阈值。
6. 如有可能, 请立即使用颗粒;否则, 将其存放在4°c 过夜。

3. 葡萄糖化酶封装到电动车中

1. 在重新悬浮的颗粒中, 将β-葡萄糖苷酶 (PBS 中的 10 Mg/ml) 添加到最终浓度为 1.5 mgml 和皂甙 (h2o 中的 10 mgml), 最终浓度为 0.1 Mg/ml。通过涡流很好地混合3秒。
2. 在室温下通过轻轻滑动管进行插入混合10分钟。孵育后, 直接用大小排除色谱 (SEC) 纯化 (见第5节)。
   注: 一旦解冻, 不要重新冻结葡萄糖苷酶样品, 以防止酶因冻结而退化。

4. 脂质体生产

1. 为了准备与电动车比较的脂质体, 在氯仿中溶解 1, 2-二甲基-sn-甘油-3-磷胆碱 (dmpc) 和 1, 2-二棕榈基-sn-甘油-3-磷胆碱 (dppc) 在2:3 摩尔定量到最终浓度为 5 mm.在高效液相色谱 (HPLC) 小瓶中制备1毫升脂肪, 并让它们在一夜之间干燥, 形成脂膜。
   注意: 氯仿有毒, 并怀疑是致癌的。在处理时采取适当的预防措施。
2. 用含有 1.5 mgmml 葡萄糖苷酶的 PBS 1 毫升的脂膜补充。将其加热至42°c 和涡旋 1分钟, 将挤出机组件加热至 42°c, 并通过200纳米聚碳酸酯膜挤出脂质悬浮液11x。由 SEC 直接净化 (见第5节)。

5. 证交会的净化

1. 使用以下协议准备 sec 列。
   1. 只使用新鲜的纯净水和新鲜准备的缓冲液。通过0.2μm 膜过滤器过滤所有缓冲液, 并对其进行除气, 以防止在柱内形成气泡。
   2. 对于 SEC 柱的制备, 请使用琼脂糖凝胶滤液基 (例如, Sepharose Cl-2b) 或另一种适合从蛋白质杂质和多余酶中分离 Ev 和脂质体的 SEC 介质。首先, 去除储存在介质中的 20% EtOH 溶液, 以防止柱内气泡的形成。为此, 以 3, 000 x克的速度离心 sec 介质 10分钟, 取出 etoh, 然后用脱气水代替。
   3. 用 SEC 介质填充玻璃柱 (内径为10毫米) 至15毫升。
      注: 不同尺寸的列的卷将有所不同。一定要让凝胶完全沉淀。
   4. 在运行之前, 将至少有两列 PBS 的列进行均衡化。要存储柱, 首先用一列体积的水清洗, 然后至少用两列体积为 20% EtOH。储存后, 先用一根柱量的水清洗柱, 然后再与 PBS 进行平衡。
   5. 一次分离可使用高达400μl 的 EV 或脂质体悬浮液。收集1毫升的分数。在 SEC 之后, 要么储存纯化后的电动车 (见第7节), 要么对其进行葡萄糖苷酶检测 (见第6节)。
2. 确认从污染蛋白和游离葡萄糖苷酶中分离出 ev 和脂质体。为此, 将采集到的组分的颗粒浓度与蛋白质浓度和葡萄糖酶活性联系起来。
   1. 用 NTA 评估颗粒浓度 (见 2.5)
   2. 用双氯酸 (BCA) 法或其他合适的蛋白质定量法测定蛋白质含量。根据制造商的协议进行检测。
   3. 用葡萄糖苷酶法评估葡萄糖苷酶活性 (见第6节)。
3. (可选) 通过透射电子显微镜 (TEM) 和扫描电子显微镜 (SEM) 评估 EV 形态。
   1. 对于 TEM 样品的制备, 在 TEM 栅格中加入10μl 的 EV 悬浮液, 孵育 10分钟, 然后用滤纸将多余的液体抹掉。用10μl 的4% 甲醛和斑点将多余的物质抹掉10分钟的固定。用水清洗3倍。用30μl 的1% 磷-钨酸水合物将囊泡染色20秒。在将多余的东西抹掉后, 将水泡擦干一夜。由 TEM 可视化。
      注意: 磷钨酸是高度腐蚀性的;因此, 保护皮肤和眼睛。
   2. 对于 SEM, 将先前制备的 TEM 样品固定在碳盘上, 并用50纳米厚的金层将其溅射。由 SEM 可视化。

6. 葡萄糖苷酶检测

1. 为了通过将颗粒数与酶活性相关联, 对不同样品和储存条件进行比较, 首先用 NTA 测量样品的颗粒浓度 (见步骤 2.5)。
2. 在199μl 的 PBS 中加入1Μl 的化合物 (h2o 中的 10mgml), 制备荧光素二-Β-d-葡萄糖酰内的工作溶液。在125μl 的纯化 Ev 中加入25μl 的溶液, 最终浓度为8.3μg/ml。将样品放入96孔的黑色板中。用板式读取器测量时间点0小时, 使用 480 nm 作为激发, 516 nm 作为发射波长。
3. 将板材盖紧 (例如, 用用于 PCR 板的透明塑料箔), 以最大限度地减少蒸发, 并在37°c 下在黑暗中孵育18小时。使用步骤6.2 中列出的板式读取器参数测量荧光素生产。

7. 电动车和脂质体的储存

注: 对于所有储存目的, 建议使用低结合管, 以减少因吸附而造成的 EV 损失。

1. 按照本节中的参数重现下面给出的代表性结果。使用由400μl 的 EV 悬架组成的样品。
   1. 存放在4°c 或-80°c, 或继续执行下列步骤。
   2. 让电动车重新磷化
      1. 在纯化的电动车中加入海藻糖 (h2o 中的 40 mgml), 最终浓度为 4 mgl。将样品在-80°c 下冻结至少1小时。
      2. 使用以下参数对样品进行再干法。对于主干燥, 将货架温度设置为 15°c, 将压力设置为0.180 毫巴, 并将样品保持干燥46%。对于最终干燥, 将货架温度设置为 25°c, 将压力设置为0.0035 毫巴, 并将样品干燥 2小时. 将冻干样品存放在4°c。
      3. 要对样品进行补水, 请添加_h2o, 等于开始时存在的 ev 悬浮液量 (通常为 400μl)。不要使用任何缓冲液进行补液。

8. 储存后的分析

1. 为了评估酶的活性, 首先去除游离葡萄糖苷酶, 它可能在储存过程中从电动车中泄漏出来。通过由 SEC (请参阅步骤 5) 或非对称流场流分馏 (AF4) (参见步骤 8.1.2) 执行的额外纯化步骤来实现这一点。
   注: 请注意, 这两种方法都会导致 EV 样品的稀释;因此, 在储存前使用足够的 EV 浓度, 以避免移动到 NTA 量化限制以下。预计 1:10 稀释的粒子由于证交会或 AF4。
   1. 对于 SEC 的纯化, 请遵循上述协议 (见第5节)。
   2. 执行 AF4 纯化。
      1. 使用具有350微米间隔和 30 kD 分子量截断纤维素膜的小通道设置仪器。在高效液相色谱泵和 AF4 通道之间放置0.1μm 孔径过滤器。使用新制备的0.1μm 过滤 PBS 作为移动相位, 以减少光散射探测器中的粒子负载和噪声。
      2. 使用设置为280纳米的紫外线探测器检测蛋白质。要检测粒子, 请使用多角度光散射, 激光设置为 658 nm。
      3. 使用以下运行方法。预对焦 1分钟, 对焦流量为 1 mL/min;然后, 以 0.2 mlmin 的速度注入300μl 的样品, 并将焦点流保持10分钟。注射后, 将样品在 1 mL/min 处洗脱, 同时应用交叉流动, 在8分钟内从 2 mlmin 减少到 0.1 mL/min。收集1毫升的分数, 12.5 分钟后开始, 一直持续到27分钟。
   3. 执行上述葡萄糖酶检测 (见第6节)。
2. 若要评估大小和浓度, 请使用上述 NTA (参见步骤 2.5)。
3. (可选) 执行 TEM 和 SEM, 以评估存储后电动车的形态 (见 5.3)。

结果

图 1显示了与 huvec 隔离的 ev 的存储特性。用 UC 分离出的电动车, 对葡萄糖苷酶进行了包封, 并在证交会后, 用 NTA 对纯化后的电动车的理化性质进行了评价。随后对囊泡样品进行了 AF4 纯化, 并测定了葡萄糖苷酶活性。

然后将囊泡在4°c 或-80°c 和4°c 以冻干形式储存 7 d, 在后一种情况下, 添加4% 的海藻糖。储存后, 用 NTA 再次测定囊泡, 在 AF4 后, 对每个颗粒剩余的葡?...

讨论

在这篇手稿中, 我们提出了一个全面的协议, 研究在不同的存储条件下的电动车的稳定性。该协议结合了封装的葡萄糖苷酶作为功能读数, 并对电动车的物理化学参数进行了评估, 从而可以对电动车进行简单的存储稳定性评估, 并对不同细胞的电动车进行比较线。SEM 和 TEM 作为互补方法, 可以深入了解 Ev 在单粒子水平上的变化。这里给出的结果表明, 由于没有低温保护剂的冻干, 电动车和脂质体有聚?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks	Corning	431082	Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane	Wyatt Technology Europe	1854
350 µm spacer	Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Chloroform	Fisher scientific	C/4966/17
Column oven	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector	Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm	Merck	VVLP04700	Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162	Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers	R&D Systems	DY992	used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol	Fisher scientific	E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC	Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR international	525-0255	the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser	Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes	Whatman/GE Healthcare	110406	used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder	Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate	Sigma-Aldrich	79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Assay Kit	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM copper grids with carbon film	Plano	S160-4
Small AF4 channel	Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES	Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
UV detector	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter	Whatman/GE Healthcare	10401712	Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC