فحص الهجرة الصفر وغرفة الجلد السمرة لتحليل في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء الجروح

Summary

هنا، نقدم بروتوكول احتساء الصفر في المختبر باستخدام الخلايا الليفية الأولية ولإجراء اختبار التئام الجروح في الجلد في الجسم الحي في الفئران. كلا الاختبارين هما طريقتان مباشرتان لتقييم الجروح في المختبر وفي الجسم الحي.

Abstract

يعد ضعف التئام الجروح الجلدية مصدر قلق كبير للمرضى الذين يعانون من مرض السكري والمسنين، وهناك حاجة إلى علاج فعال. الملائمة في المختبر وفي الجسم الحي هي ضرورية لتحديد جزيئات الهدف الجديد لعلاج المخدرات لتحسين عملية التئام الجروح الجلدية. حددنا الوحدة الفرعية β3 من قنوات الكالسيوم المسورة بالجهد (Cavβ3) كجزيء هدف محتمل للتأثير على التئام الجروح في اختبارين مستقلين، أي فحص الهجرة الصفر في المختبر ونموذج غرفة الجلد في الجسم الحي الظهري. الخلايا الليفية الجنينية الأولية (MEFs) معزولة بشكل حاد عن الفئران البرية من النوع (WT) وCavβ3 نقص الفئران (Cavβ3 KO) أو الخلايا الليفية المعزولة بشكل حاد من الفئران WT المعالجة مع siRNA إلى أسفل تنظيم التعبير عن الجين Cacnb3 ، ترميز Cavβ3، تم استخدامها. تم تطبيق خدش على خلية أحادية اللون confluent وأعقب إغلاق الفجوة من قبل التقاط الصور المجهرية في نقاط زمنية محددة حتى إعادة السكان كاملة من الفجوة من قبل الخلايا المهاجرة. تم تحليل هذه الصور، وتم تحديد معدل ترحيل الخلايا لكل حالة. في فحص في الجسم الحي، زرعنا غرفة الجلد الظهرية على الفئران WT وCavβ3 KO، وتطبيق جرح دائري محدد من قطر 2 ملم، وغطت الجرح مع غطاء زجاجي لحمايته من العدوى والجفاف، ورصد إغلاق الجرح العيانية مع مرور الوقت. وكان إغلاق الجرح أسرع بكثير في Cacnb3-الفئران نقص الجينات. لأن نتائج الاختبارات في الجسم الحي والمختبر ترتبط بشكل جيد، قد يكون الفحص في المختبر مفيدة للفحص عالي الإنتاجية قبل التحقق من صحة الضربات في المختبر من قبل نموذج التئام الجروح في الجسم الحي. ما أظهرناه هنا للفئران أو الخلايا التي تعاني من نقص في البراري وCavβ3 قد ينطبق أيضًا على جزيئات محددة غير Cavβ3.

Introduction

يبدأ التئام الجروح الجلدية مباشرة بعد إصابة الجلد من أجل استعادة سلامة الجلد وحماية الكائن الحي من العدوى. عملية التئام الجروح تمر بأربع مراحل متداخلة. التخثر، التهاب، تشكيل الأنسجة الجديدة، وإعادة عرض الأنسجة^1. وهجرة الخلايا أمر بالغ الأهمية خلال هذه المراحل. يتم تنشيط الخلايا الالتهابية والخلايا المناعية والخلايا الكيراتينية والخلايا البطانية والخلايا الليفية في نقاط زمنية مختلفة وغزو منطقة الجرح². طرق التحقيق في التئام الجروح في المختبر وفي الجسم الحي هي ذات أهمية كبيرة ليس فقط لفهم الآليات الكامنة ولكن أيضا لاختبار أدوية جديدة ووضع استراتيجيات جديدة تهدف إلى تحسين وتسريع التئام الجروح الجلد.

لمراقبة وتحليل ترحيل الخلايا، يمكن استخدام فحص ترحيل الخدش. وغالبا ما يشار إليها باسم في المختبر التئام الجروح الاختبار. يتطلب هذا الأسلوب مرفق ثقافة الخلية³. وهو إجراء بسيط، ليست هناك حاجة للمعدات الراقية ويمكن إجراء الفحص في معظم مختبرات بيولوجيا الخلايا. في هذا الفحص، يتم إنشاء منطقة خالية من الخلايا عن طريق التعطيل الميكانيكي لخلية أحادية اللمعة، ويفضل أن تكون خلايا أو ليفية تشبه الظهارية أو البطانية. سيتم ترحيل الخلايا الموجودة على حافة الخدش من أجل إعادة ملء الفجوة التي تم إنشاؤها. والقياس الكمي للمنطقة الخالية من الخلايا المتناقصة مع مرور الوقت يشبه معدل الهجرة ويشير إلى الوقت الذي تحتاج إليه الخلايا لسد الفجوة. لهذا الغرض، يمكن للمحققين استخدام إما خلايا معزولة بشكل حاد من الفئران WT أو الفئران تفتقر إلى جين من الفائدة⁴، أو الخلايا الخالدة المتاحة من مستودعات الخلايا موثوق بها. يسمح تحليل الصفر بدراسة تأثير المركبات النشطة الدوائية أو تأثير cDNAs أو siRNAs على هجرة الخلايا.

في الجسم الحي، التئام الجروح هو عملية فسيولوجية معقدة، تتطلب أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الكيراتينية، الخلايا الالتهابية، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والخلايا البطانية من أجل استعادة السلامة البدنية للبشرة في أسرع وقت ممكن¹ . وقد وضعت طرق مختلفة للدراسة في التئام الجروح في الجسم الحي واستخدامها في الماضي^5و6و^7و8. غرفة الجلد الظهرية الموصوفة في هذه المقالة كانت تستخدم سابقا لالتئام الجروح الاختبارات⁹. يتم استخدامه كإعداد غرفة الجلد الظهرية المعدلة للفئران. نموذج غرفة skinfold المعدلة لديها العديد من المزايا. 1) أنه يقلل من تقلص الجلد، مما يمنع مراقبة عملية التئام الجروح، ويمكن أن تؤثر على إصلاح الجروح في الفئران. 2) هذه الغرفة يجعل من استخدام تغطية الجرح مع غطاء زجاجي، والحد من التهابات الأنسجة والجفاف، والتي يمكن أن تؤخر عملية الشفاء. 3) يمكن رصد تدفق الدم والأوعية الدموية مباشرة. 4) فإنه يسمح التطبيق الموضعي المتكرر للمركبات النشطة الدوائية والكواشف من أجل علاج الجرح وتسريع الشفاء^9،10.

حددنا الوحدة الفرعية β3 من قنوات الكالسيوم عالية الجهد المسورة (Cavβ3) كجزيء الهدف المحتمل للتأثير على التئام الجروح الجلد باستخدام بروتوكولين مستقلين، أي، في المختبر فحص الهجرة الصفر ونموذج غرفة الجلد في الجسم الحي الظهري. للاختبار في المختبر، استخدمنا الخلايا الليفية الأولية، وهذه الخلايا لا تعبر عن الجين Cacnb3 ترميز البروتين Cavβ3 ولكن تفتقر إلى إلغاء الاستقطاب الناجمعن Ca²⁺ تدفق أو التيارات Ca^{2 +} تعتمد على الجهد. وصفنا وظيفة جديدة من Cavβ3 في هذه الخلايا الليفية: Cavβ3 يربط إلى مستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفات (IP3R) والقيود الإفراج عن الكالسيوم من الشبكية endoplasmic. حذف الجين Cacnb3 في الفئران يؤدي إلى زيادة حساسية IP3R لIP3، وتعزيز هجرة الخلايا وزيادة إصلاح الجرح الجلد⁴.

Protocol

وتمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية وتنفيذها وفقا للوائح الأخلاقيات ولجان رعاية الحيوان في جامعة سارلاند وسارلاند.

1 [سلّ] أوّليّة ثقافة و [سرنا] [ترنسّكأيشن]

ملاحظة: في الأسلوب الموضح، يتم استخدام الخلايا الليفية الأساسية. هذه الخلايا تلعب دورا حاسما في التئام الجروح وإعادة عرض الأنسجة¹¹. في هذه التجربة، والجينات Cacnb3، ترميز Subunit Cavβ3 من قنوات الكالسيوم عالية الجهد المسور¹² كان أسفل التنظيم، وبالتالي تبين دورها في هجرة الخلايا في المختبر وإصلاح الجرح الجلد في الجسم الحي⁴.

1. إعداد siRNA: قبل إعادة تشكيل siRNAs، طرد مركزي لفترة وجيزة الأنابيب لضمان أن المحتوى هو في الجزء السفلي. إعادة تشكيل siRNAs في 100 ميكرولتر RNase خالية العازلة (100 Mخلات البوتاسيوم، 30 MM HEPES، درجة الحموضة 7.5) المقدمة من قبل الشركة المصنعة بتركيز 20 ميكرومتر. هذا هو حل الأسهم من siRNAs.
2. Aliquot هذا الحل الأسهم في 10 درجة مئوية لكل أنبوب (تركيز 20 درجة مئوية) وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. باستخدام علامة دائمة فائقة الدقة، ضع علامة على لوحة ذات 6 آبار مع خط أفقي في أسفل كل بئر من أجل أن تكون قادرة على تحديد نفس منطقة الصفر من الاهتمام ومتابعة إغلاقها.
   ملاحظة: تم استخدام لوحات الثقافة 6-well في هذا التحليل لأنها كبيرة بما فيه الكفاية، لتوفير مساحة كافية والمرونة لتطبيق ثابتة، استنساخ وخدش عمودي باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر عبر الخلية أحادية الطبقة. إذا كان هناك عدد محدود من الخلايا المتاحة، بديل وربما طريقة فعالة من حيث التكلفة هو استخدام لوحات الثقافة 12-أو 24 جيدا.
4. لوحة الخلايا الليفية الأولية، معزولة عن الفئران البرية وβ3 نقص⁴، في لوحة 6 جيدا في كثافة 5 × 10⁵ خلايا / جيدا في وجود 2 مل Dulbecco تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FCS).
   ملاحظة: تم تأسيس 5 × 10⁵ خلايا لكل بئر للوحة الثقافة 6-جيدا والخلايا الليفية الماوس الأولية. قد تكون هناك حاجة إلى إجراء اختبارات في حالة استخدام لوحات زراعة الخلايا 12 أو 24 بئرًا أو أنواع خلايا أخرى، والتي قد تكون مختلفة في الحجم. وينبغي التعامل مع الخلايا في بيئة معقمة مثل خزائن السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.
5. قم بتسمية لوحة 6-well مع نوع الخلية والنمط الجيني والتاريخ.
6. نقل لوحة 6-جيدا في حاضنة ثقافة الخلية والحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة.
7. في اليوم التالي، تأخذ لوحة للخروج من الحاضنة، يستنشق وسط ثقافة الخلية للخروج من البئر، وتجاهل ذلك واستبداله او استبداله بـ 2.25 مل وسط الثقافة الطازجة بإضافته بعناية ضد جدار البئر.
8. من أجل نقل الخلايا الليفية مع siRNAs، استخدم كاشف الانف اللامفيد القائم على الدهون على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
9. لكل التغوط، تسمية اثنين من أنابيب الطرد المركزي الجزئي. في أول واحد، إضافة 9 ميكرولتر من كاشف التغوط وتخفيف مع 150 درجة مئوية خفض المصل المتوسطة. في الأنبوب الثاني، إضافة 1.5 ميكرول سيرنا(Cacnb3 siRNA-1، Cacnb3 siRNA-2 أو siRNA سارعت كسيطرة سلبية) وتخفيف مع 150 درجة مئوية خفض المصل المتوسطة.
10. يُضاف السيرنا المخفف إلى الأنبوب الذي يحتوي على كاشف مُخفّف للانفال ودوامة لمدة 2 ثوان.
11. تسمية الآبار مع إما Cacnb3 siRNA-1، Cacnb3 siRNA-2 أو siRNA سارعت. إضافة 250 درجة مئوية من خليط الكاشف siRNA-transfection إسقاط إلى الخلايا.
12. ضع لوحة الثقافة 6-well مرة أخرى في الحاضنة والحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 72 ساعة.
13. من أجل التحقق من كفاءة الإسكات الجينات Cacnb3، وجمع الخلايا المنقولة وإجراء تحليل المناعية كما هو موضح سابقا⁴.

1. إخراج لوحة ثقافة الخلية من الحاضنة وفحص الخلايا تحت المجهر باستخدام الهدف 10X. ابدأ بـ "الخدش" فقط عندما يصل إلى 100% من الملاءمة.
   ملاحظة: للتأكد من الدقة والتكرار، 100% الملاءمة عامل إلزامي لبدء اختبار ترحيل الصفر. لذلك، من المهم أن بذر نفس العدد من الخلايا في الآبار الثقافة، لفحص كل بئر للتزامن وتطبيق الصفر في نفس الوقت نقطة (اليوم 0 الملاءمة). الانتظار لفترة أطول بعد الخلايا تصل إلى 100٪ من الملاءمة يمكن أن تثير استجابات مختلفة.
2. بمجرد أن تصل الخلية إلى الملاءمة 100٪، يستنشق وسط الثقافة من البئر ويتجاهله.
3. استخدم طرف ماصة (200 درجة مئوية) لإنشاء عمودي للخدش يدويًا إلى الخط الأفقي الذي تم وضع علامة عليه في أسفل البئر، عبر الطبقة الأحادية للخلايا المتجانسة في منتصف البئر.
4. شطف كل جيدا مرتين مع 2 مل الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) (137 مل خط البحر، 2.7 مل كيلو كل، 1.5 م/ KH₂PO_4،8.1 مليون متر Na₂HPO_4،درجة الحموضة 7.4) لإزالة العوامل المفرج عنها من الخلايا التالفة، والخلايا السائبة، والحطام من المنطقة خدش. إضافة 2 مل من PBS بعناية ضد جدار البئر لتجنب فصل الخلايا من ثقافة الخلية بشكل جيد.
5. إضافة 2 مل من خلية ثقافة المتوسطة التي تحتوي إما 10٪ المصل أو 1٪ المصل بعناية إلى كل بئر.
   ملاحظة: من المستحسن إجراء تحليل الصفر تحت المصل 10٪ وتحت المصل 1٪ للتأكد من أن التأثير الملاحظ هو سبب انتشار الخلايا والهجرة أو عن طريق هجرة الخلايا فقط.
6. نقل لوحة إلى مرحلة المجهر والتقاط الصور الميدانية مشرق من منطقة خالية من الخلايا (منطقتين لكل بئر) مباشرة بعد الخدش (t = 0h) في التكبير 10X باستخدام المجهر الخفيف. لتصوير نفس المنطقة من الصفر دائما، استخدم الخط الأفقي، الذي تم إعداده في الخطوة (1.3)، وخذ صورة واحدة فوق هذا الخط وصورة واحدة أسفل هذا الخط. حفظ الصور كـ TIFF أو JPEG.
7. لأن مرحلة المجهر لا تحافظ على حالة نمو الخلية، نقل لوحة مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية والحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO_2.
8. بعد 6 و 10 و 30 ساعة، حرك اللوحة إلى مرحلة المجهر مرة أخرى والتقط الصور بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 2.6.
   ملاحظة: تم إنشاء هذه النقاط الزمنية للإجراء الموضح وللالخلايا الليفية الأولية. خلال التجربة التجريبية الأولى، تم اختبار المزيد من النقاط الزمنية لمعرفة مدى سرعة الخلايا الليفية في إعادة ملء الفجوة. على الرغم من أن 0 و 6 و 10 و 30 ساعة هي نقاط وقت بدء معقولة، يجب على المحققين تحسين وتحديد النقاط الزمنية المناسبة لكل تطبيق ولكل نوع من أنواع الخلايا. والبديل الأكثر دقة، إذا كان متاحا، هو استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني.
9. باستخدام ImageJ^13،قم بتحديد المنطقة الأولية الخالية من الخلايا (100%). والمنطقة المتبقية بعد 6 و 10 و 30 ح(الشكل 1). ثم يتم حساب النسبة المئوية لمنطقة الخدش التي أعيد تعبئتها بواسطة الخلايا المهاجرة بالنسبة لمنطقة الخدش الأولية.

3. تحليل منطقة الصفر

1. فتح ImageJ البرمجيات¹³.
2. قم بتحميل الصورة الأولى كـ JPEG (على سبيل المثال، صور RGB 24 بت 1360x1024) عن طريق إسقاط الصورة في شريط القوائم ImageJ.
3. حدد زر التحديدات الحرة ووضع علامة على المنطقة الخالية من الخلايا
4. انقر على تحليل وحدد قياس. ستظهر نافذة تحتوي على النتائج تحتوي على قيمة المنطقة.
5. نقل هذه القيمة إلى جدول بيانات تحليل.
6. كرر الخطوات 3.2-3.5 لكل صورة من نقطة زمنية 0 ساعة ثم ابدأ مرة أخرى للمرة القادمة نقاط 6 و 10 و 30 ساعة.
7. حساب النسبة المئوية لمنطقة الخدش المعاد تعبئتها بواسطة الخلايا المهاجرة بعد 6 و10 و30 ساعة لكل خدش باستخدام المعادلة التالية:
   
   أ = منطقة خالية من الخلايا من الصفر الأولي، ب = منطقة خالية من الخلايا بعد 6 ساعة
8. حساب متوسط والخطأ القياسي للمتوسط (S.E.M.) للنسبة المئوية لمنطقة الخدش التي تمت إعادة تعبئتها بواسطة الخلايا المهاجرة بعد 6 ح. إظهار البيانات كرسم بياني لشريط الأعمدة أو رسم مبعثر.

4. في الجسم الحي الجلد التئام الجروح التئماف الدراسة

ملاحظة: C57BL/6 الذكور من النوع البري (8-12 أسابيع من العمر مع 22-26 غرام من وزن الجسم) وتستخدم الفئران Cavβ3 ناقص كعنصر تحكم لهذه الدراسة.

1. قبل يوم واحد من بدء التجربة، الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية، ومسامير، والمكسرات وإطارات التيتانيوم لاستخدامها في إعداد غرفة skinfold.
   ملاحظة: يتكون إطار التيتانيوم من نصفين متكاملين متماثلين ويحتوي على نافذة مراقبة دائرية حيث سيتم تطبيق الجرح ويتبعه الفحص المجهري (انظر الشكل 2أ).
2. التخدير الفأر البري أو β3 ناقص (22-26 غرام من وزن الجسم) عن طريق حقن داخل الصفاق (i.p.) من 0.1 مل ملحي /10 غرام من وزن الجسم يحتوي على خليط من الكيتامين (75 ملغ / كغ من وزن الجسم) وxylazine (25 ملغ / كغ من وزن الجسم). تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة اصبع القدم.
   ملاحظة: هذه الحقنة يعطي حوالي 30 دقيقة التخدير الجراحي ويجب التحكم في عمق التخدير من خلال العملية الجراحية، عن طريق التحقق من ردود الفعل من الماوس.
3. لتجنب جفاف أو تلف العينين ، ضع مرهم العيون على كلتا العينين وكرر التطبيق إذا لزم الأمر.
4. حلاقة بعناية dorsum الماوس، وذلك باستخدام حلاقة كهربائية تليها تطبيق كريم إزالة الشعر إلى منطقة حلق لإزالة أي الشعر المتبقية. الحرص على عدم إصابة الجلد الماوس. اترك كريم إزالة الشعر لمدة 10 دقائق لإزالة جميع الشعر بالكامل.
5. إعداد غرفة التيتانيوم عن طريق اتخاذ جزء واحد من إطار غرفة التيتانيوم متناظرة وإصلاح مسامير ربط مع المكسرات على جانب واحد. هذه المكسرات ستكون بمثابة فاصل للحفاظ على 400-500 ميكرومتر بين الجزأين متناظرة من الغرفة لتجنب ضغط الأوعية الدموية في الجلد.
6. إزالة كريم من الجزء الخلفي من الماوس وتنظيف المنطقة خالية من الشعر مع المياه الدافئة (35-37 درجة مئوية).
7. تأكد من أن مكان إجراء الجراحة نظيف ودافئ (37 درجة مئوية) ورطب.
8. تطهير منطقة خالية من الشعر من الماوس مع مطهر الجلد. تأخذ أضعاف الجلد الخلفي للماوس أمام مصدر الضوء ووضع الخط الأوسط للطبقة المزدوجة من الجلد حيث سيتم زرع غرفة التيتانيوم. بعد ذلك، إصلاح الجلد مع خياطة البولي بروبلين القحفي وcaudally وتشديد الجانب الآخر من خياطة على رف معدني لرفع الجلد مطوية الماوس. ضبط ارتفاع الرف للسماح للماوس للجلوس بشكل مريح.
9. زرع غرفة التيتانيوم في أضعاف الجلد الخلفي للماوس بطريقة لساندويتش طبقة الجلد الظهرية مطوية بين النصفين متناظرة من إطار التيتانيوم. قم بإرفاق النصف الأول من إطار التيتانيوم بواسطة غرز البولي بروبلين على أطرافه الفائقة إلى الجزء الخلفي من الجلد الظهري.
   ملاحظة: على إطار التيتانيوم، هناك 8 ثقوب على حافة متفوقة(الشكل 2أ)والجلد مطوية ينبغي أن تكون ثابتة بشكل جيد من قبل الغرز البولي بروبلين على كل من الثقوب الثمانية.
10. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تحقق من ردود فعل الماوس للتأكد من الحفاظ على عمق التخدير.
11. في قاعدة الجلد، وتمرير اثنين من مسامير ربط، تعلق على النصف الأول من غرفة التيتانيوم، لاختراق الجلد من الخلف إلى الجانب الأمامي. جعل شقوق صغيرة على الجلد (باستخدام مقص غرامة) للمساعدة في اختراق سلس من مسامير الاتصال.
12. فصل الماوس من الرف ووضعه على موقف جانبي. وضع النصف التكميلي الثاني من غرفة التيتانيوم على رأس مسامير ربط 3 (انظر الشكل 2أ)وتطبيق ضغط طفيف مع الأصابع من أجل تمرير هذه مسامير من خلال النصف الثاني من إطار التيتانيوم. ثم، إصلاح كل من أجزاء متناظرة مع المكسرات الفولاذ المقاوم للصدأ.
13. إيلاء اهتمام دقيق لضيق مسامير في هذه الخطوة، لأنه قد فصل، إذا كان فضفاضا جدا. على النقيض من ذلك، إذا كان ضيقا جدا، فإنه سيتم الضغط على الجلد، والحد من تدفق الدم ويمكن أن يؤدي إلى ضعف الأنسجة ونخر.
    ملاحظة: المكسرات المعدة في الخطوة 4.5 بمثابة فاصل للحفاظ على مسافة 400-500 ميكرومتر بين النصفين متناظرة من غرفة التيتانيوم. يجب تشديد المكسرات حتى يشعر مقاومة طفيفة.
14. قطع الجزء المتبقي من مسامير باستخدام كماشة.
    ملاحظة: من الضروري في هذه الخطوة لاستخدام نظارات السلامة المختبرية لحماية العين في حالة المسمار يأتي قبالة الطريق الخطأ.
15. وضع علامة على منطقة الجرح بواسطة لكمة خزعة موحدة (2 مم في القطر)، في وسط الجلد داخل نافذة المراقبة (انظر الشكل 2أ)من غرفة الجلد من أجل ضمان أحجام الجرح القابلة للاستنساخ.
16. باستخدام ملقط غرامة ومقص، وخلق جرح دائري داخل المنطقة ملحوظ عن طريق إزالة الجلد الكامل مع البشرة والأدمة. وستكون منطقة الجرح النهائي حوالي 3.5-4.5 مم^2،انظر الشكل 2ب. تنظيف الجرح مع 0.5 مل محلول ملحي معقم (0.9٪ حمض الهيدروكلوريك، 37 درجة مئوية).
17. قم بتغطية الجرح بغطاء زجاجي وأصلح غطاء زجاجي هذا مع حلقة سريعة باستخدام الزمة الحلقية المفاجئة على غرفة التيتانيوم.
18. مباشرة بعد الانتهاء من العملية الجراحية، وضع الماوس على مرحلة التصوير من مجهر مجسم مجهزة بكاميرا واتخاذ الصور (اليوم 0) تحت الإضاءة. استخدم التكبير 40X وحفظ الصور لتحليل هافير خارج الخط في المستقبل.
    ملاحظة: ينبغي للمحقق أن يفحص الصور فور التقاطها للتأكد من أن الجودة كافية لإجراء تحليلات غير مباشرة في المستقبل. إعداد غرفة الجلد وأداء جرح الجلد يستغرق حوالي 30 دقيقة.
19. إبقاء الماوس في مكان دافئ أثناء الانتعاش من التخدير لمدة 2 ساعة على الأقل. بعد ذلك، نقل الفئران في أقفاص فردية مرة أخرى إلى مرفق الحيوان (12 ساعة ضوء / دورة مظلمة) والتأكد من أن الفئران لديها إمكانية الحصول على الغذاء والماء.
20. ثلاثة أيام بعد الجرح وضع الماوس في تقييد الماوس وإصلاح restrainer على رأس مرحلة التصوير.
21. ضع المسرح تحت مجهر مجسم مجهز بكاميرا. التقاط الصور تحت الإضاءة مع التكبير 40X، وتسجيل جميع الصور وحفظها للتحليلات خارج الخط في المستقبل
22. كرر الخطوتين 4.20 و 4.21 مرة أخرى في اليوم 6 و 10 و اليوم 14 بعد الإصابة.
23. استخدام صور الجرح، لتحليل خارج الخط في ImageJ¹³. تعتبر منطقة الجرح في اليوم 0 100٪ ويتم رسم إغلاق الجرح مع مرور الوقت بالنسبة لمنطقة الجرح الأولي. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 2ج(د).
24. حساب النسبة المئوية (%)( منطقة الجرح في كل نقطة زمنية باستخدام المعادلة التالية:
    
    x: نقطة زمنية (اليوم 0 أو 3 أو 10 أو 14): منطقة الجرح في اليوم 0 ب:منطقة الجرح في نقطة زمنية x

النتائج

وقد أجري هذا التخدش على طبقة أحادية من الخلايا المتجانسة من نوع البرية وناقصة β3(الشكل 1ج). بعد إجراء "الصفر" باستخدام طرف ماصة 200 μL، تنتقل الخلايا من كلا النمطين الجيني إلى منطقة الصفر وتسد الفجوة. وقد التقطت الصور بعد 6 و 10 و 30 ح(الشكل 1أ). تم ...

Discussion

في هذه المخطوطة، نصف دراسة في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء من الجروح وربط النتائج التي تم الحصول عليها. للفحص في المختبر، استخدمنا الخلايا الليفية الماوس الأولية^4،14،15 التي تلعب دورا هاما في التئام الجروح وإعادة عرض الأنسجة^11.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % NaCl
1 ml syringes	BD Plastipak	303172
6 well plate	Corning	3516
Biopsy punch	Kai Industries	48201	2 mm
Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)	Origene	SR415626
Depilation cream			any depilation cream
Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)	Bayer	3400935940179.00	(BEPANTHEN)
Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)	Bayer Health Care		Rompun 2%
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by life technologies	41966-029
Fetal bovine serum	Gibco by life technologies	10270-106
Hexagon full nut
Ketamine hydrochloride	Zoetis		KETASET
Light microscope	Keyence, Osaka, Japan	BZ-8000	Similar microscopes might be used
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	13778075
Micro-forceps
Micro-Scissors
Mouse restrainer	Home-made
Normal scissors
Objective	Nikon	plan apo 10x/0.45
Opti-MEM	Gibco by life technologies	51985-026
Polypropylene sutures
Screwdriver
Skin disinfectant (octeniderm)	Schülke & Mayr GmbH	118212
Slotted cheese head screw
Snap ring
Snap ring plier
Surgical microscope with camera	Leica	Leica M651
Titanium frames for the skinfold chamber	IROLA	160001	Halteblech M
Wire piler