細胞外小胞の保存性の評価

要約

ここでは、細胞によって産生される天然ナノ粒子の群である細胞外小胞の貯蔵安定性を評価するために容易に適用可能なプロトコルを提示する。小胞は、モデル酵素としてグルクロニダーゼを搭載し、異なる条件下で保存されます。保存後、それらの物理化学的パラメータおよび封入酵素の活性が評価される。

要約

現在の研究では、細胞外小胞 (Ev) が有望な標的であり、薬剤、薬剤、担体、バイオマーカーとして利用されている。臨床開発のためには、その医薬品の活動だけでなく、その生産を評価する必要があります。この文脈では、研究は、EVs の分離、その特徴付け、およびそれらのストレージに焦点を当てています。本稿では、遺伝子操作や特定の機能アッセイを行わずに、さまざまな貯蔵条件が EVs に及ぼす影響を評価するための容易な手順を提供することを目的としています。これにより、所定の貯蔵条件下での Ev の安定性の第一印象を迅速に得ることができ、異なるセル源に由来する EVs を容易に比較することができる。安定性の測定は EVs (サイズ、粒子の集中および形態) の物理化学的な変数および彼らの貨物の活動の保存に基づいている。後者は、Ev への酵素β-グルクロニダーゼのサポニン媒介封入によって評価される。グルクロニダーゼはサロゲートとして機能し、蛍光レポーター分子の切断によって容易に定量化することができます。本プロトコルは、臨床応用に向けた EV 研究を進めるために EV 特性を最適に保持する保存条件を探索する研究者のためのツールとなりうる。

概要

EVs は、ほぼすべてのセルタイプによって生成される膜結合ナノ粒子です。哺乳類細胞の場合、EVs は、異なる生産経路^1、2を持つ2つの主要なグループに細分化することができます。膜小胞は、およそ100〜 1000 nm の大きさの範囲で、細胞膜からの直接出芽によって産生される。エキソソームは、サイズが 30-200 nm で、その後、細胞膜と融合して一度に複数のエキソソームを放出するエンドソームに、内側の出芽によって形成された多体に由来する。これらの小胞の主な機能は、細胞³間の情報の輸送である。この目的のために、RNA、DNA、タンパク質などの貨物が積極的に選別されます。EVs は、健康と病気の状態の両方の影響で、ターゲットにさまざまな効果を伝えることができます。一方では、組織再生、抗原提示、または抗生物質効果などのポジティブな効果を媒介し、治療薬としての開発の目標となります^4,5.反対側では、EVs は、腫瘍血管新生⁶を促進し、ストレス応答⁷において傍観効果を誘発し、そして自己免疫疾患⁸および炎症性疾患⁹において役割を果たす可能性がある。したがって、彼らは多くの病理学的効果をよりよく理解するための重要なコンポーネントであるかもしれません。しかし、癌^10、11、12および心血管障害¹³などのマニホールド疾患における変化した ev の存在、および血液および尿におけるそれらの容易なアクセス性は、それらを理想的にするバイオ マーカー。最後に、それらの良好な生体適合性¹⁴およびその固有のターゲティング能力は、薬物送達¹⁵についての EVs も興味深いものにする。本稿では、哺乳動物細胞由来の Ev の保存性を評価するためのプロトコールについて説明するが、未だ検討されていない重要な特性である。

Ev の臨床開発のために、彼らの治療効果、生産、精製、およびストレージ¹⁷の評価を含む¹⁶を乗り越えるために、まだ多くの障害があります。80° c は EV ストレージ¹⁸の金本位として広く見られているが、必要な冷凍庫は高価であり、生産から患者への要求されるコールドチェーンを維持することは困難である可能性がある。さらに、一部の報告では、-80 ° c のストレージはまだ最適に EVs を保持していないし、ev 機能^19、20の損失を誘導することを示しています。凍結乾燥^21、22 、または噴霧乾燥²³などの他の方法が、ev の冷凍保存に潜在的な代替物として提案されている。

貯蔵安定性を評価する最適な方法は、機能アッセイまたは特定のマーカーの評価 (例えば、それらの抗菌活性¹⁹) で EVs をテストすることであろう。これは、小胞の所望の効果が知られており、EVs の1つの異なるグループが検討されるときに可能です。異なる細胞源からの EVs を比較する場合 (例えば、薬物封入のため)、または既知の機能的読み出しがない場合、ストレージによる変化を直接的に評価することはもはや不可能である。

一方、最近の特許²⁰で示されているように、単にサイズ、粒子回収、タンパク質濃度などの物理化学的パラメータの変化を評価するだけでは、EV 活性の変化を予測するとは限らない。

ここでは、EVs の貨物のためのサロゲートとしてカプセル化されたβ-グルクロニダーゼ酵素の活性と組み合わせるそれらの物理化学的パラメータを評価することにより、EVs の保存安定性を測定するための容易に適用可能なプロトコルを提供します。酵素の装填はサポニンインキュベーションによって行われ、異なる供給源^21、24、25から EVs を用いて確立される穏やかな方法である。サポニンは、EV 膜中の一過性の細孔を形成し、小胞への酵素取り込みを可能にする。不利な保管条件にさらされた場合、酵素はその活性を失う傾向があるので、それらは EVs の機能的な貨物の保存の評価のための理想的サロゲートです。

我々は、ヒト間葉幹細胞 (MSCs)、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVECs)、およびヒト腺癌肺胞上皮細胞 (A549) 由来の EVs へのこのプロトコルの適用が実際に大きな差異をもたらすことを実証した。異なる細胞株間の貯蔵安定性は、EV ソース²¹を選択する際に考慮されるべきである。

プロトコル

1. 細胞培養と細胞馴化培地の製造

1. 一般に、それぞれの細胞株に必要な個々の条件下で細胞を培養する。
2. 無血清条件下または EV 枯渇胎児ウシ血清 (FBS) を含む培地中で24-72 の細胞を培養する。
   注: EV 枯渇 FBS を使用する場合、血清を効率よく枯渇させることが証明された方法を採用し、ウシ血清由来 EVs²⁶による汚染を防止する。
3. フラスコから培地を回収する。10分間 300 x gで遠心分離し、細胞をペレットにする。ペレット化された細胞を乱すことなく、慎重に細胞調節培地 (CCM) を収集します。好ましくは、CCM を直接使用したり、4° c で一晩保存したりする。
   注: 新鮮な生産された CCM を使用することが常に好ましいです。長期間の保管を回避できない場合は、関連するすべてのパラメータを MISEV2018 ガイドライン²⁶に従って記録し、得られた結果の潜在的なバイアスを考慮に入れる必要があります。
4. HUVECs のプロトコルの例
   1. FBS および他のサプリメントを含む EGM-2 培地中で 120 h の HUVEC 細胞を培養する。
   2. EBM-2 基礎培地中の任意の追加のサプリメントのない 48 h の HUVEC 細胞を培養します。.
   3. フラスコから培地を回収し、上記に示したように遠心分離ステップを行う (ステップ 1.3)。通常は、1つの EV 分離に 100 mL の培地を使用します。

2. CCM の超遠心よる

1. 超遠心よる (UC) の直前に、3000 x gおよび4° c で15分間、CCM を遠心分離して、細胞破片と大きな凝集体を除去します。
2. 慎重に上清を UC チューブに移します。固定角度ローターを使用している場合は、遠心分離機のチューブの向きをマークして、UC 後の EV ペレットの取り出しを容易にします。12万 x gで2時間遠心分離し、k ファクターの259.4 を用いた。
3. UC の後に、血清学的 pipet を使用して上清を慎重に廃棄し、ペレット化された Ev の乱れを回避する。
   注: ペレットは非表示になっている可能性があります。
4. 1番目のチューブに0.2 μ m のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 μ l を加え、PBS と残留上澄みを使用してペレットを上下にピペットで再懸濁します。得られた EV 懸濁液をそれぞれのサンプルの次のチューブに移し、再懸濁に使用します。この方法を進めて、サンプルのすべての Ev を、約300-350 μ l の最終容量に再懸濁ます。
5. 再懸濁後、ナノ粒子追跡分析 (NTA) によって粒子の存在を確認する。以下の設定など、特定の EV タイプに最適化された設定を使用します (ステップ 2.5.1)。
   注意: ガーディナー et al.²⁷および Vestad et al.²⁸の論文には、ev を測定するためのパラメータを最適化する方法に関する貴重な情報が含まれている。
   1. 以下に説明する結果を再現するために、グリーンレーザーを搭載した器具 (例えば、NanoSight LM14) を使用する。1.0 の画面ゲインと13のカメラレベルで30秒の3つのビデオを記録します。分析には、1.0 の画面ゲインと検出しきい値5を使用します。
6. 可能であれば、ペレットをすぐに使用してください。それ以外の場合は、一晩4° c で保管してください。

3. Ev へのグルクロニダーゼカプセル化

1. 再懸濁したペレットに、1.5 mg/mL の最終濃度にβ-グルクロニダーゼ (PBS 中 10mg/mL) を加え、0.1 mg/mL の最終濃度にサポニン (h2o で 10Mg/ml) を加える。3 s のボルテックスでよく混ぜる。
2. チューブを静かにフリックして、連日混合して室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって直接精製する (第5項参照)。
   注: 凍結による酵素の劣化を防ぐため、解凍後にグルクロニダーゼサンプルを refreeze しないでください。

4. リポソーム生産

1. Ev との比較のためにリポソームを調製するには、1, 2-dimyristoyl-glycero-3-ホスホコリン (DMPC) と 1, 2-ジパルミトイルヒドロキシプロリン-GLYCERO-ホスホコリン (DPPC) クロロホルム中の2:3 モルの割合で、最終濃度5mm を溶解する。高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) バイアルに 1 mL アリコートを準備し、一晩乾燥させて脂質膜を形成します。
   注意: クロロホルムは毒性があり、cancerogenic が疑われます。取り扱いに際しては、適切な予防措置を講じます。
2. 1.5 mg/mL グルクロニダーゼを含む PBS 1 mL で脂質膜を水分補給する。42° c に加熱し、1分間渦をして押出機アセンブリを42° c に加熱し、200 nm のポリカーボネート膜を通して脂質懸濁11x を押し出します。SEC によって直接浄化されます (セクション5を参照)。

5. SEC による浄化

1. 次のプロトコルを使用して SEC 列を準備します。
   1. 新鮮な精製水と新しく調製した緩衝液のみを使用してください。0.2 μ m の膜フィルターを通してすべてのバッファーを濾過し、カラム内の気泡の形成を防ぐためにそれらを脱気します。
   2. SEC カラムの調製には、アガロースゲル濾過ベースのマトリックス (例えば、セファロース Cl-2b) または別の SEC 媒体を使用して、タンパク質の不純物および過剰な酵素から EVs とリポソームを分離するのに適しています。まず、培地が保存されている 20% Etoh 中溶液を取り出し、カラム内の気泡形成を防止する。このため、SEC 培地を 3000 x gに10分間遠心し、etoh 中を除去し、脱気水に交換します。
   3. (内径 10 mm) のガラス柱に、SEC 培地を 15 mL マークに充填します。
      注: 異なる寸法のカラムでは、ボリュームが異なります。ジェルが完全に落ち着くようにしてください。
   4. ランの前に、平衡化は PBS の少なくとも2つのカラム量を持つカラムを使用します。カラムを保存するには、まず1列の水量で洗浄し、その後に 20% の Etoh 中の少なくとも2つのカラム容量を続けます。保管後、PBS で平衡化する前にカラムを1列の水で最初に洗ってください。
   5. 1回の分離で最大400μ l の EV またはリポソーム懸濁液を使用できます。1Ml の端数を収集します。SEC の後、精製された EVs を保存するか (セクション7を参照)、またはそれらをグルクロニダーゼアッセイに適用します (セクション6を参照)。
2. EVs とリポソームの混入タンパク質と遊離グルクロニダーゼの分離を確認します。この目的のために、収集されたフラクションの粒子濃度をタンパク質濃度およびグルクロニダーゼ活性と相関させる。
   1. NTA による粒子濃度の評価 (2.5 を参照)
   2. Bicinchoninic 酸 (BCA) アッセイまたは別の適切なタンパク質定量アッセイによってタンパク質含有量を評価します。メーカーのプロトコルに従ってアッセイを行ってください。
   3. グルクロニダーゼアッセイによってグルクロニダーゼ活性を評価します (セクション6を参照)。
3. 必要に応じて、透過型電子顕微鏡 (TEM) および走査電子顕微鏡 (SEM) により EV 形態を評価する。
   1. TEM サンプルの調製のために、10μ l の EV 懸濁液を TEM グリッドに添加し、10分間インキュベートし、次いで、濾過紙を使用して余分な液体を除去する。10μ l の 4% パラホルムアルデヒドで10分間固定を行い、過剰をブロットします。水で3倍洗ってください。1% 蛍光体-tungstic 酸ハイドレートの30μ l で 20 s インキュベーションすることにより小胞を染色する。過剰を吸い取り、一晩で小胞を乾かす。TEM で可視化する。
      注意: ホスホ-tungstic 酸は高度に苛性です。したがって、皮膚や目を保護します。
   2. SEM の場合は、あらかじめ用意されていた TEM サンプルをカーボンディスク上に固定し、50 nm 厚の金層でスパッタします。SEM による視覚化。

6. グルクロニダーゼアッセイ

1. 粒子数と酵素活性とを相関させることによって異なるサンプルと貯蔵条件との間の比較を可能にするために、まず NTA による試料の粒子濃度を測定する (ステップ2.5 を参照)。
2. フルオレセイン-β-D-グルクロニドの実用的なソリューションを調製する化合物の1μ l (H2o/mL で 10ML) PBS の199μ l を添加します。この溶液の25μ l を精製 EVs の125μ l に加え、8.3 μ g/mL の最終濃度を得る。サンプルを黒の96ウェルプレートに Pipet ます。480 nm を励起と 516 nm を発光波長として使用し、プレートリーダーで時間点 0 h を測定します。
3. 蒸発を最小限に抑え、37° c で 18 h の暗所でインキュベートするために、プレートをしっかりと覆います (例えば、PCR プレートに使用される透明なプラスチック箔で)。ステップ6.2 にリストされているプレートリーダーのパラメータを使用して、フルオレセイン生産を測定します。

EVs およびリポソームの貯蔵

注: すべての保管目的のために、吸着による EV 損失を低減するために、低結合チューブを使用することをお勧めします。

1. 以下の代表的な結果を再現するには、このセクションのパラメータに従ってください。400μ l の EV 懸濁液からなるサンプルを使用します。
   1. 4° c または-80 ° c で保管するか、下記の手順に進んでください。
   2. Ev を Lyophilize。
      1. 最後の濃度 4 mg/mL までのトレハロース (40 Mg/Ml の h2o) を精製された ev に添加します。サンプルを1時間以上-80 ° c で凍らせます。
      2. 次のパラメータを使用してサンプルを Lyophilize します。主乾燥のために、棚温度を15° c に設定し、圧力 0.180 mbar に 46 h のために乾燥するためにサンプルを残してください。最終的な乾燥のためには、棚温度を25° c に、圧力を 0.0035 mbar に設定し、サンプルを2時間乾燥させたままにしておきます。凍結乾燥したサンプルを4° c で保管してください。
      3. サンプルを水分補給するには、最初に存在する EV 懸濁液の量 (通常は400μ l) に等しい h2o を追加します。水分補給のためにバッファを使用しないでください。

8. 保管後の分析

1. 酵素活性を評価するために、まず、貯蔵中に EVs から漏出した可能性のある遊離グルクロニダーゼを除去する。SEC (ステップ5参照) または非対称フローフィールドフロー分別 (AF4) によって行われる精製の追加ステップによってこれを達成してください (ステップ8.1.2 を参照)。
   注: 両方の方法は、EV サンプルの希釈につながることをお勧めします。したがって、NTA 定量化限界を下回るのを避けるために、保管前に十分な EV 濃度を使用してください。秒または AF4 による粒子の1:10 希釈を期待してください。
   1. SEC の精製については、前述のプロトコルに従ってください (セクション5を参照)。
   2. AF4 精製を行う。
      1. 350μ m スペーサーと 30 kD 分子量カットオフセルロース膜を備えた小型チャンネルを使用して装置をセットアップします。HPLC ポンプと AF4 チャネルの間に0.1 μ m の細孔サイズフィルターを設置します。新規に調製した0.1 μ m フィルタ PBS を移動相として使用し、光散乱検出器の粒子負荷とノイズを低減します。
      2. 280 nm に設定された UV 検出器を使用してタンパク質を検出します。粒子を検出するには、レーザーを 658 nm に設定したアングル光散乱を使用します。
      3. 次の run メソッドを使用します。1ミリリットル/分のフォーカスフローで1分間プレフォーカス;その後、0.2 mL/min のレートでサンプルの300μ l を注入し、焦点フローを10分間維持します。注射後、8分間にわたって 2 mL/min から 0.1 mL/min に減少するクロスフローを適用しながら、1 mL/min でサンプルを溶出します。クロスフローなしでさらに10分溶出します。12.5 分後に開始し、27分まで継続1ml の端数を収集します。
   3. 上述のようにグルクロニダーゼアッセイを実施する (第6項参照)。
2. サイズおよび濃度を評価するために、上述のように NTA を使用する (ステップ2.5 を参照)。
3. 任意に、貯蔵後の Ev の形態を評価するために TEM および SEM を実行する (5.3 を参照のこと)。

結果

図 1は、HUVECs から分離された EVs のストレージ特性を示しています。EVs は、UC によって単離され、グルクロニダーゼは封入され、SEC の後、精製された EVs は NTA による物理化学的特性の評価を受けました。小胞のサンプルをその後 AF4 精製に供し、グルクロニダーゼ活性を測定した。

次いで、小胞体を4° c または-80 ° c で 7 d、凍結乾燥形態で4° c で保存し、?...

ディスカッション

本稿では、異なる貯蔵条件下での Ev の安定性を研究するための包括的なプロトコルを紹介する。機能読み出しと EVs の物理化学的なパラメータの評価としてカプセル化されたグルクロニダーゼの組み合わせにより、プロトコルは、EVs の簡単な保存安定性評価と異なるセルからの EVs の比較を可能にします行。SEM および TEM は相補的な方法として、単粒子レベルでの EVs の変化についての洞察?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks	Corning	431082	Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane	Wyatt Technology Europe	1854
350 µm spacer	Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Chloroform	Fisher scientific	C/4966/17
Column oven	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector	Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm	Merck	VVLP04700	Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162	Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers	R&D Systems	DY992	used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol	Fisher scientific	E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC	Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR international	525-0255	the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser	Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes	Whatman/GE Healthcare	110406	used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder	Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate	Sigma-Aldrich	79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Assay Kit	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM copper grids with carbon film	Plano	S160-4
Small AF4 channel	Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES	Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
UV detector	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter	Whatman/GE Healthcare	10401712	Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC