CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

요약

여기에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 CAR-T 세포를 유전적으로 편집하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암에 대한 최첨단 잠재적으로 혁명적 인 새로운 치료 옵션입니다. 그러나, 암의 치료에 그것의 광범위 한 사용에 상당한 제한이 있다. 이러한 제한은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 신경 독성 (NT) 및 고형 종양에서 제한된 확장, 이펙터 기능 및 항 종양 활성과 같은 독특한 독성의 개발을 포함한다. CAR-T 효능및/또는 CAR-T 세포의 독성을 조절하는 한 가지 전략은 CAR-T 세포 제조 중에 CAR-T 세포의 게놈을 스스로 편집하는 것입니다. 여기에서, 우리는 과립구 대식세포 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 Cas9에 가이드 RNA를 포함하는 렌티 바이러스 구조를 가진 transduction를 통해 CAR-T 세포에 있는 CRISPR/Cas9 유전자 편집의 사용을 기술합니다. 예를 들어, 우리는 GM-CSF의 CRISPR / Cas9 중재 녹아웃을 설명합니다. 우리는 이 GM-CSF^k/o CAR-T 세포가 중요한 T 세포 기능을 유지하면서 효과적으로 적은 GM-CSF를 생성하고 야생 형 CAR-T 세포에 비해 생체 내에서 향상된 항 종양 활성을 초래한다는 것을 보여주었습니다.

서문

키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암 치료에 큰 약속을 전시한다. ^{1개 , 2} CD19(CART19)를 표적으로 하는 2개의 CAR-T 세포 치료는 다중 센터 임상 시험에서 눈에 띄는 결과를 입증한 후에 B 세포 악성에 있는 사용을 위해 최근 유나이티드 명시된 및 유럽에서 승인되었습니다. ^{3개 , 4개 , 5} CAR-T 세포의 보다 광범위한 사용에 대한 장벽은 고형 종양에서 제한된 활성및 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경독성(NT)을 포함한 관련 독성이다. ^{3개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9} CAR-T 세포 치료의 치료 지수를 향상시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR과 같은 게놈 엔지니어링 도구가 덜 독성이 적거나 더 효과적인 CAR-T 세포를 생성하기 위해 CAR-T 세포를 추가로 수정하는 데 사용됩니다. ^{10개 , 11세}

이 문서에서는 CRISPR/Cas9 편집된 CAR-T 셀을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 특정 목표는 CRISPR/Cas9를 통해 CAR-T 세포 제조 중에 CAR-T 세포를 유전적으로 수정하여 독성이 적거나 더 효과적인 CAR-T 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법론을 개발하기위한 근거는 CAR-T 세포 치료의 치료 기간을 증가시키고 응용 프로그램을 확장하기 위한 새로운 전략이 절실히 필요하다는 것을 나타내는 CAR-T 세포 치료의 임상 경험에서 얻은 교훈을 기반으로 합니다. 그밖 종양은 병원에 들어가기 시작한 CAR-T 세포의 다중 수정을 허용하는 합성 생물학에 있는 최근 어드밴스에 의해 지원됩니다. 아연 핑거 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR과 같은 여러 게놈 엔지니어링 도구가 개발되고 적용되고 있는 동안, 당사의 방법론은 CAR-T 세포의 CRISPR/Cas9 수정을 설명합니다. ^{10개 , 11} CRISPR/Cas9는 외래 DNA를 제거하도록 설계된 RNA 기반 세균 방어 메커니즘입니다. CRISPR은 가이드 RNA (gRNA)를 통해 확인된 표적 서열을 갈라기 위하여 endonucleases에 의존합니다. CAR-T 세포의 CRISPR 편집은 다른 게놈 엔지니어링 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이들은 gRNA 순서의 정밀도, 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 디자인하는 단순성, 높은 유전자 편집 효율성 및 다중 gRNA가 동시에 사용될 수 있기 때문에 다중 유전자를 표적으로 하는 기능.

구체적으로 여기에 기술된 방법에서, 우리는 CRISPR 가이드 RNA 및 Cas9를 코딩하는 렌티바이러스를 사용하여 T 세포의 CAR 주입 동안 유전자를 중단하였다. CAR-T 세포를 편집하기 위한 적절한 기술을 선택할 때, 여기서 설명한 기술은 연구 등급 CAR-T 세포를 생성하는 효율적인 메커니즘이지만, Cas9를 게놈에 영구적으로 통합하는 장기적인 효과는 알려지지 않기 때문에, 우리는 개념 연구 등급 CAR-T 세포의 증거를 개발하지만 좋은 제조 연습 학년 CAR-T 세포를 생산하지 않는이 방법론을 제안한다.

특히, 여기서 우리는 인간 CD19를 표적으로 하는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 녹아웃 CAR-T 세포의 생성을 기술한다. 이들 CAR-T 세포는 GM-CSF(유전자 명 CSF2) 및 Cas9에 특이적인 가이드 RNA를 코딩하는 렌티바이러스 입자를 가진 트랜스덕션에 의해 생성되었다. 우리는 이전에 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CRS 및 NT를 개량한다는 것을 발견했습니다. ¹² 개의 GM-CSF^k/o CAR-T 세포는 제조 과정에서 GM-CSF의 억제를 허용하여 야생형 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 항종양 활성 및 생존을 향상시키면서 GM-CSF의 생산을 효과적으로 감소시킵니다. ¹² 따라서, 여기서 우리는 CRISPR/Cas9 편집된 CAR-T 세포를 생성하는 방법론을 제공한다.

프로토콜

이 프로토콜은 메이요 클리닉의 기관 검토 위원회 (IRB) 및 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 지침을 따릅니다.

1. CART19 셀 생산

1. T 세포 분리, 자극, 및 전 생체 배양
   1. 적절한 개인 보호 장비를 활용하여 세포 배양 후드에서 모든 세포 배양 작업을 수행합니다. PBMC의 실행 가능한 근원으로 apheresis 도중 집합된 de-identified 정상 기증자 혈액 콘에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수확하십시오.¹³
   2. PBMC를 분리하려면 밀도 그라데이션 매체의 15mL를 50mL 밀도 그라데이션 분리 튜브에 추가합니다. 세포 포획을 피하기 위해 2% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 인산완충식염수(PBS)와 동일한 부피로 기증자 혈액을 희석합니다.
      1. 원뿔에서 희석 된 기증자 혈액을 분리 튜브에 추가하고 혈액과 밀도 구배 배지 사이의 계면을 방해하지 않도록주의하십시오. RT에서 10 분 동안 1,200 x g의 원심 분리기.
      2. 상급체를 새로운 50 mL 원뿔형으로 장식하고, 최대 40 mL까지 가져와서 PBS + 2 % FBS로 씻고, RT에서 8 분 동안 300 x g의 원심 분리기, 흡기 상피, 버퍼 40 mL에서 재중단 및 셀 을 계산하십시오.
   3. 제조업체의 프로토콜에 따라 완전 자동화된 셀 분리기를 사용하여 음의 선택 자기 비드 키트를 통해 PBMC로부터 T 세포를 분리합니다.
   4. 단리된 T 세포를 배양하기 위해, 10% 인간 AB 혈청(v/v), 1% 페니실린-스트렙토마이신 글루타민(v/v), 및 혈청이 없는 조혈 세포 배지로 구성된 T 세포 배지(TCM)를 준비한다. 0.45 μm 멸균 진공 필터를 통해 여과한 다음 0.22 μm 멸균 진공 필터로 배지를 살균합니다.
   5. 0일째(T 세포 자극의 날)에, T 세포를 자극하기 전에 CD3/CD28 구슬을 씻는다. 세척하려면 필요한 양의 비드(3:1 비드:T 셀의 비율로 충분한 CD3/CD28 비드사용)를 멸균 된 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 놓고 TCM의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
   6. 자석과 접촉합니다.
   7. 1분 후, 한심을 흡인하고 1 mL의 신선한 TCM으로 재중단하여 구슬을 세척한다.
   8. 이 절차를 반복하여 총 3번의 세번을 세번 바하십시오.
   9. 세 번째 세척 후, 한의학 의 1 mL에 구슬을 다시 중단.
   10. T 셀을 계산합니다.
   11. 3:1 비드:셀의 비율로 구슬을 T 세포로 옮김.
   12. 세포를 1 x 10 6^세포 /mL의 최종 농도로 희석하십시오.
   13. 37°C에서 배양하고, 24시간 동안 5% CO2를 배양한다.
2. T 세포 형질 감염 및 변환
   1. BSL-2+ 예방 조치를 사용하여 렌티 바이러스 작업을 수행, 세포 배양 후드를 포함, 개인 보호 장비, 폐기하기 전에 표백제와 사용 된 재료의 소독.
   2. 렌티바이러스 벡터에서 CART19 구문구를 획득합니다.
      참고: 여기에 활용된 CART19 컨스트럭트는 시판되는 단백질 합성 벤더를 사용하여 드노보를 합성하도록 설계되었습니다. CAR 컨스트럭티드를 EF-1α 프로모터의 제어하에 3세대 렌티바이러스로 클로던트. 단일 사슬 가변 영역 단편은 FMC63 클론으로부터 파생되고 인간 CD19를 인식한다. CAR19 컨스트럭트는 2세대 4-1BB 코스티뮬레이션 도메인 및 CD3θ 자극(FMC63-41Bz)을 가지고 있다. ^12세
   3. 앞서 설명한 대로 렌티바이러스 생산을 수행합니다. ^12세
      1. 간단히 말해서, 렌티바이러스를 생산하기 위해 70-90%의 동률에 도달한 293T 세포를 활용합니다.
      2. 렌티바이러스 플라스미드 15 μg, 개그/폴/타트/레브 포장 벡터 18 μg, VSV-G 봉투 벡터 7 μg, 사전 착색 시약의 111 μL, 129 μL을 포함한 형질감염 시약의 실온에서 30분 동안 인큐베이션을 허용한다. 형질감염 시약, 및 293T 세포에 첨가하기 전에 형질감염 배지의 9.0 mL. 이어서 형질감염된 세포를 37°C, 5% CO2에서 배양한다.
      3. 수확, 원심 분리기 (10 분 동안 900 x g), 필터 (0.45 μM 나일론 필터), 및 18 시간 동안 13,028 x g 또는 2 시간 동안 112,700 x g에서 초원심 분리에 의해 24 및 48 h에서 상급농축.
      4. 나중에 사용하기 위해 -80 °C에서 동결하십시오.
   4. 1일째, T 세포를 부드럽게 재중단하여 0일째에 1 x 10 6/mL에서 자극된 T 세포의 장미를 분해합니다.
   5. 모든 렌티바이러스 작업에 대한 적절한 BSL-2+ 예방 조치하에, 3.0의 감염(MOI)의 복합성에서 자극된 T 세포에 신선하거나 냉동 수확된 바이러스를 첨가하십시오.
3. CAR-T 셀 확장
   1. 팽창의 단계 동안, 37°C, 5% CO2에서 형질전환된T 세포를 계속 배양한다. 3일 및 5일에 CAR-T 세포를 카운트하고, 1 x 10 6/mL의 CAR-T 세포농도를 유지하기 위해 배양에 신선하고 미리 온난한 TCM을 첨가한다.
   2. 자석을 이용하여 자극(6일째) 6일 후 트랜스듀싱된 T 세포로부터 비드를 제거한다. 50 mL 원추형 튜브에 T 세포를 1 분 동안 자석에 수확, 재 중단 및 배치합니다. 그런 다음 상급체(CAR-T 세포 포함)를 수집하고 구슬을 버립니다.
   3. 수집된 CAR-T 세포를 1 x 10⁶ 세포/mL의 농도로 배양하여 다시 배치하여 팽창을 재개한다.
   4. 6일째에, 유세포분석으로 CAR의 표면 발현을 평가한다.
      참고: 염소 항마우스 IgG(H+L)로 염색하거나 CD19 특이적 펩타이드로 염색하여 불소화로 컨쥬게이징하는 등 CAR의 표면 발현을 검출하는 데 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 여기서, 배양으로부터 aliquot(약 100,000 T 세포)를 취하고 덜베코의 인산완충식염수, 2% 태아 소 혈청 및 1% 나트륨 아지드로 제조된 유량 완충액으로 세척한다. 항 CAR 항체로 세포를 염색하고 두 번 씻으하십시오. 살아있는 / 죽은 얼룩 과 CD3 단일 클론 항체 (OKT3)로 세포를 얼룩. 셀을 세척하고 흐름 버퍼에서 다시 일시 중단합니다. 전도계를 획득하여 전도 효율을 결정합니다.
4. CAR-T 세포 냉동 보존
   1. CAR-T 세포를 자극 후 8일(T 세포 팽창 8일째) 수확하고 냉동 보존하기 위해 배양으로부터 세포를 수확한다.
   2. 300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하십시오.
   3. 10% 디메틸 설폭사이드 및 90% 태아 소 혈청으로 구성된 동결 배지에서 유리병 당 1,000만 개의 세포에서 동결 배지에 다시 중단합니다.
   4. 동결 용기에 동결하여 -80°C 냉동실에서 -1°C/min의 냉각 속도를 달성한 다음 48시간 후에 액체 질소로 옮김을 이월합니다.
   5. 시험관 내 또는 생체 내 실험에 사용하기 전에 따뜻한 TCM에서 CAR-T 세포를 해동하십시오.
   6. 세포를 세척하여 희석하고 디메틸 설폭사이드를 제거하고 따뜻한 TCM에서 2 x 10⁶ 세포 /mL의 농도로 다시 중단하십시오. 37 °C, 5 %CO2에서 하룻밤 휴식.

2. GM-CSF ^k/o CART19 생산

1. GM-CSF를 중단시키기 위하여는, 인간 사이토카인 GM-CSF를 위해 인코딩하는 CSF2 유전자에 대해 고효율을 가지는 것으로 보고된 gRNA 스크리닝을 통해 선택된 인간 GM-CSF(CSF2)의 가이드 RNA(gRNA)를 표적으로 하는 엑소3를 활용한다. ^14세
   참고: 이 gRNA를 함유하는 상업적으로 합성된 연구 등급 Cas9 3세대 렌티바이러스 구조(U6 프로모터 하에서)가 사용되었다. 컨스트럭트에는 푸로마이신 내성 유전자가 포함되어 있다. gRNA의 서열은 GACCTGCCTACAGACCCCCC이다. ^12세
2. 렌티바이러스를 생성하려면 70-90%의 동률에 도달한 293T 세포를 활용하십시오.
3. 관심 있는 렌티바이러스 플라스미드 15 μg, 개그/폴/타트/레브 포장 벡터 18 μg, VSV-G 봉투 벡터 7 μg, 사전 복합 시약 111μL, 트랜스펙션 시약 129 μL, 트랜스펙션 배지 9.0 mL을 허용하여 30분 동안 인큐베이팅 mperature.
4. 293T 세포에 형질감염 시약을 추가합니다. 이어서 37°C, 5%CO2에서 배양한다.
5. 수확, 원심분리기(10분동안 900 x g), 필터(0.45 μM 나일론 필터) 및 초원심분리에 의해 24 및 48시간에서 초원심분리에 의해 18시간 동안 13,028 x g 또는 112,700 x g의 초원분리기에서 2시간 동안 농축하고 향후 사용을 위해 -80°C에서 동결합니다.
6. 1일째에는 T 세포를 부드럽게 다시 일시 중단하여 장미를 분해합니다.
7. BSL-2+ 승인 된 실험실에서, CAR-T 세포를 생성 하는 자극 된 T 세포에 냉동 또는 갓 수확 된 바이러스를 추가. CAR19 렌티바이러스와 CRISPR 렌티바이러스를 표적으로 하는 GM-CSF 를 모두 가진 T 세포를 변환합니다. 3의 MOI에 CAR19 렌티 바이러스를 추가합니다. CRISPR 렌티바이러스의 적정이 가능하지 않았기 때문에, 15 ug 플라스미드 제제에서 생성된 바이러스 입자를 사용하여 10 x 10⁶ T 세포를 변환한다.
8. 1단계에서 논의된 바와 같이 T 세포 자극, 팽창 및 동결 보존의 나머지 단계를 참조하십시오.
9. 순수마이신 내성을 운반하는 렌티CRISPR 편집 T 세포의 경우, 3일째와 5일째에는 1 mL당 1 μg의 순으로 푸로마이신 디하이드로클로라이드로 세포를 치료하십시오.

3. GM-CSF 중단 효율 및 GM-CSF ^k/o CART19의 기능 평가

1. GM-CSF 중단 효율: 분해(TIDE) 시퀀싱 및 분석에 의한 인델 추적
   1. GM-CSF 유전자에 대한 관심의 엑슨을 서열화하려면, 다음 프라이머를 사용한다. TGACTACAGAGACACAGA의 GM-CSF(CSF2)에 대한 정방향 프라이머 시퀀스 및 TCACCTCTGACCTCATTAACC의 역방향 프라이머 시퀀스를 사용한다.
   2. 게놈 추출 키트로 최대 5백만 대의 CAR-T 세포에서 DNA를 추출합니다. PCR 반응을 위해, μM의 PCR 반응에서 각 프라이머의 최종 농도와 반응당 25 μL의 Taq mastermix를 사용하고, 템플릿 DNA의 0.1-0.5 μg, 및 총 PCR 반응의 총 부피는 뉴클레아제 자유물로 최대 50 μL까지 가져왔다.
   3. 표1에 설명된 PCR 사이클링 조건을 참조하십시오.
   4. 1-2% 아가로즈 젤에서 100V에서 30분 동안 PCR 샘플을 실행하고 젤 추출 키트를 사용하여 추출합니다.
   5. 시퀀스 PCR 앰플리온. 적절한 TIDE 소프트웨어에 원시 데이터를 업로드하여 대중 수정 빈도를 계산합니다. ^15세
2. GM-CSF 생산 및 GM-CSF^k/o CART19의 기능 평가
   1. CAR-T 세포의 사이토카인 생성을 결정하기 위해, CD19를 사용하여 급성 림프구성 백혈병 세포주 NALM6를 37°C에서 4시간 동안 1:5 비율로 발현하는 CD19를 사용하여 야생형 CART19 세포및 GM-CSF^k/o CART19을 배양하여 37°C에서 5% CO2의 모렌신이 존재할 때 솔루션, 반 인간 CD49d, 안티 인간 CD28, 및 반 인간 CD107a.
   2. 유세포측정을 위해 배양으로부터 세포를 수확한다. 유세포 분석 버퍼로 세포를 세척합니다. 살아있는/죽은 염색 키트로 세포를 염색합니다. 실온에서 15 분 동안 어둠 속에서 배양. 고정 매체로 세포를 고정하고 실온에서 15 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
   3. 세척 후, 세포를 반인간 IFNγ 단일클론 항체, 항인간 GM-CSF, 항인간 MIP-1β, 항인간 IL-2 및 반인간 CD3와 결합하여 투과성 배지로 세포 내로 염색하고 30에 대한 실온에서 어두운 환경에서 배양 샘플을 세척하고 다시 일시 중단하십시오. 유세포계에서 샘플을 획득하고 세포내 GM-CSF 발현비율을 분석하였다.

결과

그림 1은 GM-CSF^k/o CART19 셀에서 GM-CSF의 감소를 나타낸다. T 세포의 게놈이 녹아웃 GM-CSF로 변경되었는지 확인하기 위해, TIDE 시퀀싱을 GM-CSF^k/o CART19 세포(도1A)에서사용하였다. CAR-T 세포 표면 염색은 T 세포가 살아있는 CD3+ 세포상에서 게이팅을 통해 시험관 내에서 CAR 표면 수용체를 성공적으로 발현하는 것을 확인한...

토론

이 보고서에서는 CRISPR/Cas9 기술을 활용하여 CAR-T 세포의 이차 수정을 유도하는 방법론을 설명합니다. 구체적으로, 이것은 GM-CSF^k/o CART19 세포를 생성하기 위해 관심 유전자및 Cas9를 표적화하는 gRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 이용한 렌티바이러스 트랜스덕션을 사용하여 입증된다. 우리는 이전에 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CRS 및 NT를 개량한다는 것을 보여주었습니다. ^12<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17951	negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a	BD Pharmingen	555800
Fixation Medium (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge)	GenScript	N/A	custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	07851
Monensin Solution, 1000X	BioLegend	420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2	BD Pharmingen	559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10	BD Pharmingen	561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	CRL-3273	acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water	Promega	P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile	Genesee Scientific	25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM	Thermo Scientific Nalgene	450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid	Gibco	31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2	BD Horizon	562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid	Gibco	10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182001
Puromycin Dihydrochloride	MP Biomedicals, Inc.	0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421	BD Horizon	562930
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)	STEMCELL Technologies	85450
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q