استخدام كريسبر / Cas9 لضرب جنرال موتورز-CSF في خلايا CAR-T

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا ً للتحرير الوراثي لخلايا CAR-T عبر نظام CRISPR/Cas9.

Abstract

مستقبلات مستضد Chimeric T (CAR-T) العلاج الخلوي هو أحدث ويحتمل أن تكون ثورية خيار العلاج الجديد للسرطان. ومع ذلك، هناك قيود كبيرة على استخدامه على نطاق واسع في علاج السرطان. وتشمل هذه القيود تطوير سمية فريدة من نوعها مثل متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والسمية العصبية (NT) والتوسع المحدود، وظائف التأثير، والنشاط المضاد للورم في الأورام الصلبة. وتتمثل إحدى الاستراتيجيات الرامية إلى تعزيز فعالية CAR-T و/أو السيطرة على سمية خلايا CAR-T في تحرير جينوم خلايا CAR-T نفسها أثناء تصنيع خلايا CAR-T. هنا، ونحن نصف استخدام كريسبر / Cas9 تحرير الجينات في خلايا CAR-T عن طريق transduction مع بنية لينتيفيروسي تحتوي على دليل RNA إلى حبيبات الضامة مستعمرة تحفيز عامل (GM-CSF) وCas9. على سبيل المثال، نحن نصف كريسبر / Cas9 بوساطة بالضربة القاضية من GM-CSF. لقد أظهرنا أن هذه الخلايا GM-CSF^{ك / س} CAR-T تنتج بشكل فعال أقل GM-CSF مع الحفاظ على وظيفة الخلية T الحرجة وتؤدي إلى تعزيز النشاط المضاد للورم في الجسم الحي مقارنة مع خلايا CAR-T من النوع البري.

Introduction

مستقبلات مستضد Chimeric T (CAR-T) العلاج الخلوي معارض وعد كبير في علاج السرطان. ^{1 , 2} اثنين من العلاجات الخلية CAR-T التي تستهدف CD19 (CART19) تمت الموافقة عليها مؤخرا في الولايات المتحدة في أوروبا لاستخدامها في الأورام الخبيثة الخلية B بعد إظهار نتائج ملفتة للنظر في التجارب السريرية متعددة المراكز. ^{3 , 4 , 5} الحواجز التي تحول دون الاستخدام الأكثر انتشاراً لخلايا CAR-T هي نشاط محدود في الأورام الصلبة والسمية المرتبطة بها بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والسمية العصبية (NT). ^{3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} لتعزيز المؤشر العلاجي للعلاج بالخلايا CAR-T، يتم استخدام أدوات هندسة الجينوم مثل nucleases إصبع الزنك، TALENs، وCRISPR لمزيد من تعديل خلايا CAR-T في محاولة لتوليد خلايا CAR-T أقل سمية أو أكثر فعالية. ^{10 سنوات , 11}

في هذه المقالة، نقوم بوصف طريقة لتوليد خلايا CAR-T تحرير CRISPR/Cas9. والهدف المحدد من هذه الطريقة هو تعديل وراثيا خلايا CAR-T أثناء تصنيع الخلايا CAR-T عن طريق CRISPR /Cas9 لتوليد خلايا CAR-T أقل سمية أو أكثر فعالية. ويستند الأساس المنطقي لتطوير هذه المنهجية على الدروس المستفادة من التجربة السريرية للعلاج بالخلايا CAR-T، مما يشير إلى الحاجة الملحة لاستراتيجيات جديدة لزيادة النافذة العلاجية للعلاج بالخلايا CAR-T وتوسيع نطاق التطبيق إلى الأورام الأخرى ويدعمها التقدم الأخير في البيولوجيا الاصطناعية مما يسمح تعديلات متعددة من خلايا CAR-T التي بدأت في دخول العيادة. في حين يتم تطوير العديد من أدوات هندسة الجينوم وتطبيقها في بيئات مختلفة، مثل nucleases إصبع الزنك، TALENs، وCRISPR، منهجيتنا تصف تعديل CRISPR /Cas9 من خلايا CAR-T. ^{10 سنوات , 11} CRISPR/Cas9 هو آلية الدفاع البكتيرية المستندة إلى الحمض النووي الريبي التي تم تصميمها للقضاء على الحمض النووي الأجنبي. يعتمد CRISPR على endonucleases لشق تسلسل مستهدف تم تحديده من خلال دليل RNA (gRNA). يوفر تحرير كريسبر لخلايا CAR-T العديد من المزايا على الأدوات الهندسية الأخرى للجينوم. وتشمل هذه الدقة في تسلسل gRNA، والبساطة لتصميم gRNA استهداف جين الاهتمام، وكفاءة تحرير الجينات العالية، والقدرة على استهداف جينات متعددة حيث يمكن استخدام gRNAs متعددة في نفس الوقت.

على وجه التحديد في الأساليب الموصوفة هنا، استخدمنا عدس ترميز كريسبر دليل RNA وCas9 لتعطيل الجينات أثناء نقل CAR من الخلايا T. في اختيار تقنية مناسبة لتحرير خلايا CAR-T، نقترح التقنية الموصوفة هنا هي آلية فعالة لتوليد خلايا CAR-T الصف البحوث، ولكن لأن تأثير على المدى الطويل من التكامل الدائم من Cas9 في الجينوم غير معروف، ونحن اقتراح هذه المنهجية لتطوير دليل على مفهوم البحوث الصف CAR-T الخلايا ولكن ليس لإنتاج جيد تصنيع الممارسة الصف CAR-T الخلايا.

على وجه الخصوص، هنا نقوم بوصف جيل من الخلايا الحبيبية الضامة مستعمرة تحفيز عامل (GM-CSF) بالضربة القاضية CAR-T الخلايا التي تستهدف CD19 البشرية. تم إنشاء هذه الخلايا CAR-T عن طريق التحويل مع الجسيمات اللينة ترميز الحمض النووي الريبي دليل محدد إلى GM-CSF (اسم الجينات CSF2) وCas9. وجدنا سابقا أن تحييد GM-CSF يخفف CRS وNT في نموذج xenograft. ¹² GM-CSF^{ك / س} CAR-T الخلايا تسمح لتثبيط GM-CSF خلال عملية التصنيع، والحد بشكل فعال من إنتاج GM-CSF مع تعزيز CAR-T خلية النشاط المضاد للورم والبقاء على قيد الحياة في الجسم الحي مقارنة مع خلايا CAR-T من النوع البري. ¹² وهكذا، هنا نحن نقدم منهجية لتوليد كريسبر / Cas9 تحرير خلايا CAR-T.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية في Mayo Clinic (مايو كلينك) واللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC).

1. CART19 إنتاج الخلايا

1. عزل الخلايا T، والتحفيز، وثقافة الجسم الحي السابق
   1. تنفيذ جميع أعمال ثقافة الخلية في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. حصاد خلايا الدم المحيطية أحادية النووية (PBMCs) من المخاريط الدم المتبرعة الطبيعية التي تم جمعها أثناء النعوت حيث من المعروف أنها مصدر قابل للحياة من مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم.
   2. لعزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم، أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب فصل متدرج بكثافة 50 مل. تمييع دم المتبرع بكمية متساوية من المحلول على السالين المُسَوَّر بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على مصل البقر الجنيني (FBS) بنسبة 2% لتجنب احتجاز الخلايا.
      1. إضافة الدم المانح المخفف من المخروط في أنبوب الفصل، والحرص على عدم إزعاج واجهة بين الدم وكثافة التدرج المتوسطة. الطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 10 دقائق في RT.
      2. Decant supernatant في مخروطي جديد 50 مل، وغسل مع PBS + 2٪ FBS عن طريق جلب ما يصل إلى 40 مل، الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 8 دقائق في RT، يستنشق supernatant، إعادة تعليق في 40 مل من العازلة، وخلايا العد.
   3. عزل الخلايا T من PBMCs عن طريق مجموعة حبة المغناطيسي اختيار سلبي باستخدام فاصل الخلية مؤتمتة بالكامل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   4. لثقافة الخلايا T المعزولة، وإعداد T خلية المتوسطة (TCM) التي تتكون من 10٪ مصل AB الإنسان (v/v)، 1٪ البنسلين-ستريبوميسين-الجلوتامين (V / V)، والمصل خالية من مصل خلية المكونة للدم المتوسطة. تعقيم المتوسط عن طريق تصفية من خلال فلتر فراغ معقمة 0.45 م ومن ثم مع فلتر فراغ معقمة 0.22 م.
   5. في اليوم 0 (يوم تحفيز الخلايا T)، وغسل الخرز CD3/CD28 قبل تحفيز الخلايا T. لغسل، وضع الحجم المطلوب من الخرز (استخدام ما يكفي من الخرز CD3/CD28 لنسبة 3:1 حبات: T الخلايا؛ لاحظ تركيز الخرز يمكن أن يكون متغير) في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل معقمة وإعادة تعليق في 1 مل من TCM.
   6. مكان في اتصال مع المغناطيس.
   7. بعد 1 دقيقة، يستنشق TCM ويعلق في 1 مل من TCM الطازجة لغسل الخرز.
   8. كرر هذا الإجراء لما مجموعه ثلاث عمليات النفاية.
   9. بعد الغسيل الثالث، إعادة تعليق الخرز في 1 مل من TCM.
   10. عد الخلايا T.
   11. نقل الخرز إلى الخلايا T بنسبة 3:1 الخرز: الخلايا.
   12. تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من 1 × 10⁶ خلايا / مل.
   13. حضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة.
2. T خلية التغوط والتحويل
   1. القيام بأعمال اللاتفيروسي باستخدام الاحتياطات BSL-2+، بما في ذلك أغطية زراعة الخلايا، ومعدات الحماية الشخصية، وتطهير المواد المستخدمة مع التبييض قبل التخلص منها.
   2. الحصول على بناء CART19 في ناقلات لينتيفيروسي.
      ملاحظة: تم تصميم بناء CART19 المستخدمة هنا ثم توليفها دي نوفو باستخدام بائع توليف البروتين المتاحة تجاريا. وقد استنسخت بناء CAR في وقت لاحق إلى الجيل الثالث من فيروس لينتي تحت سيطرة المروج EF-1α. يتم اشتقاق جزء المنطقة المتغيرة سلسلة واحدة من استنساخ FMC63 ويعترف CD19 الإنسان. تمتلك شركة CAR19 الجيل الثاني من مجال المحفزات المشتركة 4-1BB والتحفيز CD3י (FMC63-41BBz). ¹²
   3. أداء إنتاج اللاتينفيروسي كما هو موضح سابقا. ¹²
      1. باختصار، لإنتاج لينتيفيروس، استخدم الخلايا 293T التي وصلت إلى 70-90٪ من الملاءمة.
      2. السماح بالحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من الكوارف عبر التغوط بما في ذلك 15 ميكروغرام من بلازميد لينتيفيروسي من الفائدة، 18 ميكروغرام من الكمامة / pol / tat / rev ناقلات التعبئة والتغليف، 7 ميكروغرام من ناقلات المغلف VSV-G، 111 ميكرولتر من الكاشف قبل المعقدة، 129 ميكرولتر من كاشف الانف، و 9.0 مل من وسيط الانف قبل إضافة إلى خلايا 293T. ثم ثقافة الخلايا المتحولة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂.
      3. الحصاد، الطرد المركزي (900 × ز لمدة 10 دقائق)، فلتر (0.45 ميكرومتر مرشح النايلون)، والتركيز supernatant في 24 و 48 ساعة عن طريق ultracentrifugation إما 13،028 × ز لمدة 18 ساعة أو 112،700 × ز لمدة 2 ساعة.
      4. تجميد عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
   4. في اليوم الأول، إعادة تعليق الخلايا T بلطف لتفريق ورديات الخلايا T التي تم تحفيزها في 1 × 10⁶/مل في اليوم 0.
   5. في إطار الاحتياطات المناسبة BSL-2+ لجميع الأعمال اللينفيروسية، إضافة فيروس حصاد هاد جديد أو مجمد إلى الخلايا T حفز في تعدد العدوى (MOI) من 3.0.
3. CAR-T توسيع الخلية
   1. خلال مرحلة التوسع، ومواصلة احتضان الخلايا T المستحثة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂. عد خلايا CAR-T في اليومين 3 و 5، وإضافة جديدة، قبل تسخين TCM إلى الثقافة للحفاظ على تركيز خلية CAR-T من 1 × 10⁶/مل.
   2. إزالة الخرز من الخلايا T المستحثة 6 أيام بعد التحفيز (اليوم 6) باستخدام المغناطيس. حصاد، وإعادة تعليق، ووضع الخلايا T في أنابيب مخروطية 50 مل في المغناطيس لمدة 1 دقيقة. ثم جمع supernatant (يحتوي على خلايا CAR-T)، وتجاهل الخرز.
   3. وضع الخلايا CAR-T التي تم جمعها مرة أخرى في الثقافة بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / مل لاستئناف التوسع.
   4. في اليوم 6، تقييم التعبير السطحي للسيارة عن طريق قياس التدفق.
      ملاحظة: يمكن استخدام عدة طرق للكشف عن التعبير السطحي للسيارة، مثل تلطيخ مع الماعز المضادة للماوس IgG (H + L) عبر المازيتاالأجسام المضادة الثانوية أو عن طريق تلطيخ مع الببتيد CD19 محددة، مترافقة مع فلوروكروم. هنا، خذ aliquot (حوالي 100،000 خلايا T) من الثقافة وغسل مع العازلة تدفق أعدت مع المالحة دولبيكو الفوسفات المخزنة، 2٪ مصل البقر الجنيني، و 1٪ أزيد الصوديوم. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة للجمهورية وغسل مرتين. وصمة عار الخلايا مع وصمة عار الحية / الميتة وCD3 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (OKT3). اغسل الخلايا ثم قم بإعادة الإيقاف المؤقت للتدفق. الحصول على مقياس السيتومتر لتحديد كفاءة التحويل.
4. الحفاظ على الخلايا CAR-T بالتبريد
   1. لحصاد والبرد خلايا CAR-T بعد 8 أيام من التحفيز (اليوم 8 من توسيع الخلية T)، حصاد الخلايا من الثقافة.
   2. تدور إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
   3. إعادة تعليق في تجميد المتوسطة في 10 مليون خلية لكل مل لكل قارورة في تجميد المتوسطة تتكون من 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 90٪ مصل البقر الجنيني.
   4. تجميد في حاوية التجميد لتحقيق معدل التبريد من -1 درجة مئوية / دقيقة في الفريزر -80 درجة مئوية ومن ثم نقل إلى النيتروجين السائل بعد 48 ساعة.
   5. قبل استخدامها في المختبر أو في التجارب الحية، ذوبان خلايا CAR-T في TCM الدافئة.
   6. غسل الخلايا لتخفيف وإزالة كبريتيد ثنائي الميثيل وإعادة تعليق إلى تركيز 2 × 10⁶ خلايا / مل في TCM الدافئة. الراحة بين عشية وضحاها في37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

2- إنتاج GM-CSF ^k/o CART19

1. لتعطيل GM-CSF، استخدم دليل RNA (gRNA) يستهدف exon 3 من الإنسان GM-CSF (CSF2) التي تم اختيارها عن طريق فحص gRNAs التي ذكرت سابقا أن لديها كفاءة عالية لجين CSF2 الذي يرمز للسيتوكين البشري GM-CSF. ^{14 سنة}
   ملاحظة: تم استخدام درجة بحث مركبة تجارياً Cas9 الجيل الثالث من البناء اللين الذي يحتوي على هذا gRNA (تحت مروج U6). يحتوي البناء على جين مقاومة البورومسين. التسلسل من ال [غرنا] [ككتكلتكتككّكّكّ]. ¹²
2. لإنتاج فيروس لينتي، استخدم الخلايا 293T التي وصلت إلى 70-90٪ الملاءمة.
3. السماح بـ 15 ميكروغرام من بلازميد اللانيفي للفائدة، و18 ميكروغرام من ناقل التعبئة والتغليف الهفوة/pol/tat/rev، و7 ميكروغرام من ناقل مغلف VSV-G، و111 ميكرولتر من الكاشف قبل التفكيك، و129 ميكرولتر من كاشف الانتراب، و9.0 مل من وسيلة التغوط للحضانة لمدة 30 دقيقة في الغرفة te mperature.
4. إضافة الكواشف transfection إلى خلايا 293T. ثم الثقافة في 37 درجةمئوية، 5٪ CO 2.
5. الحصاد، الطرد المركزي (900 × ز لمدة 10 دقائق)، فلتر (0.45 ميكرومتر مرشح النايلون) والتركيز supernatant في 24 و 48 ساعة عن طريق ultracentrifugation إما 13،028 × ز لمدة 18 ساعة أو 112،700 × ز لمدة 2 ساعة وتجميد في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
6. في اليوم الأول، إعادة تعليق الخلايا T بلطف لتفريق الورود.
7. في مختبر معتمد BSL-2+ ، إضافة فيروس المجمدة أو حصادها حديثا إلى الخلايا T حفز لتوليد خلايا CAR-T. خلايا T Transduce مع كل من CAR19 lentivirus وGM-CSF استهداف فيروس لينتي كريسبر. إضافة CAR19 lentivirus في وزارة الداخلية من 3. وبما أن معايرة فيروس لينتي كريسبر لم يكن ممكناً، استخدم جزيئات الفيروس المتولدة عن إعداد بلازميد 15 ميكروغرام لتبديل 10 x 10⁶ خلايا T.
8. راجع الخطوات المتبقية من تحفيز الخلايا T، والتوسع، والحفظ بالتبريد كما نوقش في الخطوة 1.
9. للخلايا T تحريرlentiCRISPR تحمل مقاومة البورومسين، علاج الخلايا مع ثنائي هيدروكلوريد البورومسين بتركيز 1 ميكروغرام من البورومسين لكل 1 مل في اليوم 3 واليوم 5 .

3 - كفاءة تعطيل اللجنة العالمية للبلدان العالمية ولجنة دعم الأوراق المالية والتقييم الوظيفي لـ GM-CSF ^k/o CART19

1. كفاءة تعطيل GM-CSF: تتبع الإندلات عن طريق التحلل (TIDE) التسلسل والتحليل
   1. لتسلسل exon من الاهتمام في الجينات GM-CSF، استخدم التمهيديات التالية. استخدام تسلسل التمهيدي إلى الأمام لGM-CSF (CSF2) من TGACTACAGAGAGGCACAGA، وتسلسل التمهيدي العكسي من TCACCTCTGACCTCATTAACC.
   2. استخراج الحمض النووي من ما يصل إلى 5 ملايين خلايا CAR-T مع مجموعة استخراج الجينوم. لتفاعل PCR، استخدم 25 ميكرولتر من إتقان التقوى لكل رد فعل مع تركيز نهائي لكل التمهيدي في تفاعل PCR من μM، 0.1-0.5 ميكروغرام من الحمض النووي القالب، والحجم الإجمالي لرد فعل PCR جلبت ما يصل إلى 50 ميكرولتر مع المياه الخالية من nuclease.
   3. انظر شروط ركوب الدراجات PCR الموضحة في الجدول 1.
   4. تشغيل عينات PCR على هلام أجاروز 1-2٪ في 100 V لمدة 30 دقيقة واستخراج باستخدام مجموعة استخراج هلام.
   5. تسلسل PCR أمبوليكون. حساب تردد تعديل allele عن طريق تحميل البيانات الخام في برنامج TIDE المناسبة. ¹⁵
2. إنتاج صندوق الأمم المتحدة للإدارة الفنية ولجنة التنمية المستدامة والتقييم الوظيفي لـ GM-CSF^k/o CART19
   1. لتحديد إنتاج السيتوكين من خلايا CAR-T، واحتضان خلايا CART19 من النوع البري وGM-CSF^k/o CART19 مع CD19 التي تعبر عن خط الخلايا اللوكيميا اللمفاوية الحادNAL6 بنسبة 1:5 ل4 ح عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ في وجود monensin حل، CD49d المضادة للإنسان، CD28 المضادة للإنسان، وCD107a المضادة للإنسان.
   2. حصاد الخلايا من الثقافة لتدفق قياس الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام مخزن قياس الخلايا. وصمة عار الخلايا مع مجموعة تلطيخ الحية / الميتة. الحضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   3. بعد الغسيل، وصمة عار الخلايا داخل الخلايا مع نفاذية المتوسطة في تركيبة مع الأجسام المضادة للبشرية IFNγ أحادية النسيلة، ومكافحة الإنسان GM-CSF، ومكافحة الإنسان MIP-1β، ومكافحة الإنسان IL-2، وCD3 المضادة للإنسان واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 الحد الأدنى غسل وإعادة تعليق العينات. الحصول على عينات على مقياس السيتومتر تدفق وتحليلها بالنسبة المئوية للتعبير داخل الخلايا GM-CSF.

النتائج

ويبين الشكل 1 انخفاض معدل الـ GM-CSF في خلايا GM-CSF^k/o CART19. للتحقق من أن الجينوم من الخلايا T تم تغييره إلى ضربة قاضية GM-CSF، تم استخدام تسلسل TIDE في الخلايا GM-CSF^k/o CART19 (الشكل1A). CAR-T بقعة الخلية تلطيخ يتحقق من أن الخلايا T تعبر بنجاح عن مستقبل...

Discussion

في هذا التقرير، نقوم بوصف منهجية لاستخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9 للحث على إدخال تعديلات ثانوية في خلايا CAR-T. وعلى وجه التحديد، يتضح ذلك باستخدام الانكلب الفيروسي مع ناقل فيروسي يحتوي على gRNA يستهدف جين الاهتمام وCas9 لتوليد خلايا GM-CSF^k/o CART19. كنا قد أظهرت سابقا أن تحييد GM-CSF يخفف CRS وNT في نموذج xeno...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17951	negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a	BD Pharmingen	555800
Fixation Medium (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge)	GenScript	N/A	custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	07851
Monensin Solution, 1000X	BioLegend	420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2	BD Pharmingen	559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10	BD Pharmingen	561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	CRL-3273	acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water	Promega	P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile	Genesee Scientific	25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM	Thermo Scientific Nalgene	450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid	Gibco	31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2	BD Horizon	562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid	Gibco	10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182001
Puromycin Dihydrochloride	MP Biomedicals, Inc.	0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421	BD Horizon	562930
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)	STEMCELL Technologies	85450
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q