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Neste Artigo

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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo prontamente aplicável para avaliar a estabilidade do armazenamento de vesicles extracelular, um grupo de nanopartículas naturais produzidas pelas pilhas. As vesículas são carregadas com glucuronidase como uma enzima modelo e armazenadas diferentes condições. Após o armazenamento, os seus parâmetros físico-químicos e a atividade da enzima encapsulada são avaliados.

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) são alvos promissores na pesquisa atual, usadas como drogas, portadores de drogas e biomarcadores. Para seu desenvolvimento clínico, não somente sua atividade farmacêutica é importante mas também sua produção precisa de ser avaliada. Neste contexto, a pesquisa concentra-se no isolamento de EVs, sua caracterização e seu armazenamento. O presente manuscrito tem como objetivo fornecer um procedimento facile para a avaliação do efeito de diferentes condições de armazenamento em EVs, sem manipulação genética ou ensaios funcionais específicos. Isto torna possível obter rapidamente uma primeira impressão da estabilidade de EVs uma condição de armazenamento dada, e os EVs derivados das fontes diferentes da pilha podem ser comparados facilmente. A medida de estabilidade baseia-se nos parâmetros físico-químicos dos EVs (tamanho, concentração de partículas e morfologia) e na preservação da atividade de sua carga. O último é avaliado pelo encapsulamento saponina-negociado do beta-glucuronidase da enzima nos EVs. Glucuronidase atua como um substituto e permite uma quantificação fácil através da clivagem de uma molécula de repórter fluorescente. O presente protocolo poderia ser uma ferramenta para os pesquisadores na busca de condições de armazenamento que otimamente reter Propriedades EV para avançar a pesquisa EV para aplicação clínica.

Introdução

Os EVs são nanopartículas ligadas à membrana produzidas por quase todos os tipos de células. Para as células de mamíferos, os EVS podem ser subdivididos em dois grupos principais com distintas viasdeprodução1,2. As vesículas da membrana, com uma escala do tamanho de aproximadamente 100-1000 nanômetro, são produzidas pelo brotamento direto da membrana de pilha. Os exosomas, de tamanho 30-200 nm, são derivados de corpos multivesiculares formados por brotamento interno em endosomas que posteriormente se fundem com a membrana celular para liberar vários exosomas de uma só vez. A principal função dessas vesículas é o transporte de informações entre as células3. Para esta finalidade, as cargas tais como o RNA, o ADN, e as proteínas são classificadas ativamente neles. Os EVs podem transmitir uma variedade de efeitos sobre seus alvos, com implicações tanto para a saúde quanto para o estado da doença. De um lado, eles mediam efeitos positivos como regeneração tecidual, apresentação de antígenos ou efeitos de antibióticos, o que os torna alvos auspiciosos para seu desenvolvimento como terapêutica4,5. Por outro lado, os EVs podem promover a vascularização tumoral6, induzir efeitos de espectador nas respostas de estresse7, podendo desempenhar um papel nas doenças auto-imunes8 e doenças inflamatórias9. Assim, eles podem ser um componente-chave para uma melhor compreensão de muitos efeitos patológicos. No entanto, a presença de EVS alterados em doenças múltiplas, como câncer10,11,12 e distúrbios cardiovasculares13, e sua fácil acessibilidade no sangue e na urina os torna ideais Biomarcadores. Finalmente, a sua boa biocompatibilidade14 e sua capacidade de segmentação inerente fazer EVS também interessante para a entrega de drogas15. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para a avaliação da estabilidade de armazenamento de EVs derivados de células de mamíferos, uma importante propriedade que ainda é pouco investigada.

Para o desenvolvimento clínico de EVS, ainda existem muitos obstáculos para superar16, incluindo a avaliação de seus efeitos terapêuticos, produção, purificação e armazenamento17. Enquanto-80 ° c é amplamente visto como o padrão de ouro para o armazenamento de EV18, os congeladores necessários são caros, e manter a cadeia de frio necessária a partir da produção para o paciente pode ser desafiador. Além disso, alguns relatórios indicam que o armazenamento em-80 ° c ainda não preserva otimamente EVS e induz uma perda na funcionalidade de EV19,20. Outros métodos, como liofilização21,22 ou spray-secagem23, têm sido propostos como alternativas potenciais para o armazenamento congelado de EVS.

A maneira ideal de avaliar a estabilidade do armazenamento seria testar os EVs em ensaios funcionais ou pela avaliação de um marcador específico, por exemplo, sua atividade antibacteriana19. Isso é possível quando o efeito desejado das vesículas é conhecido e quando um grupo distinto de EVs deve ser estudado. Se os EVs de diferentes fontes de células forem comparados (por exemplo, para encapsulamento de drogas) ou se não houver leitura funcional conhecida, não será mais possível avaliar as alterações devidas ao armazenamento de forma direta.

Por outro lado, a simples avaliação de alterações em seus parâmetros físico-químicos, como tamanho, recuperação de partículas e concentração proteica, nem sempre prediz mudanças na atividade de EV, como foi demonstrado em uma patente recente20.

Aqui, nós fornecemos um protocolo prontamente aplicável para medir a estabilidade do armazenamento de EVS avaliando seus parâmetros físico-químicas combinados com a atividade de uma enzima encapsulada da beta-glucuronidase como um substituto para a carga dos EVS. O carregamento da enzima é feito por incubação de saponina, um método leve estabelecido com EVS de diferentes fontes21,24,25. A saponina forma poros transitórios na membrana EV, o que permite a absorção enzimática na vesícula. Como as enzimas são propensas a perder sua atividade se submetido a condições de armazenamento desfavorável, eles são um substituto ideal para a avaliação da preservação das cargas funcionais dos EVs.

Nós demonstramos que a aplicação deste protocolo aos EVS derivados das pilhas de haste mesenquimais humanas (MSCS), das pilhas endothelial humanas da veia de cordão umbilical (HUVECs), e das pilhas epithelial alveolares humanas do adenocarcinoma (A549) resulta certamente em grandes diferenças na estabilidade de armazenamento entre diferentes linhas celulares, que devem ser levados em consideração ao escolher a fonte EV21.

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Protocolo

1. cultura celular e produção de meio celular-condicionado

  1. Geralmente, cultivar as células as condições individuais necessárias para a respectiva linha celular.
  2. Cultivar as células para 24-72 h em condições livres de soro ou em meio contendo soro bovino fetal empobrecido EV (FBS).
    Nota: se for utilizado FBS empobrecido EV, empregar um método comprovado para esgotar eficientemente o soro, para evitar a contaminação com soro-derivado de bovinos EVs26.
  3. Colete o meio dos frascos. Centrifugador em 300 x g por 10 min para pellet as células. Colete com cuidado o meio celular-condicionado (CCM), sem perturbar as células peletizadas. De preferência, use o CCM diretamente, ou armazene-o durante a noite a 4 ° c.
    Nota: é sempre preferível usar o CCM recentemente produzido. Se o armazenamento por períodos de tempo mais longos não puder ser contornado, todos os parâmetros relevantes devem ser gravados de acordo com as diretrizes do MISEV201826, e os potenciais vieses dos resultados adquiridos precisam ser levados em consideração.
  4. Exemplo de protocolo para HUVECs
    1. Cultivar células HUVEC para 120 h em meio EGM-2 contendo FBS e outros suplementos.
    2. Cultivar células HUVEC para 48 h no meio basal EBM-2 livre de quaisquer suplementos adicionais.
    3. Recolher o meio dos frascos e executar a etapa de centrifugação como indicado acima (passo 1,3). Normalmente, use 100 mL de meio para um isolamento de EV.

2. ultracentlee de CCM

  1. Imediatamente antes de ultracentlee (UC), centrifugue o CCM por 15 min a 3.000 x g e 4 ° c para remover detritos celulares e grandes aglomerados.
  2. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para os tubos UC. Se estiver usando um rotor de ângulo fixo, marque a orientação dos tubos na centrífuga para facilitar a recuperação do pellet EV após a UC. Centrifugador para 2 h em 120.000 x g, com um k-factor de 259,4.
  3. Após UC, elimine com cuidado o sobrenadante usando um Pipet sorológicos, para evitar o distúrbio dos EVS peletizada.
    Nota: o pellet pode ser invisível.
  4. Adicionar 200 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato de 0,2 μm (PBS) ao primeiro tubo e utilizar PBS e o sobrenadante residual para ressuscitar o pellet através de pipetagem para cima e para baixo. Transfira a suspensão EV resultante para o tubo seguinte da respectiva amostra e utilize-a para a repensão. Proceda desta forma para suspender todos os EVs da amostra num volume final de aproximadamente 300-350 μL.
  5. Após a ressuspensão, confirme a presença de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Use as configurações otimizadas para o tipo de EV determinado, como as configurações abaixo (etapa 2.5.1).
    Nota: os artigos de Gardiner et al.27 e vestad et al.28 contêm informações valiosas sobre como otimizar os parâmetros de medição de EVS.
    1. Para reproduzir os resultados descritos abaixo, utilize instrumentos (por exemplo, NanoSight LM14) equipados com um laser verde. Gravar três vídeos de 30 s com um ganho de tela de 1,0 e um nível de câmera de 13. Para análise, use um ganho de tela de 1,0 e um limiar de detecção de 5.
  6. Use o pellet imediatamente, se possível; caso contrário, guarde-o a 4 ° c durante a noite.

3. encapsulamento de glucuronidase em EVs

  1. Ao pellet ressoado, adicionar beta-glucuronidase (10 mg/mL em PBS) a uma concentração final de 1,5 mg/mL e saponina (10 mg/mL em H2o) a uma concentração final de 0,1 mg/ml. Misture bem por vortexing para 3 s.
  2. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente com a mistura intermitida, sacudendo suavemente o tubo. Após a incubação, purificar diretamente por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (ver secção 5).
    Nota: não recongelar amostras de glucuronidase uma vez descongeladas, para evitar a degradação da enzima devido ao congelamento.

4. liposome produção

  1. Para preparar os lipossomas para comparação com EVs, dissolva 1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-fosfocolina (dmpc) e 1,2-dipalmitoyl-SN-glicero-3-FOSFOCOLINA (DPPC) em uma ração molar 2:3 em clorofórmio a uma concentração final de 5 mm. Prepare alíquotas de 1 mL em frascos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e deixe-os secar durante a noite para formar um filme lipídico.
    Cuidado: o clorofórmio é tóxico e suspeita de ser cancerogênico. Tome as devidas precauções ao manusear.
  2. Rehidrate o filme lipídico com 1 mL de PBS contendo 1,5 mg/mL de glucuronidase. Aqueça-o a 42 ° c e Vortex por 1 min. Aqueça o conjunto da extrusora a 42 ° c e extrusão a suspensão lipídica 11X através de uma membrana de policarbonato de 200 nm. Purificar diretamente pela SEC (ver secção 5).

5. purificação por SEC

  1. Prepare a coluna SEC usando o seguinte protocolo.
    1. Use apenas água purificada fresca e tampões preparados na hora. Filtrar todos os buffers através de um filtro de membrana de 0,2 μm e Degas-los para evitar a formação de bolhas de ar na coluna.
    2. Para a preparação de uma coluna SEC, use a matriz baseada em filtração em gel de agarose (por exemplo, Sepharose CL-2B) ou outro meio SEC adequado para separar EVs e lipossomas de impurezas proteicas e excesso de enzima. Primeiro, retire a solução de 20% EtOH que o meio é armazenado, para evitar a formação de bolhas de ar na coluna. Para este fim, centrifugue o meio SEC em 3.000 x g por 10 min, retire o EtOH e substitua-o por água desgaseificada.
    3. Encha uma coluna de vidro (com um diâmetro interno de 10 mm) com o meio SEC para a marca de 15 mL.
      Observação: os volumes serão diferentes para colunas com dimensões diferentes. Certifique-se de deixar o gel resolver completamente.
    4. Antes de uma corrida, equilibram a coluna com pelo menos dois volumes de coluna de PBS. Para armazenar a coluna, primeiro lave-a com um volume de coluna de água, seguido de pelo menos dois volumes de coluna de 20% de EtOH. Após o armazenamento, lave a coluna primeiro com um volume de coluna de água antes de equilibrar com PBS.
    5. Use até 400 μL de EV ou suspensão lipossomas em uma separação. Colete frações de 1 mL. Após a SEC, armazene os EVs purificados (ver secção 7) ou sujei-os a um ensaio de glucuronidase (ver secção 6).
  2. Confirme a separação de EVs e lipossomas de proteínas contaminantes e glucuronidase livre. Para tanto, correlacionar as concentrações de partículas das frações coletadas com a concentração proteica e a atividade da glucuronidase.
    1. Avaliar a concentração de partículas por NTA (ver 2,5)
    2. Avaliar o teor de proteínas por ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) ou outro ensaio adequado de quantificação de proteínas. Realize o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Avaliar a atividade da glucuronidase pelo ensaio de glucuronidase (ver secção 6).
  3. Opcionalmente, avalie a morfologia do EV por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopia eletrônica de varredura (MEV).
    1. Para a preparação de amostras de TEM, adicione 10 μL de suspensão EV a uma grelha TEM, incubar durante 10 min e, em seguida, limpe qualquer excesso de líquido utilizando um papel de filtro. Realize a fixação por 10 min com 10 μL de paraformaldeído a 4% e afaste qualquer excesso. Lave 3x com água. Manchar as vesículas em 20 s de incubação com 30 μL de 1% de ácido fosfórico-tungstic hidrato. Depois de blotting afastado o excesso, seque as vesículas durante a noite. Visualize por TEM.
      Cuidado: o ácido fosfórico é altamente cáustico; assim, proteger a pele e os olhos.
    2. Para o SEM, fixe as amostras previamente preparadas do TEM em discos de carbono e Sputter-as com uma camada grossa do ouro de 50 nanômetro. Visualize por SEM.

6. ensaio de glucuronidase

  1. Para permitir uma comparação entre diferentes amostras e condições de armazenamento, correlacionando o número de partículas e a atividade enzimática, primeiro meça a concentração de partículas da amostra por NTA (ver etapa 2,5).
  2. Prepare uma solução de trabalho de fluoresceina di-β-D-glucuronida adicionando 1 μL do composto (10 mg/mL em H2o) a 199 ΜL de PBS. Adicionar 25 μL desta solução a 125 μL de EVs purificados para obter uma concentração final de 8,3 μg/mL. Pipet a amostra em uma placa 96-well preta. Medir o ponto de tempo 0 h com um leitor de chapa, usando 480 nm como excitação e 516 nm como comprimento de onda de emissão.
  3. Cubra a placa firmemente (por exemplo, com a folha plástica transparente usada para placas do PCR) para minimizar a evaporação e incubar no escuro por 18 h em 37 ° c. Meça a produção da fluoresceina usando os parâmetros do leitor da placa alistados na etapa 6,2.

7. armazenamento de EVs e lipossomas

Nota: para todas as finalidades do armazenamento, é aconselhável usar os tubos Low-Binding para reduzir a perda do EV devido à adsorção.

  1. Siga os parâmetros nesta seção para reproduzir os resultados representativos abaixo. Utilize amostras compostas por 400 μL de suspensão de EV.
    1. Armazene a 4 ° c ou-80 ° c ou prossiga para as etapas listadas abaixo.
    2. Liofililize os EVs.
      1. Adicionar trealose (40 mg/ml em H2o) até uma concentração final de 4 mg/ml para os EVS purificados. Congelar as amostras a-80 ° c durante pelo menos 1 h.
      2. Liofililize as amostras usando os seguintes parâmetros. Para a secagem principal, ajuste a temperatura da prateleira a 15 ° c e a pressão a 0,180 mbar e deixe as amostras para secar por 46 h. Para a secagem final, ajuste a temperatura da prateleira a 25 ° c e a pressão a 0, 35 mbar e deixe as amostras para secar por 2 h. Guarde as amostras liofilizadas a 4 ° c.
      3. Para Rehidratar as amostras, adicionar H2o, igual à quantidade de EV suspensão presente no início (tipicamente, 400 μL). Não utilize nenhum tampão para reidratação.

8. análise após o armazenamento

  1. Para avaliar a atividade enzimática, primeiro remova a glucuronidase livre, que pode ter vazado dos EVs durante o armazenamento. Consiga isto por uma etapa adicional da purificação que seja realizada pelo SEC (veja a etapa 5) ou pelo fraccionamento do fluxo de campo assimétrico do fluxo (AF4) (veja a etapa 8.1.2).
    Nota: Informamos que ambos os métodos levam a uma diluição da amostra EV; assim, use concentrações suficientes de EV antes do armazenamento para evitar mover-se abaixo do limite de quantificação de NTA. Espere uma diluição 1:10 das partículas devido ao SEC ou ao AF4.
    1. Para a purificação da SEC, siga o protocolo descrito acima (ver secção 5).
    2. Realize a purificação AF4.
      1. Configure o instrumento usando um pequeno canal com um espaçador de 350 μm e uma membrana de celulose de corte de peso molecular de 30 kD. Coloque um filtro de tamanho de poros de 0,1 μm entre a bomba HPLC e o canal AF4. Use a PBS filtrada recentemente preparada 0,1 μm como a fase móvel para reduzir a carga e o ruído da partícula nos detectores da luz-espalhamento.
      2. Detecte proteínas utilizando um detector UV definido para 280 nm. Para detectar partículas, use espalhamento de luz multiangular com o laser definido para 658 nm.
      3. Use o seguinte método de execução. Pre-Focus para 1 minuto com um fluxo do foco de 1 mL/min; em seguida, injete 300 μL da amostra a uma taxa de 0,2 mL/min e mantenha o fluxo de focagem durante 10 min. Após a injeção, eluir a amostra em 1 ml/min ao aplicar um fluxo transversal que diminua de 2 ml/min a 0,1 ml/min ao longo de 8 min. eluir por outro 10 min sem fluxo cruzado. Colete frações de 1 mL, começando após 12,5 min e continuando até 27 min.
    3. Realize o ensaio de glucuronidase como descrito acima (ver secção 6).
  2. Para avaliar o tamanho e a concentração, use o NTA como descrito acima (ver passo 2,5).
  3. Opcionalmente, execute TEM e SEM para avaliar a morfologia dos EVs após o armazenamento (ver 5,3).

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Resultados

A Figura 1 exibe as características de armazenamento de EVS isoladas de HUVECs. Os EVs foram isolados por UC, a glucuronidase foi encapsulada e, após a SEC, os EVs purificados foram avaliados por suas propriedades físico-químicas por NTA. Uma amostra dos vesículas foi submetida subseqüentemente à purificação AF4 e a atividade do glucuronidase foi medida.

As vesículas foram então armazenadas por 7 d a 4 ° c ou-80 ° c e a 4 ° c em forma liofilizada, no último caso...

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Discussão

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente para estudar a estabilidade dos EVs diferentes condições de armazenagem. Com a combinação de glucuronidase encapsulado como um leitura funcional e a avaliação dos parâmetros físico-químicas dos EVS, o protocolo permite uma avaliação de estabilidade de armazenamento direta de EVS e a comparação de EVS da pilha diferente Linhas. SEM e TEM como métodos complementares permitem uma introspecção em mudanças dos EVs no nível da único-partícula. Os result...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O programa de pesquisa Júnior NanoMatFutur do Ministério Federal da educação e pesquisa, Alemanha (Grant Number 13XP5029A) apoiou este trabalho. Maximilian Richter foi apoiado por Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fundação alemã de bolsas acadêmicas) através de uma bolsa de doutorado.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)Sigma-AldrichP2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)Sigma-AldrichP4329-25MG
225 cm² cell culture flasksCorning431082Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membraneWyatt Technology Europe1854
350 µm spacerWyatt Technology Europe
Automated fraction collectorThermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidaseSigma-AldrichG7646-100KU
ChloroformFisher scientificC/4966/17
Column ovenHitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrateSigma-AldrichT9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mmMerckVVLP04700Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3156Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtecWyatt Technology Europe
EGM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3162Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate SealersR&D SystemsDY992used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
EthanolFisher scientificE/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating BlockAvanti Polar Lipids610000-1EA
Filter supportAvanti Polar Lipids610014-1EAused for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronideThermo Fisher ScientificF2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36Thermo Fisher Scientific18912014
Hettich Universal 320 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGUsed for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGUsed for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cellsLonza Verviers, S.p.r.C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CMKimble420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSCChrist
Microcentrifuge Tubes, PolypropyleneVWR international525-0255the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laserMalvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranesWhatman/GE Healthcare110406used for liposome preparation
PEEK Inline filter holderWyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrateSigma-Aldrich79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugationBeckman Coulter355622
QuantiPro BCA Assay KitSigma-AldrichQPBCA-1KT
SaponinSigma-Aldrich47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2bGE Healthcare17014001
SEM copper grids with carbon filmPlanoS160-4
Small AF4 channelWyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ESQuorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotorBeckman Coulter339160
Ultimate 3000 Dionex autosamplerThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pumpThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasserThermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 KBeckman Coulter
UV detectorThermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filterWhatman/GE Healthcare10401712Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

Referências

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