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要約

ここでは、CRISPR/Cas9システムを介してCAR-T細胞を遺伝的に編集するプロトコルを提示する。

要約

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、がんに対する最先端かつ潜在的に革命的な新しい治療オプションです。しかし、癌の治療におけるその広範な使用には重大な制限がある。これらの制限には、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)などのユニークな毒性の開発と、固形腫瘍における限定的な拡張、エフェクター機能、および抗腫瘍活性が含まれる。CAR-T細胞の有効性および/または制御毒性を高めるための1つの戦略は、CAR-T細胞製造中にCAR-T細胞自体のゲノムを編集することです。ここでは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびCas9へのガイドRNAを含むレンチウイルス構造を用いたトランスダクションによるCAR-T細胞におけるCRISPR/Cas9遺伝子編集の使用について述べた。例として、GM-CSFのCRISPR/Cas9媒介ノックアウトについて説明する。これらのGM-CSFk/o CAR-T細胞は、重要なT細胞機能を維持しながらGM-CSFを効果的に産生し、野生型CAR-T細胞と比較して生体内で抗腫瘍活性を高める結果をもたらすことを示した。

概要

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、癌の治療において大きな期待を示す。1,2 CD19(CART19)を標的とする2つのCAR-T細胞療法は、マルチセンター臨床試験で顕著な結果を実証した後、B細胞悪性腫瘍の使用のために最近、米国で承認されました。3,4,5 CAR-T細胞のより広範な使用への障壁は、固形腫瘍およびサイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)を含む関連毒性における限られた活性である。3,5,6,7,8,9 CAR-T細胞治療の治療指標を高めるために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなどのゲノム工学ツールを用いて、CAR-T細胞をさらに改変し、毒性の低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成する試みを行います。10歳,11歳

この記事では、CRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法について説明します。この方法の具体的な目的は、CRISPR/Cas9を介したCAR-T細胞製造中にCAR-T細胞を遺伝的に改変し、毒性が低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成することです。この方法論を開発するための根拠は、CAR-T細胞療法の臨床経験から学んだ教訓に基づいて構築されており、CAR-T細胞療法の治療窓口を拡大し、適用を拡大するための新しい戦略の緊急の必要性を示しています。他の腫瘍および合成生物学の最近の進歩によって支えられ、診療所に入り始めたCAR-T細胞の複数の修飾を可能にする。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなど、さまざまな設定で複数のゲノム工学ツールが開発・応用されていますが、CAR-T細胞のCRISPR/Cas9改質について説明しています。10歳,11 CRISPR/Cas9は外来DNAを除去するように設計されているRNAベースの細菌防御機構である。CRISPRは、ガイドRNA(gRNA)を介して同定された標的配列を切り分けるためにエンドノクレアーゼに依存しています。CAR-T細胞のCRISPR編集は、他のゲノム工学ツールに対していくつかの利点を提供します。これらには、gRNA配列の精度、目的の遺伝子を標的とするgRNAを設計する簡易性、高い遺伝子編集効率、および複数のgRNAを同時に使用できるため、複数の遺伝子を標的とする能力が含まれる。

具体的には、ここで説明する方法では、CRISPRガイドRNAとCas9をコードするレンチウイルスを用いて、T細胞のCAR伝達中に遺伝子を破壊した。CAR-T細胞を編集するための適切な手法を選択する際には、ここで説明する技術は、研究グレードのCAR-T細胞を生成する効率的なメカニズムであることを示唆していますが、Cas9をゲノムに永久的に統合する長期的な効果は不明であるため、この方法論は、概念実証研究グレードCAR-T細胞を開発するために提案するが、良好な製造実践グレードCAR-T細胞を製造するためのものではない。

特に、ヒトCD19を標的とする顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)ノックアウトCAR-T細胞の生成について説明する。これらのCAR-T細胞は、GM-CSF(遺伝子名CSF2)およびCas9に特異的なガイドRNAをコードするレンチウイルス粒子との伝達によって生成された。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを見出した。12 GM-CSFk/o CAR-T細胞は、製造プロセス中のGM-CSFの阻害を可能にし、野生型CAR-T細胞と比較してCAR-T細胞抗腫瘍活性および生体内での生存を高めながら、GM-CSFの産生を効果的に減少させる。12このように、ここではCRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法論を提供する。

プロトコル

このプロトコルは、メイヨークリニックの機関審査委員会(IRB)および機関バイオセーフティ委員会(IBC)のガイドラインに従っています。

1. CART19細胞生産

  1. T細胞単離、刺激、および生体内培養
    1. 適切な個人用保護具を用いた細胞培養フード内のすべての細胞培養作業を行う。これらはPBMCの生存可能な供給源であることが知られているとして、アフェレス中に採取された非同定正常ドナー血液コーンから末梢血単核細胞(PBMC)を収穫する。
    2. PBMCを分離するには、50 mL密度勾配分離チューブに密度勾配媒体の15 mLを追加します。細胞捕捉を避けるために、2%の胎児ウシ血清(FBS)を含むリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の等量でドナー血液を希釈する。
      1. コーンから希釈されたドナー血液を分離管に加え、血液と密度勾配媒体との間の界面を乱しないように注意する。RTで10分間1,200 x gで遠心分離機。
      2. 新しい50 mL円錐形に上清をデカントし、PBS + 2% FBSで洗浄し、RTで最大400×gを持ち込み、RTで8分間300xgで遠心分離機を、上清を吸引し、40mLのバッファーで再中断し、細胞を数える。
    3. メーカーのプロトコルに従って完全に自動化されたセルセパレータを使用して、負の選択磁気ビーズキットを介してPBMCからT細胞を分離します。
    4. 単離されたT細胞を培養するために、10%ヒトAB血清(v/v)、1%ペニシリン連鎖筋細胞-グルタミン(v/v)、および無血清無血性血栓性細胞培地からなるT細胞培地(TCM)を調製する。0.45 μmの無菌真空フィルターを通して濾過し、0.22 μmの無菌真空フィルターで培地を殺菌します。
    5. 0日目(T細胞刺激の日)に、T細胞の刺激前にCD3/CD28ビーズを洗浄する。洗浄するには、必要な量のビーズ(3:1ビーズ:T細胞の比に十分なCD3/CD28ビーズを使用し、ビーズの濃度が可変にすることができる)を無菌1.5 mLマイクロ遠心管に入れ、TCMの1mLで再懸濁する。
    6. 磁石に接触させます。
    7. 1分後、TCMを吸引し、ビーズを洗浄するために新鮮なTCMの1 mLで再中断します。
    8. この手順を合計 3 回繰り返します。
    9. 3回目の洗浄後、ビーズをTCMの1mLで再濁する。
    10. T セルをカウントします。
    11. ビーズを3:1ビーズの比率でT細胞に移す:細胞。
    12. 細胞を1 x 106細胞/mLの最終濃度に希釈する。
    13. 37 °C、24時間CO2でインキュベートします。
  2. T細胞トランスフェクションとトランスダクション
    1. BSL-2+の予防措置を使用してレンチウイルス作業を行い、細胞培養フード、個人用保護具、使用済み材料の使用済み材料の廃棄を処分前に行います。
    2. レンチウイルスベクターでCART19コンストラクトを取得します。
      注:ここで利用されるCART19構造体は、市販のタンパク質合成ベンダーを使用してデノボを設計し、合成した。CAR構築物は、その後、EF-1αプロモーターの制御下で第3世代レンチウイルスにクローニングされた。単一鎖可変領域フラグメントは、FMC63クローンから導き出され、ヒトCD19を認識する。CAR19構造は第2世代4-1BBコスチミュラトリードメインおよびCD3の刺激(FMC63-41BBz)を有する。12歳
    3. 前述のようにレンチウイルス産生を行う。12歳
      1. 簡単に言えば、レンチウイルスを生成するために、70-90%の合流に達した293T細胞を利用する。
      2. 目的のレンチウイルスプラスミドの15 μg、ギャグ/ポール/タット/rev包装ベクトルの18 μg、VSV-Gエンベロープベクトルの7μg、プレコンプレメーション試薬の111 μL、129 μLを含むトランスフェクション試薬の室温で30分間のインキュベーションを可能にするトランスフェクション試薬、およびトランスフェクション培地の9.0 mLを293T細胞に添加する前に。次いで、トランスフェクト細胞を37°C、5%CO2で培養した。
      3. 収穫、遠心分離機(10分の900 x g)、フィルター(0.45 μMナイロンフィルター)、および18時間の13,028 x gまたは2時間の112,700 x gのいずれかで超遠心分離によって24および48hで上清を濃縮する。
      4. 将来の使用のために-80 °Cで凍結する。
    4. 1日目に、0日目に1 x 106/mLで刺激されたT細胞のロゼットを分解するために、T細胞を穏やかに再中断する。
    5. すべてのレンチウイルス作業のための適切なBSL-2+予防措置の下で、3.0の感染の多重性(MOI)で刺激されたT細胞に新鮮なまたは凍結収穫されたウイルスを追加する。
  3. CAR-Tセル拡張
    1. 増殖の段階の間、37°CでトランスプリケートされたT細胞をインキュベートし続け、5%CO2.CAR-T細胞を3日目と5日目にカウントし、新鮮な予め温められたTCMを培養に加え、CAR-T細胞濃度を1 x 106/mLに維持する。
    2. 刺激の6日後(6日目)に磁石を用いて、移圧されたT細胞からビーズを取り出す。50mL円錐管にT細胞を1分間磁石で収穫、再中断、置きます。次に、上清(CAR-T細胞を含む)を収集し、ビーズを廃棄します。
    3. 集めたCAR-T細胞を1 x 106細胞/mLの濃度で培養に戻し、膨張を再開します。
    4. 6日目に、フローサイトメトリーによるCARの表面発現を評価する。
      注:ヤギの抗マウスIgG(H+L)クロスadsadsedis二次抗体による染色、またはCD19特異的ペプチドによる染色による、フルオロクロムに結合した染色など、CARの表面発現を検出するためにいくつかの方法を使用することができます。ここでは、培養からアリコート(約10万T細胞)を取り出し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、2%の胎児ウシ血清、1%のアジドナトリウムで調製したフローバッファーで洗浄する。抗CAR抗体で細胞を染色し、2回洗浄します。生きた/死んだ染色およびCD3モノクローナル抗体(OKT3)で細胞を染色する。細胞を洗浄し、フローバッファで再中断します。細胞メーターで取得し、トランスダクション効率を決定します。
  4. CAR-T細胞凍結保存
    1. 刺激の8日後(T細胞増殖の8日目)のCAR-T細胞を収穫および凍結保存し、培養から細胞を収穫する。
    2. 300 x gで 5 分間スピンダウンします。
    3. 10%ジメチルスルホキシドおよび90%の胎児ウシ血清からなる凍結培地中のバイアル当たり1000万細胞/mLで凍結培地を再中断する。
    4. 凍結容器で凍結し、-80°C冷凍庫で-1°C/minの冷却速度を達成し、48時間後に液体窒素に移します。
    5. インビトロまたはインビボ実験に使用する前に、暖かいTCMでCAR-T細胞を解凍する。
    6. 細胞を洗浄して希釈し、ジメチルスルホキシドを除去し、暖かいTCMで2 x 106細胞/mLの濃度に再沈下します。37 °C、5% CO2で一晩休む。

2. GM-CSF k/o CART19 生産

  1. GM-CSFを破壊するには、ヒトサイトカインGM-CSFにコードするCSF2遺伝子に対して高い効率を有すると以前に報告されたヒトGM-CSF(CSF2)のエキソン3を標的とするガイドRNA(gRNA)を利用する。14歳
    注:このgRNA(U6プロモーター下)を含む市販の研究グレードCas9第3世代レンチウイルス構造を用いた。このコンストラクトには、ピューロマイシン耐性遺伝子が含まれています。gRNAの配列はGACCTGCCTACAGCGCCである。12歳
  2. レンチウイルスを製造するには、70-90%の合流率に達した293T細胞を利用してください。
  3. 目的のレンチウイルスプラスミドの15 μg、ギャグ/ポール/タット/rev包装ベクトルの18 μg、VSV-Gエンベロープベクトルの7 μg、プレコンプレクエンテーション試薬の111 μL、トランスフェクション試薬の129 μL、およびトランスフェクション培地の9.0 mLを30分間インベートすることができます。mperature。
  4. 293T細胞にトランスフェクション試薬を追加します。次に、37°C、5%CO2で培養する。
  5. 収穫、遠心分離機(10分の900 x g)、フィルター(0.45 μMナイロンフィルター)、18時間13,028 x gまたは112,700 x gで超遠心分離によって24および48hで上清を濃縮し、将来の使用のために-80°Cで凍結します。
  6. 1日目に、T細胞をそっと再び再び中断し、ロゼットを分解します。
  7. BSL-2+承認された実験室で、凍結または新たに収穫されたウイルスを刺激されたT細胞に加えてCAR-T細胞を生成する。CRISPRレンチウイルスを標的とするCAR19レンチウイルスおよびGM-CSFの両方を用いてT細胞をトランスデュースする。3のMOIでCAR19レンチウイルスを追加します。CRISPRレンチウイルスの滴定は実現できなかったので、15ugプラスミド調製から生成されたウイルス粒子を使用して10 x 106 T細胞をトランスデュースする。
  8. ステップ1で説明したように、T細胞刺激、拡張、および凍結保存の残りのステップを参照してください。
  9. ピュロマイシン耐性を持つlentiCRISPR編集T細胞については、3日目及び5日目に1mL当たり1μgのピューロマイシン濃度でプロミシン二塩酸塩で細胞を治療する。

3. GM-CSF破壊効率とGM-CSF k/o CART19の機能評価

  1. GM-CSF破壊効率:分解(TIDE)シーケンシングと解析によるインデルの追跡
    1. GM-CSF遺伝子に関心のあるエキソンを配列するには、以下のプライマーを使用します。TGACTACAGAGAGGAGAのGM-CSF(CSF2)のフォワードプライマーシーケンスと、TCACCTGGACCCCACACCの逆プライマーシーケンスを使用します。
    2. ゲノム抽出キットを用い、最大500万個のCAR-T細胞からDNAを抽出します。PCR反応の場合は、μMのPCR反応における各プライマーの最終濃度を有する反応あたりのTaqマスターミックスの25 μLを使用し、テンプレートDNAの0.1-0.5 μg、およびナクレルトフリー水で最大50 μLをもたらすPCR反応の総体積を使用します。
    3. 表 1に記載されている PCR 循環条件を参照してください。
    4. 1-2%のアガロースゲルでPCRサンプルを100Vで30分間実行し、ゲル抽出キットを使用して抽出します。
    5. シーケンス PCR アンプリコン。生データを適切なTIDEソフトウェアにアップロードして、対立遺伝子修正頻度を計算します。15歳
  2. GM-CSFの生産とGM-CSFk/o CART19の機能評価
    1. CAR-T細胞のサイトカイン産生を決定するために、急性リンパ芽球性白血病細胞株NALM6を発現するCD19を用いて野生型CART19細胞およびGM-CSFk/o CART19を37°Cで4時間、5%CO2の存在下で1:5比でインキュベートする。溶液、抗ヒトCD49d、抗ヒトCD28、および抗ヒトCD107a。
    2. フローサイトメトリーのための培養から細胞を収穫する。フローサイトメトリーバッファーで細胞を洗浄します。生きている/死んだ染色キットで細胞を染色する。室温で15分間暗いところでインキュベートし、固定培地で細胞を固定し、室温で15分間暗いところでインキュベートします。
    3. 洗浄後、抗ヒトIFNγモノクローナル抗体、抗ヒトGM-CSF、抗ヒトMIP-1β、抗ヒトIL-2、抗ヒトCD3、および抗ヒトCD3とを組み合わせて透過的に細胞内に染色し、室温で30分間インキュベートするmin. サンプルを洗浄し、再中断します。フローサイトメーターでサンプルを取得し、細胞内GM-CSF式の割合を分析します。

結果

図1は、GM-CSFk/o CART19細胞におけるGM-CSFの減少を示す。T細胞のゲノムがノックアウトGM-CSFに改変されたことを確認するために、TIDEシーケンシングをGM-CSFk/o CART19細胞(図1A)で使用した。CAR-T細胞表面染色は、T細胞が生きているCD3+細胞にゲーティングすることによりインビトロでCAR表面受容体を正常に発現して?...

ディスカッション

本報告では,CRISPR/Cas9技術を利用してCAR-T細胞に二次修飾を誘導する方法論について述べた.具体的には、目的の遺伝子を標的とするgRNAとCas9を含むウイルスベクターを用いてレンチウイルス伝達を用いてGM-CSFk/o CART19細胞を生成することが実証されている。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを示した。12前述したように、GM-CSFk/o

開示事項

SSKは、ノバルティス(メイヨークリニック、ペンシルバニア大学、ノバルティス大学との間の契約に基づく)にライセンスされているCAR T細胞療法の分野における特許の発明者です。これらの研究は、ヒューマニゲン(SSK)からの助成金によって部分的に資金提供されました。RMS、MJC、RS、およびSSKは、本研究に関連する特許の発明者です。研究室(SSK)は、トレロ、ヒューマニゲン、カイト、レンティゲン、モルフォシス、アクチニウムから資金を受け取ります。

謝辞

この研究は、K12CA090628(SSK)、国立総合癌ネットワーク(SSK)、メイヨークリニックセンター(SSK)、プレドリン財団(SSK)、メイヨークリニック実践局(SSK)の助成金を通じて支援されました。メイヨークリニック医療科学者養成プログラムロバートL.ハウエル医師-科学者奨学金(RMS)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscienceInvitrogen17-0038-42
Choice Taq Blue MastermixDenville ScientificC775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2Beckman CoulterC10343flow cytometer
dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144 
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a BD Pharmingen555800
Fixation Medium (Medium A)InvitrogenGAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2
CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector:
pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number:
High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free
of charge)		GenScriptN/Acustom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
https://tide.nki.nl.Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; USCorning35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscienceInvitrogen47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Monensin Solution, 1000XBioLegend420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2BD Pharmingen559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10BD Pharmingen561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7BD Pharmingen560687
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Scientific5100-0001
NALM6, clone G5 ATCCCRL-3273acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free WaterPromegaP119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterileGenesee Scientific25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uMThermo Scientific Nalgene450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), LiquidGibco31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2BD Horizon562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), LiquidGibco10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)InvitrogenGAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182001
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421BD Horizon562930
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

参考文献

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