Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.

Resumo

A cicatrização de feridas cutâneas prejudicada é uma grande preocupação para os pacientes que sofrem de diabetes e para pessoas idosas, e há a necessidade de um tratamento eficaz. Abordagens in vitro e in vivo apropriadas são essenciais para a identificação de novas moléculas-alvo para tratamentos medicamentoso para melhorar o processo de cicatrização da ferida cutânea. Nós identificamos o subunidade β3 de canaletas tensão-fechados do cálcio (cavβ3) como uma molécula potencial do alvo para influenciar a cura da ferida em dois ensaios independentes, isto é, o ensaio in vitro da migração do risco e o modelo in vivo da câmara de dobra cutânea dorsal. Os fibroblastos embrionários do rato preliminar (MEFs) isolados aguda do selvagem-tipo (WT) e os ratos 3-deficientes de CAVβ(CAVβ3 ko) ou os fibroblasto isolados aguda dos ratos do WT trataram com o siRNA para baixo-regulam a expressão do gene Cacnb3 , foi utilizada a codificação CAVβ3. Um risco foi aplicado em uma monocamada de pilha confluente e o fechamento da abertura foi seguido tomando imagens microscópicas em pontos definidos do tempo até o repovoamento completo da abertura pelas pilhas migrando. Essas imagens foram analisadas e a taxa de migração da célula foi determinada para cada condição. Em um ensaio in vivo, implantamos uma câmara de dobra cutânea dorsal nos camundongos WT e Cavβ3 KO, aplicou uma ferida circular definida de 2 mm de diâmetro, cobriu a ferida com uma lamínula de vidro para protegê-la de infecções e dessecações, e monitorou o fechamento da ferida macroscópica ao longo do tempo. O fechamento da ferida era significativamente mais rápido em Cacnb3-ratos gene-deficientes. Como os resultados dos ensaios in vivo e in vitro se correlacionam bem, o ensaio in vitro pode ser útil para a triagem de alta produtividade antes de validar os acertos in vitro pelo modelo in vivo de cicatrização de feridas. O que mostramos aqui para camundongos ou células com deficiência de tipo selvagem e CAVβ3 pode também ser aplicável para moléculas específicas que não sejam Cavβ3.

Introdução

A cicatrização da ferida cutânea começa imediatamente após a lesão cutânea, a fim de restaurar a integridade da pele e proteger o organismo contra infecções. O processo de cicatrização de feridas atravessa quatro fases de sobreposição; coagulação, inflamação, nova formação tecidual e remodelação tecidual¹. A migração celular é crucial durante essas fases. Células inflamatórias, células imunes, queratinócitos, células endoteliais e fibroblastos são ativados em diferentes pontos temporais e invadem a área da ferida². Métodos para investigar a cicatrização de feridas in vitro e in vivo são de grande interesse não só para compreender os mecanismos subjacentes, mas também para testar novas drogas e desenvolver novas estratégias visando melhorar e acelerar a cicatrização da ferida cutânea.

Para monitorar e analisar a migração de células, o ensaio de migração de arranhões pode ser usado. É frequentemente referido como ensaio de cicatrização de feridas in vitro. Este método requer um recurso de cultura de célula³. É um procedimento simples, não há nenhuma necessidade de equipamento high-end e o ensaio pode ser executado em a maioria de laboratórios da biologia da pilha. Neste ensaio, uma área livre de células é criada pelo rompimento mecânico de uma monocamada de células confluentes, preferencialmente células epiteliais ou endoteliais ou fibroblastos. As células na borda do arranhão migrarão para preencher novamente a lacuna criada. A quantificação da área livre de células decrescentes ao longo do tempo assemelha-se à taxa de migração e indica o tempo, que as células precisam para fechar a lacuna. Para esta finalidade, os investigadores podem usar pilhas aguda isoladas dos ratos ou dos ratos do WT que faltam um gene do interesse⁴, ou pilhas imortalized disponíveis dos repositórios de pilha de confiança. O ensaio de risco permite estudar a influência de compostos farmacologicamente ativos ou o efeito de cDNAs transfected ou siRNAs na migração celular.

In vivo, cicatrização de feridas é um processo fisiológico complexo, exigindo diferentes tipos de células, incluindo queratinócitos, células inflamatórias, fibroblastos, células imunes e células endoteliais, a fim de restaurar a integridade física da pele o mais rápido possível¹ . Diferentes métodos para estudar in vivo cicatrização de feridas foram desenvolvidos e utilizados nos últimos^5,6,8. A câmara de dobras cutâneas dorsal descrita neste artigo foi utilizada anteriormente para ensaios de cicatrização de feridas⁹. É usado como uma preparação de câmara de dobra cutânea dorsal modificada para camundongos. O modelo de câmara de dobras cutâneas modificada tem várias vantagens. 1) minimiza a contração da pele, que impede observar o processo healing da ferida e pôde influenciar o reparo da ferida nos ratos. 2) esta câmara faz uso de cobrir a ferida com uma lamínula de vidro, reduzindo as infecções do tecido e dessecação, o que poderia atrasar o processo de cicatrização. 3) o fluxo sanguíneo e a vascularização podem ser monitorados diretamente. 4) permite a aplicação tópica repetitiva de compostos farmacologicamente ativos e reagentes, a fim de tratar a ferida e acelerar a cicatrização^9,10.

Identificamos a subunidade β3 de canais de cálcio de alta voltagem (Cavβ3) como uma molécula alvo potencial para influenciar a cicatrização de feridas cutâneas utilizando dois protocolos independentes, ou seja, o ensaio in vitro de migração de arranhões e o modelo de câmara cutânea dorsal in vivo. Para o ensaio in vitro, utilizamos fibroblastos primários, estas células expressam o gene Cacnb3 que codifica a proteína cavβ3, mas a falta de CA^{2 +} afluxo despolarization-induzida ou tensão-dependente CA^{2 +} correntes. Nós descrevemos uma função nova de Cavβ3 nestes fibroblasto: o Cavβ3 liga-se ao inositol 1, 4, 5-receptor do trisphosphate (IP3R) e liberação do cálcio das limitações do reticulum endoplasmático. O apagamento do gene Cacnb3 nos ratos conduz ao aumento da sensibilidade do IP3R para IP3, migração aumentada da pilha e reparo aumentado da ferida da pele⁴.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados e realizados de acordo com os regulamentos de ética e os comitês de bem-estar animal da Saarland e da Universidade de Saarland.

1 cultura de pilha preliminar e transfection do siRNA

Nota: no método descrito, os fibroblastos primários são usados. Estas pilhas desempenham um papel crucial na cicatrização de feridas e remodelação tecidual¹¹. Neste experimento, o gene Cacnb3 , codificando a subunidade Cavβ3 de canais de cálcio de alta tensão-gated¹² foi regulado para baixo, mostrando assim seu papel na migração celular in vitro e reparo da ferida cutânea in vivo⁴.

1. Preparação de siRNA: antes de reconstituir as siRNAs, centrifugue brevemente os tubos para garantir que o conteúdo está na parte inferior. Reconstituir as siRNAs em 100 μL de tampão livre de RNase (acetato de potássio 100 mM, 30 mM HEPES, pH 7,5) fornecido pelo fabricante a uma concentração de 20 μM. Esta é uma solução de estoque de siRNAs.
2. Aliquot esta solução de estoque em 10 μL por tubo (concentração de 20 μM) e armazene a-20 ° c até o uso.
3. Usando um marcador permanente ultrafino, marque uma placa de 6 poços com uma linha horizontal na parte inferior de cada poço, a fim de ser capaz de identificar sempre a mesma região de risco de interesse e seguir seu fechamento.
   Nota: as placas da cultura 6-well foram usadas neste ensaio porque são grandes bastante, para fornecer bastante espaço e flexibilidade para aplicar um risco consistente, reprodutível e vertical usando uma ponta da pipeta de 200 μL através do monocamada da pilha. Se um número limitado de células estiver disponível, uma alternativa e provavelmente a maneira rentável seria usar placas de cultura de 12 ou 24 poços.
4. Fibroblastos primários de placa, isolados do tipo selvagem e β3-deficientes camundongos⁴, em uma placa de 6 poços em uma densidade de 5 x 10⁵ células/bem na presença de 2 ml Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FCS).
   Nota: 5 x 10⁵ células por poço foi estabelecida para 6-bem placa de cultura e para o mouse primário fibroblastos. Os testes podem ser necessários se usando placas de cultura de células de 12 ou 24 poços ou outros tipos de células, que podem ser diferentes em tamanho. As células devem ser tratadas em um ambiente estéril, como armários de segurança biológica classe II.
5. Rotule a placa de 6 poços com o tipo de célula, o genótipo e a data.
6. Mova a placa 6-well na incubadora da cultura da pilha e mantenha pilhas em 37 ° c e em 5% CO₂ para 24 h.
7. No dia seguinte, retire a placa da incubadora, aspirar o meio de cultura celular para fora do poço, descartá-lo e substituí-lo com 2,25 mL de meio de cultura fresca, adicionando-o cuidadosamente contra a parede do poço.
8. A fim de transfecção fibroblastos com siRNAs, use um reagente de transfecção baseada em lipídios, conforme recomendado pelo fabricante.
9. Para cada transfection, rotule dois tubos do microcentrifugador. Na primeira, adicionar 9 μL do reagente de transfecção e diluir com 150 μL de meio sérico reduzido. No segundo tubo, adicione 1,5 μL de siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA mexidos como um controle negativo) e dilui-o com 150 μL de meio sérico reduzido.
10. Adicione o siRNA diluído no tubo contendo reagente de transfecção diluído e Vortex para 2 s. Incubar a mistura por 5 min a 21 ° c.
11. Rotule poços com Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA mexidos. Adicionar 250 μL da mistura de reagente de siRNA-transfecção à célula.
12. Coloc a placa da cultura 6-well de volta na incubadora e mantenha pilhas em 37 ° c e em 5% CO₂ para 72 h.
13. A fim verificar a eficiência do silenciamento do gene Cacnb3 , coletar pilhas transfected e executar a análise do immunoblot como descrito previamente⁴.

2. ensaio de cicatrização de feridas in vitro (ensaio de migração de riscos)

1. Tome a placa da cultura da pilha fora da incubadora e examine as pilhas o microscópio usando o objetivo 10x. Comece com o teste do risco somente quando alcangaram a confluência de 100%.
   Nota: para a exatidão e reprodutibilidade, a confluência de 100% é um fator obrigatório para iniciar o ensaio de migração de arranhões. Conseqüentemente, é importante semear o mesmo número de pilhas nos poços da cultura, examinar cada poço para o confluência e aplicar o risco no mesmo ponto do tempo (confluência do dia 0). Esperando por mais tempo depois que as células atingem 100% confluência pode evocar respostas diferentes.
2. Uma vez que a célula atinge 100% confluência, aspirar o meio de cultura fora do poço e descartá-lo.
3. Use uma ponta de pipeta (200 μL) para criar manualmente um risco vertical para a linha horizontal marcada na parte inferior do poço, através da monocamada de células confluentes no meio do poço.
4. Enxague cada poço duas vezes com 2 mL de soro fisiológico tamponado (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂po₄, 8,1 mm na₂HPO₄, pH 7,4) para remover os fatores liberados de células danificadas, células soltas e detritos da área riscada. Adicionar 2 mL de PBS cuidadosamente contra a parede do poço para evitar a desanexação de células da cultura da célula bem.
5. Adicione 2 mL de meio de cultura celular contendo um soro de 10% ou 1% de soro com cuidado para cada poço.
   Nota: recomenda-se realizar o teste do risco o soro de 10% e o soro de 1% para confirmar que o efeito observado está causado pela proliferação e pela migração de pilha ou pela migração da pilha somente.
6. Mova a placa para o estágio do microscópio e Capture imagens de campo brilhantes da área livre de células (duas áreas por poço) imediatamente após arranhar (t = 0h) a uma ampliação de 10x usando um microscópio de luz. Para a imagem sempre a mesma região do zero, use a linha horizontal, que foi preparada na etapa (1,3), e tomar uma imagem acima desta linha e uma imagem abaixo desta linha. Salvar imagens como TIFF ou JPEG.
7. Porque o estágio do microscópio não mantem a condição de crescimento da pilha, mova a placa de volta à incubadora da cultura da pilha e mantenha as pilhas em 37 ° c e em 5% CO₂.
8. Após 6, 10 e 30 h, mova a placa para o estágio do microscópio novamente e capture as imagens da mesma maneira descrita na etapa 2,6.
   Nota: estes pontos temporais foram estabelecidos para o procedimento descrito e para os fibroblastos primários. Durante o primeiro experimento piloto, mais pontos de tempo foram testados para ver o quão rápido os fibroblastos repovoam a lacuna. Embora 0, 6, 10 e 30 h sejam pontos de tempo de partida razoáveis, os investigadores devem otimizar e estabelecer os pontos de tempo apropriados para cada aplicação e para cada tipo de célula. A alternativa mais precisa, se disponível, seria usar a microscopia de lapso de tempo.
9. Usando o ImageJ¹³, quantifique a área sem célula inicial (100%) e a área remanescente após 6, 10 e 30 h (Figura 1). A porcentagem da área de rascunho repovoada por células migratórias é calculada em relação à área inicial do rascunho.

3. análise da área de arranhão

1. Abra o software ImageJ¹³.
2. Carregue a primeira imagem como JPEG (por exemplo, imagens RGB de 24 bits 1360x1024) soltando a imagem na barra de menus do ImageJ.
3. Selecione o botão de seleções da mão livre e marque a área sem célula
4. Clique em analisar e selecione Measure. Aparecerá uma janela com os resultados que contém o valor da área.
5. Transfira esse valor para uma planilha de análise.
6. Repita os passos 3.2-3.5 para cada imagem do ponto de tempo 0 h e, em seguida, iniciar novamente para a próxima vez pontos 6, 10 e 30 h.
7. Calcule a porcentagem de área de rascunho repovoada migrando células após 6, 10 e 30 h para cada arranhão usando a seguinte equação:
   
   a = área livre de células do zero inicial, b = área livre de células após 6 h
8. Calcule a média e o erro padrão da média (M.E.V.) para a porcentagem de área de rascunho repovoada pela migração de células após 6 h. mostrar dados como um gráfico de barras de colunas ou uma plotagem de dispersão.

4. ensaio de cicatrização da ferida cutânea in vivo

Nota: C57BL/6 machos selvagens (8-12 semanas de idade com 22-26 g de peso corporal) e camundongos com deficiência de Cavβ3 como controle são utilizados para este estudo.

1. Um dia antes de iniciar o experimento, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, parafusos, porcas e quadros de titânio para ser usado para a preparação da câmara de dobras cutâneas.
   Nota: o quadro de titânio é composto por duas metades complementares simétricas e tem uma janela de observação circular onde a ferida será aplicada e seguida por microscopia (ver Figura 2a).
2. Anestesie um rato de tipo selvagem ou β3 deficiente (22-26 g de peso corporal) por injecção intraperitoneal (i.p.) de 0,1 mL de soro fisiológico/10 g de peso corporal contendo uma mistura de cetamina (75 mg/kg de peso corporal) e xilazina (25 mg/kg de peso corporal). Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a uma pitada de dedo do pé.
   Nota: esta injecção dá cerca de 30 min de anestesia cirúrgica e a profundidade da anestesia deve ser controlada através do procedimento cirúrgico, verificando os reflexos do rato.
3. Para evitar a secura ou o dano dos olhos, aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos e repita a aplicação se necessário.
4. Cuidadosamente raspar o dorso do rato, usando um barbeador elétrico seguido pela aplicação de um creme de depilação para a área raspada para remover qualquer cabelo restante. Tome cuidado para não ferir a pele do rato. Deixe o creme de depilação por cerca de 10 min para remover completamente todo o cabelo.
5. Prepare a câmara de titânio, tomando uma parte do quadro de câmara de titânio simétrica e fixar os parafusos de conexão com porcas de um lado. Estas porcas servirão como espaçador para manter 400-500 μm entre as duas partes simétricas da câmara para evitar a compressão dos vasos sanguíneos na pele.
6. Retire o creme da parte de trás do rato e limpe a região sem pêlos com água quente (35-37 ° c) da torneira.
7. Certifique-se de que o lugar para realizar a cirurgia é limpo, morno (37 ° c) e humidificado.
8. Desinfete a área sem pêlos do rato com desinfetante de pele. Tome uma dobra da pele traseira do rato na frente de uma fonte luminosa e posicione a linha média da camada dobro da pele onde a câmara Titanium será implantada. Depois disso, fixar a dobra cutânea com uma sutura de polipropileno cranialmente e caudalmente e aperte o outro lado da sutura em uma cremalheira de metal para levantar a pele dobrada do mouse. Ajuste a altura do rack para permitir que o mouse se sente confortavelmente.
9. Implante a câmara de titânio na dobra da pele traseira do mouse de forma a sanduíche a camada de pele dorsal dobrada entre as duas metades simétricas do quadro de titânio. Prenda a primeira metade do quadro de titânio por suturas de polipropileno em sua borda superior para a parte de trás da dobra cutânea dorsal.
   Nota: no quadro de titânio, há 8 furos na borda superior (Figura 2a) e a pele dobrada deve ser bem fixada por suturas de polipropileno em cada um dos oito furos.
10. Antes de passar para a próxima etapa, verifique os reflexos do mouse para se certificar de que a profundidade da anestesia é mantida.
11. Na base da dobra cutânea, passe os dois parafusos de conexão, anexados à primeira metade da câmara de titânio, para penetrar a dobra cutânea de volta para a frente. Faça pequenas incisões na pele (usando tesouras finas) para ajudar a penetração suave dos parafusos de conexão.
12. Retire o mouse do rack e coloque-o em uma posição lateral. Coloque a segunda metade complementar da câmara de titânio em cima dos 3 parafusos de ligação (ver Figura 2a) e aplique uma ligeira pressão com os dedos para passar estes parafusos através da segunda metade da armação de titânio. Em seguida, fixar ambas as partes simétricas com porcas de aço inoxidável.
13. Preste atenção ao aperto dos parafusos nesta etapa, uma vez que pode se destacar, se ele é muito solto. Em contraste, se for muito apertado, ele irá espremer a dobra cutânea, reduzir o fluxo sanguíneo e pode levar ao comprometimento tecidual e necrose.
    Nota: as porcas preparadas na etapa 4,5 servem como espaçador para manter uma distância de 400-500 μm entre as duas metades simétricas da câmara de titânio. As porcas devem ser apertadas até que uma ligeira resistência seja sentida.
14. Corte a parte restante dos parafusos usando alicates.
    Nota: é necessário nesta etapa usar vidros de segurança do laboratório para a proteção de olho caso que o parafuso sai da maneira errada.
15. Marcar a área da ferida por um perfurador de biópsia padronizado (2 mm de diâmetro), no centro da pele dentro da janela de observação (ver Figura 2a) da câmara de dobras cutâneas, a fim de garantir tamanhos de feridas reprodutíveis.
16. Usando o fórceps fino e as tesouras, crie uma ferida circular dentro da área marcada removendo a pele completa com epiderme e derma. A área final da ferida será em torno de 3,5-4,5 mm², ver Figura 2b. Limpe a ferida com 0,5 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl, 37 ° c).
17. Cubra a ferida com uma lamínula de vidro e fixe esta lamínula de vidro com um anel de pressão usando o alicate de anel de pressão na câmara de titânio.
18. Imediatamente após o término do procedimento cirúrgico, coloque o mouse sobre o estágio de imagem de um estereomicroscópio equipado com uma câmera e tire imagens (dia 0) iluminação. Use a ampliação de 40X e salve as imagens para futura análise off-line.
    Observação: o investigador deve examinar as imagens imediatamente após a captura para garantir que a qualidade seja suficiente para futuras análises off-line. A preparação da câmara de dobras cutâneas e o desempenho da ferida cutânea levam cerca de 30 minutos.
19. Mantenha o rato em um lugar morno durante a recuperação da anestesia para pelo menos 2 h. Depois disso, os ratos de transferência em gaiolas individuais de volta para a instalação animal (12 h de luz/ciclo escuro) e certifique-se que os ratos têm acesso a alimentos e água.
20. Três dias post-Wounding colocar o mouse em um mouse-contenção e fixar a restrição em cima do estágio de imagem.
21. Coloque o palco um estereomicroscópio equipado com uma câmera. Tirar imagens iluminação com ampliação de 40x, gravar todas as imagens e salvá-los para futuras análises off-line
22. Repita as etapas 4,20 e 4,21 novamente no dia 6, 10 e dia 14 post-Wounding.
23. Use as imagens da ferida, para análise off-line no ImageJ¹³. A área da ferida no dia 0 é considerada como 100% e o fechamento da ferida ao longo do tempo é plotado em relação à área da ferida inicial. Os resultados representativos são mostrados na Figura 2c, d.
24. Calcule a porcentagem (%) da área da ferida em cada ponto de tempo usando a seguinte equação:
    
    x: ponto de tempo (dia 0, 3, 10 ou 14), a: área da ferida no dia 0, b: área da ferida no ponto de tempo x

Resultados

O teste do risco foi executado em um monocamada da pilha confluente do selvagem-tipo e β3-deficientes mefs (Figura 1c). Depois de executar o "Scratch" usando uma ponta de pipeta de 200 μL, as células de ambos os genótipos migram para a área de arranhão e fecham a lacuna. As imagens foram realizadas após 6, 10 e 30 h (Figura 1a). A migração celular foi quantificada como percentual (%) da área de rascunho repovoada migra...

Discussão

Neste manuscrito, descrevemos um ensaio in vitro e in vivo de cicatrização de feridas e correlacionamos os resultados obtidos. Para o ensaio in^{vitro, utilizamos}fibroblastos primários do camundongo^4,14,15 que desempenham um papel importante na cicatrização de feridas e remodelação tecidual¹¹. Outros tipos de células aderentes crescendo como monocamadas (por exemplo, células epiteliais, células en...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % NaCl
1 ml syringes	BD Plastipak	303172
6 well plate	Corning	3516
Biopsy punch	Kai Industries	48201	2 mm
Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)	Origene	SR415626
Depilation cream			any depilation cream
Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)	Bayer	3400935940179.00	(BEPANTHEN)
Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)	Bayer Health Care		Rompun 2%
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by life technologies	41966-029
Fetal bovine serum	Gibco by life technologies	10270-106
Hexagon full nut
Ketamine hydrochloride	Zoetis		KETASET
Light microscope	Keyence, Osaka, Japan	BZ-8000	Similar microscopes might be used
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	13778075
Micro-forceps
Micro-Scissors
Mouse restrainer	Home-made
Normal scissors
Objective	Nikon	plan apo 10x/0.45
Opti-MEM	Gibco by life technologies	51985-026
Polypropylene sutures
Screwdriver
Skin disinfectant (octeniderm)	Schülke & Mayr GmbH	118212
Slotted cheese head screw
Snap ring
Snap ring plier
Surgical microscope with camera	Leica	Leica M651
Titanium frames for the skinfold chamber	IROLA	160001	Halteblech M
Wire piler