Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Resumen

Aquí presentamos un protocolo fácilmente aplicable para evaluar la estabilidad del almacenamiento de las vesículas extracelulares, un grupo de nanopartículas naturales producidas por las células. Las vesículas se cargan con glucuronidasa como una enzima modelo y se almacenan en diferentes condiciones. Después del almacenamiento, se evalúan sus parámetros fisicoquímicos y la actividad de la enzima encapsulada.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EVs) son objetivos prometedores en la investigación actual, que se utilizarán como fármacos, portadores de fármacos y biomarcadores. Para su desarrollo clínico, no sólo su actividad farmacéutica es importante, sino también su producción necesita ser evaluada. En este contexto, la investigación se centra en el aislamiento de los EVs, su caracterización y su almacenamiento. El presente manuscrito tiene como objetivo proporcionar un procedimiento fácil para la evaluación del efecto de las diferentes condiciones de almacenamiento en los EVs, sin manipulación genética o ensayos funcionales específicos. Esto hace posible obtener rápidamente una primera impresión de la estabilidad de los EVs bajo una condición de almacenamiento determinada, y los EVs derivados de diferentes fuentes celulares se pueden comparar fácilmente. La medición de la estabilidad se basa en los parámetros fisicoquímicos de los EVs (tamaño, concentración de partículas y morfología) y en la preservación de la actividad de su carga. Este último es evaluado por la encapsulación mediada por saponina de la enzima beta-glucuronidasa en el EVs. La glucuronidasa actúa como sustituto y permite una fácil cuantificación a través de la hendiedad de una molécula reportera fluorescente. El presente Protocolo podría ser una herramienta para los investigadores en la búsqueda de condiciones de almacenamiento que conserven de forma óptima las propiedades de EV para avanzar la investigación de EV hacia la aplicación clínica.

Introducción

Los EVs son nanopartículas ligadas a membranas producidas por casi todos los tipos de células. Para las células de mamíferos, los EVS se pueden subdividir en dos grupos principales con distintas vías de producción^1,2. Las vesículas de membrana, con un rango de tamaño de aproximadamente 100-1000 nm, se producen por el brote directo de la membrana celular. Los exosomas, de tamaño 30-200 nm, se derivan de cuerpos multivesiculares formados por la entrada interna en endosomas que posteriormente se fusionan con la membrana celular para liberar múltiples exosomas a la vez. La función principal de estas vesículas es el transporte de información entre las células³. Para este propósito, cargas como el ARN, el ADN y las proteínas se clasifican activamente en ellos. Los EVs pueden transmitir una variedad de efectos sobre sus objetivos, con implicaciones tanto para la salud como para el estado de la enfermedad. En un lado, median efectos positivos como la regeneración de tejido, presentación de antígeno, o efectos antibióticos, lo que los convierte en objetivos auspiciosos para su desarrollo como terapéutica^4,5. Por otro lado, los EVs pueden promover la vascularización tumoral⁶, inducir efectos de transeúnte en las respuestas de estrés⁷, y podrían desempeñar un papel en las enfermedades autoinmunes⁸ y enfermedades inflamatorias⁹. Por lo tanto, pueden ser un componente clave para una mejor comprensión de muchos efectos patológicos. Sin embargo, la presencia de EVS alterados en enfermedades múltiples, como el cáncer^10,11,12 y los trastornos cardiovasculares¹³, y su fácil accesibilidad en la sangre y la orina los hace ideales Biomarcadores. Finalmente, su buena biocompatibilidad¹⁴ y su capacidad inherente de focalización hacen que los EVS también sean interesantes para la entrega de fármacos¹⁵. En este manuscrito, describimos un protocolo para la evaluación de la estabilidad del almacenamiento de EVs derivado de células de mamíferos, una propiedad importante que todavía es poco investigada.

Para el desarrollo clínico de EVs, todavía hay muchos obstáculos para superar¹⁶, incluyendo la evaluación de sus efectos terapéuticos, producción, purificación y almacenamiento¹⁷. Mientras que-80 ° c es ampliamente visto como el estándar de oro para el almacenamiento EV¹⁸, los congeladores requeridos son caros, y el mantenimiento de la cadena de frío requerida de la producción al paciente puede ser desafiante. Por otra parte, algunos informes indican que el almacenamiento a-80 ° c todavía no preserva de manera óptima el EVS e induce una pérdida en la funcionalidad de EV^19,20. Otros métodos, como el liofilizado^21,22 o el secado por pulverización²³, se han propuesto como posibles alternativas al almacenamiento congelado de EVS.

La forma óptima de evaluar la estabilidad del almacenamiento sería probar los EVs en ensayos funcionales o mediante la evaluación de un marcador específico, por ejemplo, su actividad antibacteriana¹⁹. Esto es posible cuando se conoce el efecto deseado de las vesículas y cuando se estudia un grupo diferenciado de EVs. Si se comparan los EVs de diferentes fuentes celulares (p. ej., para la encapsulación de fármacos) o si no hay ninguna lectura funcional conocida, ya no es posible evaluar los cambios debidos al almacenamiento de forma directa.

Por otro lado, simplemente evaluar los cambios en sus parámetros fisicoquímicos, como el tamaño, la recuperación de partículas y la concentración de proteínas, no siempre predice los cambios en la actividad del EV, como se ha demostrado en una patente reciente²⁰.

Aquí, proporcionamos un protocolo fácilmente aplicable para medir la estabilidad del almacenamiento de EVs mediante la evaluación de sus parámetros fisicoquímicos combinados con la actividad de una enzima beta-glucuronidasa encapsulada como sustituto de la carga de los EVs. La carga de la enzima se realiza por incubación de saponina, un método suave establecido con EVS de diferentes fuentes^21,24,25. La Saponin forma poros transitorios en la membrana EV, lo que permite la captación de enzimas en la vesícula. Como las enzimas son propensas a perder su actividad si se someten a condiciones de almacenamiento desfavorables, son un sustituto ideal para la evaluación de la preservación de las cargas funcionales de los EVs.

Hemos demostrado que la aplicación de este protocolo a los EVs derivados de las células madre mesenquimales humanas (MSCs), las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) y el adenocarcinoma humano alveolar (A549) de hecho resultan en grandes diferencias en estabilidad de almacenamiento entre diferentes líneas celulares, que deben tenerse en cuenta al elegir la fuente EV²¹.

Protocolo

1. el cultivo celular y la producción de medio acondicionado con celdas

1. En general, cultivar las células en las condiciones individuales requeridas para la línea celular respectiva.
2. Cultivar las células durante 24-72 h en condiciones libres de suero o en un medio que contenga suero bovino fetal empobrecido (FBS).
   Nota: si se utiliza FBS empobrecido por EV, emplear un método comprobado para agotar eficientemente el suero, para evitar la contaminación con EVs derivados del suero de bovino²⁶.
3. Recoja el medio de las matraces. Centrifugar a 300 x g durante 10 min para peletiza las células. Recoja cuidadosamente el medio con condicionado celular (CCM), sin perturbar las células granuladas. Preferiblemente, utilice el CCM directamente, o guárdela durante la noche a 4 ° c.
   Nota: siempre es preferible utilizar el MCP recién producido. Si no puede eludirse el almacenamiento durante períodos de tiempo más prolongados, todos los parámetros pertinentes deben registrarse de conformidad con las directrices MISEV2018²⁶, y es necesario tener en cuenta los posibles sesgos de los resultados adquiridos.
4. Protocolo de ejemplo para HUVECs
   1. Cultivar células HUVEC para 120 h en medio EGM-2 que contiene FBS y otros suplementos.
   2. Cultivar células HUVEC por 48 h en medio basal de EBM-2 sin suplementos adicionales.
   3. Recoja el medio de los matraces y realice el paso de centrifugación como se indicó anteriormente (paso 1,3). Típicamente, utilice 100 mL de medio para un aislamiento EV.

2. ultracentrifugación de CCM

1. Inmediatamente antes de la ultracentrifugación (UC), Centrifugue el MCP durante 15 min a 3.000 x g y 4 ° c para eliminar los desechos celulares y los grandes aglomerados.
2. Transfiera con cuidado el sobrenadante a los tubos UC. Si se utiliza un rotor de ángulo fijo, marque la orientación de los tubos en la centrífuga para facilitar la recuperación del pellet de EV después de la UC. Centrifugar por 2 h a 120.000 x g, con un factor k de 259,4.
3. Después de la UC, deseche cuidadosamente el sobrenadante utilizando un Pipet serológico, para evitar la perturbación de los EVs pelados.
   Nota: el pellet puede ser invisible.
4. Añadir 200 μL de solución salina filtrada por fosfato de 0,2 μm (PBS) al primer tubo y utilizar PBS y el sobrenadante residual para resuspentar el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión EV resultante al siguiente tubo de la muestra respectiva y utilítila para la resuspensión. Proceda de esta manera para resuspender todos los EVs de la muestra en un volumen final de aproximadamente 300-350 μL.
5. Después de la resuspensión, confirme la presencia de partículas por análisis de rastreo de nanopartículas (NTA). Utilice los ajustes optimizados para el tipo de EV determinado, como los ajustes siguientes (paso 2.5.1).
   Nota: los documentos de Gardiner et al.²⁷ y vestad et al.²⁸ contienen información valiosa sobre cómo optimizar los parámetros para medir los EVS.
   1. Para reproducir los resultados descritos a continuación, utilice instrumentos (p. ej., NanoSight LM14) equipados con un láser verde. Graba tres videos de 30 s con una ganancia de pantalla de 1,0 y un nivel de cámara de 13. Para el análisis, utilice una ganancia de pantalla de 1,0 y un umbral de detección de 5.
6. Utilice el pellet inmediatamente, si es posible; de lo contrario, guárdelo a 4 ° c durante la noche.

3. encapsulado de glucuronidasa en EVs

1. Para el pellet resuspendido, añadir beta-glucuronidasa (10 mg/mL en PBS) a una concentración final de 1,5 mg/mL y saponina (10 mg/mL en H₂O) a una concentración final de 0,1 mg/ml. Mezclar bien por vórtex para 3 s.
2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente con mezcla intermitida deslizando suavemente el tubo. Después de la incubación, purificar directamente por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (ver sección 5).
   Nota: no recongelar las muestras de glucuronidasa una vez descongeladas, para evitar la degradación enzimática debida a la congelación.

4. la producción de liposome

1. Para preparar liposomas para la comparación con EVs, disolver 1, 2-Dimyristoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (DMPC) y 1, 2-Dipalmitoyl-SN-glycero-3-FOSFOCHOLINE (DPPC) en una ración de 2:3 molar en cloroformo a una concentración final de 5 mm. Prepare alícullitas de 1 mL en viales de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y déjelos secar durante la noche para formar una película lipídica.
   PRECAUCIÓN: el cloroformo es tóxico y se sospecha que es cancerógeno. Tome las precauciones adecuadas al manipularlo.
2. Rehidratar la película lipídica con 1 mL de PBS que contiene 1,5 mg/mL de glucuronidasa. Calentar a 42 ° c y vórtice durante 1 min. calentar el ensamblaje del extrusor a 42 ° c y Extruir la suspensión lipídica 11x a través de una membrana de policarbonato de 200 nm. Purificar directamente por SEC (ver sección 5).

5. purificación por SEC

1. Prepare la columna SEC con el siguiente protocolo.
   1. Utilice únicamente agua purificada fresca y amortiguadores recién preparados. Filtre todos los buffers a través de un filtro de membrana de 0,2 μm y desgaseelos para evitar la formación de burbujas de aire en la columna.
   2. Para la preparación de una columna SEC, utilice una matriz basada en filtración de gel de agarosa (p. ej., Sepharose CL-2B) u otro medio SEC adecuado para separar EVs y liposomas de impurezas de proteínas y exceso de enzimas. En primer lugar, retire la solución de 20% EtOH en la que se almacena el medio, para evitar la formación de burbujas de aire en la columna. Con este fin, Centrifugue el medio SEC a 3.000 x g durante 10 min, extraiga el EtOH y reemplácelo por agua desgasizada.
   3. Llenar una columna de vidrio (con un diámetro interior de 10 mm) con el medio SEC a la marca de 15 mL.
      Nota: los volúmenes variarán para las columnas con diferentes dimensiones. Asegúrese de dejar que el gel se asientan completamente.
   4. Antes de una carrera, equilibrar la columna con al menos dos volúmenes de columna de PBS. Para almacenar la columna, primero lávela con un volumen de agua de columna, seguida de al menos dos volúmenes de columna del 20% de EtOH. Después del almacenamiento, lave la columna primero con un volumen de agua de columna antes de equilibrar con PBS.
   5. Utilice hasta 400 μL de suspensión de EV o liposoma en una separación. Recoger fracciones de 1 mL. Después de la SEC, almacene los EVs purificados (ver sección 7) o someta a un ensayo glucuronidasa (ver sección 6).
2. Confirme la separación de EVs y liposomas de proteínas contaminantes y glucuronidasa libre. Con este fin, correlacionar las concentraciones de partículas de las fracciones recogidas con la concentración proteica y la actividad glucuronidasa.
   1. Evaluar la concentración de partículas por NTA (ver 2,5)
   2. Evaluar el contenido de proteína por el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) u otro ensayo de cuantificación de proteínas adecuado. Realice el ensayo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   3. Evaluar la actividad de la glucuronidasa mediante ensayo glucuronidasa (ver sección 6).
3. Opcionalmente, evalúe la morfología del EV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM).
   1. Para la preparación de muestras TEM, añadir 10 μL de suspensión EV a una rejilla TEM, incubar durante 10 min, y luego borrar cualquier exceso de líquido utilizando un papel de filtro. Realizar la fijación durante 10 min con 10 μL de 4% de paraformaldehído y borrar cualquier exceso. Lavar 3x con agua. Manchar las vesículas por 20 s de incubación con 30 μL de 1% de ácido fosforoso-tungstico hidratado. Después de haber borrado el exceso, seque las vesículas durante la noche. Visualizar por TEM.
      PRECAUCIÓN: el ácido fosfo-tungstico es altamente cáustico; así, proteger la piel y los ojos.
   2. Para SEM, fije las muestras TEM previamente preparadas en discos de carbono y tartamudo va con una capa de oro de 50 nm de espesor. Visualizar por SEM.

6. ensayo glucuronidasa

1. Para permitir una comparación entre diferentes muestras y condiciones de almacenamiento correlacionando el número de partículas y la actividad enzimática, mida primero la concentración de partículas de la muestra por NTA (ver paso 2,5).
2. Preparar una solución de trabajo de fluoresceina di-β-D-glucurótida añadiendo 1 μL del compuesto (10 mg/mL en H₂O) a 199 ΜL de PBS. Añadir 25 μL de esta solución a 125 μL de EVs purificados para obtener una concentración final de 8,3 μg/mL. Pipet la muestra en una placa de pozo negro de 96. Mida el punto de tiempo 0 h con un lector de placas, utilizando 480 nm como excitación y 516 nm como longitud de onda de emisión.
3. Cubra la placa firmemente (por ejemplo, con una lámina de plástico transparente utilizada para las placas de PCR) para minimizar la evaporación e incubar en la oscuridad durante 18 h a 37 ° c. Mida la producción de fluoresceína utilizando los parámetros del lector de placas enumerados en el paso 6,2.

7. almacenamiento de EVs y liposomas

Nota: para todos los fines de almacenamiento, es aconsejable utilizar tubos de baja unión para reducir la pérdida de EV debido a la adsorción.

1. Siga los parámetros de esta sección para reproducir los resultados representativos que se indican a continuación. Utilice muestras compuestas por 400 μL de suspensión EV.
   1. Conservar a 4 ° c o-80 ° c o proceder a los pasos indicados a continuación.
   2. Liofilizar los EVs.
      1. Añadir trehalosa (40 mg/mL en H₂O) hasta una concentración final de 4 mg/ml a los EVS purificados. Congelar las muestras a-80 ° c durante al menos 1 h.
      2. Liofilizar las muestras utilizando los siguientes parámetros. Para el secado principal, fije la temperatura del estante a 15 ° c y la presión a 0,180 mbar y deje las muestras secar por 46 h. Para el secado final, fije la temperatura del estante a 25 ° c y la presión a 0,0035 mbar y deje las muestras secar durante 2 h. Almacene las muestras liofilizadas a 4 ° c.
      3. Para rehidratar las muestras, Añadir H₂O, igual a la cantidad de suspensión EV presente al principio (típicamente, 400 μL). No utilice ningún tampón para la rehidratación.

8. análisis después del almacenamiento

1. Para evaluar la actividad enzimática, primero quite la glucuronidasa libre, que puede haberse filtrado de los EVs durante el almacenamiento. Lograr esto mediante un paso adicional de purificación que se lleva a cabo ya sea por SEC (véase el paso 5) o fraccionamiento del flujo de campo asimétrico (AF4) (ver paso 8.1.2).
   Nota: tenga en cuenta que ambos métodos conducen a una dilución de la muestra EV; por lo tanto, utilice suficientes concentraciones de EV antes del almacenamiento para evitar moverse por debajo del límite de cuantificación de NTA. Esperar una dilución de 1:10 de las partículas debido a la SEC o AF4.
   1. Para la purificación de la SEC, siga el protocolo descrito anteriormente (ver sección 5).
   2. Realizar purificación AF4.
      1. Configure el instrumento utilizando un canal pequeño con un espaciador de 350 μm y una membrana de celulosa de corte de peso molecular de 30 kD. Coloque un filtro de tamaño de poro de 0,1 μm entre la bomba HPLC y el canal AF4. Utilice PBS recién preparado con filtro de 0,1 μm como la fase móvil para reducir la carga de partículas y el ruido en los detectores de dispersión de luz.
      2. Detecte proteínas utilizando un detector UV establecido en 280 nm. Para detectar partículas, utilice dispersión de luz multiángulo con el láser establecido en 658 nm.
      3. Utilice el siguiente método de ejecución. Pre-enfoque durante 1 min con un flujo de enfoque de 1 mL/min; a continuación, inyectar 300 μL de la muestra a una velocidad de 0,2 mL/min y mantener el flujo de enfoque durante 10 min. Después de la inyección, eluyen la muestra a 1 ml/min mientras se aplica un flujo cruzado que disminuye de 2 ml/min a 0,1 ml/min en el transcurso de 8 min. eluyen durante otros 10 minutos sin flujo cruzado. Recoger fracciones de 1 mL, comenzando después de 12,5 min y continuando hasta 27 min.
   3. Realizar el ensayo glucuronidasa como se describió anteriormente (ver sección 6).
2. Para evaluar el tamaño y la concentración, utilice el NTA como se describió anteriormente (véase el paso 2,5).
3. Opcionalmente, realice TEM y SEM para evaluar la morfología de los EVs después del almacenamiento (véase 5,3).

Resultados

La figura 1 muestra las características de almacenamiento de EVS aislados de HUVECs. Los EVs fueron aislados por la UC, la glucuronidasa fue encapsulada, y después de la SEC, los EVs purificados fueron evaluados por sus propiedades fisicoquímicas por NTA. Una muestra de las vesículas fue sometida posteriormente a la purificación de AF4 y se midió la actividad de la glucuronidasa.

Las vesículas se almacenaron entonces para 7 d a 4 ° c o-80 ° c y a 4 ° c en forma liofi...

Discusión

En este manuscrito, presentamos un protocolo integral para estudiar la estabilidad de los EVs en diferentes condiciones de almacenamiento. Con la combinación de la glucuronidasa encapsulada como una lectura funcional y la evaluación de los parámetros fisicoquímicos de los EVs, el protocolo permite una evaluación directa de la estabilidad del almacenamiento de EVs y la comparación de EVs de diferentes células Líneas. SEM y TEM como métodos complementarios permiten una visión de los cambios de los EVs en el nivel...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks	Corning	431082	Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane	Wyatt Technology Europe	1854
350 µm spacer	Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Chloroform	Fisher scientific	C/4966/17
Column oven	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector	Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm	Merck	VVLP04700	Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162	Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers	R&D Systems	DY992	used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol	Fisher scientific	E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC	Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR international	525-0255	the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser	Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes	Whatman/GE Healthcare	110406	used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder	Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate	Sigma-Aldrich	79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Assay Kit	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM copper grids with carbon film	Plano	S160-4
Small AF4 channel	Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES	Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
UV detector	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter	Whatman/GE Healthcare	10401712	Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC