שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.

Abstract

צ ' ושמעון אנטיגן לקולטן T (רכב-T) הטיפול בתאים הוא קצה חיתוך ואפשרות הטיפול המהפכני החדש של סרטן. עם זאת, ישנן מגבלות משמעותיות לשימוש נרחב בטיפול בסרטן. מגבלות אלה כוללות פיתוח של רעלים ייחודיים כגון תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT) והרחבה מוגבלת, פונקציות אפקטור, ופעילות נגד הגידול בגידולים מוצקים. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את היעילות רכב-T ו/או בקרת רעלים של תאי רכב-T היא לערוך את הגנום של התאים רכב-T עצמם במהלך ייצור תא רכב T. כאן, אנו מתארים את השימוש CRISPR/Cas9 gene העריכה בתאי רכב-T באמצעות התמרה עם בניית לנטינגיזציה המכילה RNA מדריך כדי גרנולוציט מקרופאג המושבה מגרה גורם (GM-שדרתי) ו Cas9. כדוגמה, אנו מתארים CRISPR/Cas9 בתיווך מתווכת של GM-שדרתי. הראינו כי אלה מוטורס-מכוניות מסוג^k/o מכונית T לייצר ביעילות gm-שדרתי פחות, תוך שמירה על פונקציית התאים הקריטיים t ותוצאה של פעילות אנטי סרטניים משופרת vivo לעומת מסוג פראי רכב-T תאים.

Introduction

שצ קולטן אנטיגן T (רכב-T) טיפול תא מציג הבטחה גדולה לטיפול בסרטן. מיכל ^{בן , 2} שתי מכונית-T טיפולים תא המיקוד CD19 (CART19) אושרו לאחרונה בארצות הברית הצהיר ובאירופה לשימוש B ממאירות תא לאחר הוכחת תוצאות מדהימות ב מולטיב להיכנס ניסויים קליניים. מיכל שלוש ^{, ד , 5} מחסומים לשימוש נרחב יותר של מכונית-T תאים הם פעילות מוגבלת של גידולים מוצקים ורעלים משויכים כולל תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT). מיכל שלוש ^, מיכל ^{5 ,} מיכל בן ^{6 ,} מיכל ^{סבן ,} בן שמונה ^{, 9} כדי לשפר את המדד התרפויטי של מכונית-t טיפול בתאים, הנדסת הגנום כלים כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, talens, ו CRISPR מועסקים לשנות עוד יותר תאים מכונית-t בניסיון לייצר פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-t תאים. מיכל ^{עשור ,} מיכל בן ¹¹

במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי ליצור CRISPR/Cas9 לערוך תאים רכב-T. המטרה הספציפית של שיטה זו היא לשנות גנטית בתאי רכב-T במהלך ייצור תא רכב-T באמצעות CRISPR/Cas9 כדי ליצור פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-T תאים. הרציונל לפיתוח מתודולוגיה זו בנויה על הלקחים שנלמדו מניסיון קליני של הטיפול בתאי רכב T, אשר מצביע על צורך דחוף אסטרטגיות הרומן כדי להגביר את החלון הטיפולי של המכונית-T טיפול בתאי ולהרחיב את היישום לתוך גידולים אחרים נתמך על ידי ההתקדמות האחרונה בביולוגיה סינתטי המאפשר שינויים מרובים של תאים רכב-T שהתחילו להיכנס למרפאה. בעוד כמה כלים הנדסת הגנום מפותחים ומיושמים בהגדרות שונות, כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, TALENs, ו CRISPR, המתודולוגיה שלנו מתארת CRISPR/Cas9 שינוי של תאים מכונית-T. מיכל ^{עשור , 11} crispr/Cas9 הוא מנגנון RNA מבוססי הגנה בקטריאלי אשר נועד לחסל DNA זר. CRISPR מסתמך על האנונוקיטיות כדי לדבוק רצף היעד מזוהה דרך RNA מדריך (gRNA). העריכה CRISPR של התאים רכב-T מציע מספר יתרונות על פני כלים אחרים הנדסת הגנום. אלה כוללים דיוק של רצף gRNA, פשטות לעצב gRNA מיקוד את הגן של עניין, גבוה לעריכת היעילות של הגן, ואת היכולת למקד גנים מרובים מאז Grna מרובים ניתן להשתמש באותו זמן.

באופן ספציפי בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו בקידוד מדריך CRISPR לקודד וירוס RNA ו Cas9 לשבש גן במהלך התמרה מכונית של תאי T. בבחירת הטכניקה המתאימה כדי לערוך מכונית T תאים, אנו מציעים את הטכניקה המתוארת כאן הוא מנגנון יעיל כדי ליצור מחקר כיתה תא רכב T, אבל בגלל ההשפעה לטווח ארוך של שילוב קבוע של Cas9 לתוך הגנום אינו ידוע, אנו להציע מתודולוגיה זו כדי לפתח הוכחה של מחקר המושג תאים-T בכיתה רכב, אבל לא להפקת טוב בפועל ייצור תאים מכונית-T.

בפרט, כאן אנו מתארים את הדור של גרנולוציט מקרופאג המושבה גורם מגרה (GM-שדרתי) הסתרה מכונית T תאים מיקוד האדם CD19. אלה תאי רכב-T נוצרו על ידי התמרה עם חלקיקים לקידוד מדריך RNA ספציפי GM-שדרתי (שם גן CSF2) ו Cas9. בעבר מצאנו כי הניטרול של GM-שדרתי הCRS קילה ו-NT במודל מבע. ¹² GM-שדרתי מכוניות^k/o -T תאים לאפשר עיכוב של gm-שדרתי במהלך תהליך הייצור, ביעילות להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שיפור הרכב-T תא אנטי גידול פעילות והישרדות vivo לעומת ווילטיפ רכב-t תאים. ¹² לכן, כאן אנו מספקים מתודולוגיה כדי ליצור CRISPR/CAS9 לרכב תאים T.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של הלוח המוסדי של מרפאת מאיו (IRB) והועדה הביובטיטיתית המוסדית (IBC).

1. הפקת תא CART19

1. בידוד תא T, גירוי ותרבות vivo לשעבר
   1. לבצע את כל התרבות תאים העבודה במכסה של תרבות התא ניצול ציוד הגנה אישית מתאים. בציר דם היקפי בתאי מוננובית (PBMCs) מתוך מזוהה התאים הרגילים של התורם מקונוסים דם שנאספו במהלך apheresis כמו אלה ידועים להיות מקור בר קיימא של PBMCs^.13
   2. כדי לבודד את PBMCs, הוסף 15 מ ל של בינוני מעבר הדרגתי בצפיפות לצינור הפרדה בצפיפות 50 mL. לדלל את הדם התורם עם נפח שווה של מלוחים באגירה פוספט (PBS) המכיל 2% סרום עוברי העובר (FBS) כדי למנוע השמנה תא.
      1. להוסיף את הדם התורם מדולל מן החרוט לתוך צינור ההפרדה, להיזהר לא להפריע את הממשק בין הדם ואת הצפיפות מעבר הצבע בינוני. צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 10 דקות ב-RT.
      2. Decant-supernatant לתוך החדש 50 mL חרוטי, לשטוף עם PBS + 2% FBS על ידי הבאת עד 40 mL, צנטריפוגה ב 300 x g עבור 8 דקות ב-RT, ולאחר מכן, השעיית מחדש ב 40 mL של מאגר, ולספור תאים.
   3. בידוד תאים T מ-PBMCs באמצעות ערכת חרוזים מגנטית בחירה שלילית באמצעות מפריד תא אוטומטי לחלוטין בהתאם לפרוטוקול של היצרן.
   4. לתרבות התאים T מבודדים, להכין תא T בינונית (TCM) המורכבת 10% סרום AB האנושי (v/v), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (v/v), ו-סרום ללא המטפאות בינונית תא. לחטא את המדיום על ידי סינון באמצעות מסנן ואקום סטרילי 0.45 יקרומטר ולאחר מכן עם 0.22 יקרומטר מסנן ואקום סטרילי.
   5. ביום 0 (היום של גירוי התא T), לשטוף CD3/CD28 חרוזים לפני גירוי של תאי T. כדי לשטוף, למקם את הנפח הנדרש של חרוזים (להשתמש מספיק CD3/CD28 חרוזים ליחס של 3:1 חרוזים: T תאים; שים לב את הריכוז של חרוזים יכול להיות משתנה) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 mL ו להשעות מחדש 1 מ ל TCM.
   6. . מקום בקשר עם מגנט
   7. אחרי 1 דקות, מטפי את TCM ולהשעות מחדש 1 מ ל של TCM טריים לשטוף את החרוזים.
   8. חזור על הליך זה עבור שלושה שוטפים בסך הכל.
   9. לאחר השטיפה השלישית, השהה מחדש את החרוזים ב 1 מ ל של TCM.
   10. . תספור את תאי הטי
   11. העברת חרוזים לתאי T ביחס של 3:1 חרוזים: תאים.
   12. לדלל תאים לריכוז הסופי של 1 x 10⁶ תאים/mL.
   13. מודטה ב 37 ° c, 5% CO₂ עבור 24 שעות.
2. העברה והתמרה של תאים
   1. לבצע את העבודה האנטי ויראלית באמצעות BSL-2 + אמצעי זהירות, כולל ביגוד תרבות התא, ציוד מגן אישי, חיטוי של חומרים משומשים עם אקונומיקה לפני הסילוק.
   2. לרכוש מבנה CART19 בתוך וקטור לויראלי.
      הערה: המבנה CART19 מנוצל כאן תוכנן ולאחר מכן מסונתז דה נובו באמצעות מסחרית זמין מסחרי סינתזה החלבון. בניית הרכב שוכפלה לאחר מכן הדור השלישי לווירוס בשליטה של מקדם EF-1α. קטע האזור של משתנה הרשת נגזר משיבוט FMC63 ומזהה את CD19 האנושי. המבנה הCAR19 בעל דור שני 4-1BB מגירוי וגירוי CD3ζ (FMC63-41BBz). מיכל ^{בן 12}
   3. ביצוע הפקה ויראלי כמתואר בעבר. מיכל ^{בן 12}
      1. בקצרה, כדי לייצר וירוס, לנצל תאים 293T שהגיעו 70-90% שליטה.
      2. אפשר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר של ריאגנטים החצייה כולל 15 μg של הפלסטיות הפלאנטי ויראלי של עניין, 18 μg של מחסום במחסום/פול/תאת/הפוך אריזה וקטור, 7 μg של vsv-G מעטפה וקטור, 111 μl של הקדם-complexing מגיב, 129 μl של ה מגיב החצייה, ו 9.0 mL של מדיום החצייה לפני הוספת התאים 293T. לאחר מכן התרבות התאים הטרנסג ב 37 ° c, 5% CO₂.
      3. הקציר, צנטריפוגה (900 x g עבור 10 דקות), מסנן (0.45 מסנן ניילון μM), ולהתרכז supernatant ב 24 ו 48 h על ידי ביטול הארכה ב או 13,028 x g עבור 18 h או 112,700 x g עבור 2 h.
      4. הקפא ב-80 ° c לשימוש עתידי.
   4. ביום 1, בעדינות מחדש את התאים t כדי לשבור את רוזטות טות של תאי t שהיו מגורה על 1 x 10⁶/mL ביום 0.
   5. תחת המתאים BSL-2 + אמצעי זהירות עבור כל העבודה האנטי ויראלית, להוסיף וירוס טרי או מוקפא לתאי T מגורה בריבוי של זיהום (מוי) של 3.0.
3. רכב-T הרחבה תא
   1. במהלך שלב של התרחבות, להמשיך להוסיף את תאי T מתתמרים ב 37 ° c, 5% CO₂. ספירת רכב-T תאים בימים 3 ו-5, ולהוסיף טריים, מחומם מראש כדי התרבות כדי לשמור על מכונית-T ריכוז תא של 1 x 10⁶/Ml.
   2. הסרת חרוזים מתאי T שעברו התמרה 6 ימים לאחר גירוי (יום 6) באמצעות מגנט. קציר, השהה מחדש, והמקום תאים T ב 50 מ"ל צינורות חרוטי ב מגנט עבור 1 דקות. לאחר מכן לאסוף את supernatant (מכיל את התאים-T רכב), ולהשליך את החרוזים.
   3. למקם את התאים שנאספו-T בחזרה בתרבות בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/mL כדי לחדש את ההתרחבות.
   4. ביום 6, לאמוד את הביטוי פני השטח של המכונית על ידי הזרמת cy, לנסות.
      הערה: מספר שיטות ניתן להשתמש כדי לזהות את הביטוי פני השטח של מכונית, כגון כתמים עם העין אנטי עכבר IgG (H + L) חוצה-adsorbed נוגדן משני או על ידי הצביעת עם CD19 פפטיד מסוים, מצועם ל fluorochrome. כאן, לקחת סדרת מחלקים (כ 100,000 T תאים) מן התרבות ולשטוף עם מאגר זרימה הכין עם מלוחים פוספט באגירה של dulbecco, 2% סרום העוברי העובר, ו 1% נתרן azide. להכתים את התאים עם נוגדן נגד מכונית ולשטוף פעמיים. הכתם את התאים עם כתם חי/מת ונוגדנים CD3 שבטיים (OKT3). שטוף את התאים והשהה מחדש במאגר הזרימה. לרכוש על cytometer כדי לקבוע התמרה יעילות.
4. הקפאה קריוגנית
   1. כדי הקציר והקפאת המכונית-T תאים 8 ימים לאחר גירוי (יום 8 של הרחבת התא T), לקצור את התאים מן התרבות.
   2. ספין למטה עבור 5 דקות ב 300 x g.
   3. להשעות מחדש ב הקפאה בינונית ב 10,000,000 תאים לכל mL למבחנה בהקפאה בינונית המורכבת 10% דימתיל תיל סולפוקסיד ו 90% העובר סרום.
   4. להקפיא במיכל קפוא כדי להשיג שיעור קירור של 1 ° c/min ב-80 מקפיא ° c ולאחר מכן להעביר לחנקן נוזלי אחרי 48 h.
   5. לפני השימוש שלהם בתוך מבחנה או בניסויים vivo, הפשרת תאים רכב T ב-TCM חם.
   6. לשטוף את התאים כדי לדלל ולהסיר את diמתיל סולפוקסיד ולהשעות מחדש לריכוז של 2 x 10⁶ תאים/ML ב TCM חם. מנוחה ללילה ב 37 ° c, 5% CO₂.

2. GM-שדרתי הייצור ^k/o CART19

1. כדי לשבש את מג-שדרתי, לנצל את מדריך RNA (grna) המיקוד אקסון 3 של האדם GM-שדרתי (CSF2) נבחר באמצעות הקרנת grna בעבר דיווחו כי יש יעילות גבוהה עבור הגן CSF2 המקודד עבור ציטוקינים האנושית GM-שדרתי. מיכל ^{בן 14}
   הערה: מחקר מסחרי מסונתז כיתה Cas9 הדור השלישי לבנה ויראלי המכיל gRNA זה (תחת מקדם U6) שימש. המבנה מכיל גן התנגדות מpuromycin. הרצף של הגרנה הוא גאקTGCCTGACTTTTTTTTTT. מיכל ^{בן 12}
2. כדי לייצר וירוס, לנצל 293T תאים שהגיעו 70-90% שליטה.
3. הרשו 15 μg של הפלסטיות הפלנגיאני של הריבית, 18 μg של מחסום במחסום/פול/תאת/הפוך אריזה וקטור, 7 μg של VSV-G מעטפה וקטור, 111 μL של הגיב טרום השלמת, 129 μL של מגיב החצייה, ו 9.0 mL של בינונית העברה כדי דגירה עבור 30 דקות בחדר te . מטבע הספרות
4. הוספת ריאגנטים לזיהום ה293t תאי t. ואז התרבות ב 37 ° c, 5% CO₂.
5. הקציר, צנטריפוגה (900 x g עבור 10 דקות), מסנן (0.45 מסנן ניילון μM) ולהתרכז supernatant ב 24 ו 48 h על ידי ביטול הארכה ב-13,028 x g עבור 18 h או 112,700 x g עבור 2 h ו להקפיא ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.
6. ביום 1, השהה מחדש בעדינות את תאי T כדי להפריד בין רוטות.
7. ב BSL-2 + מעבדה מאושרת, להוסיף וירוס קפוא או שנקטפו טרי לתאי T מגורה כדי ליצור תאים מכונית-T. השני תאים עם שניהם CAR19 הנגיף ו-GM-שדרתי מיקוד כשנגיף CRISPR. הוספת CAR19-וירוס ב-משרד הבית של 3. מאז טיטור של הנגיף crispr לא ניתן לביצוע, שימוש חלקיקי וירוס שנוצר מ 15 הכנה בלתי מבוקר הפלסטיות לשנות 10 x 10⁶ תאים T.
8. עיין בשלבים הנותרים של גירוי בתאי T, התרחבות והקפאה כמתואר בשלב 1.
9. עבור lentiCRISPR-בעריכת תאי T הנושאים puromycin עמידות, לטפל בתאים עם puromycin דיהידרוטסטוסטרון בריכוז של 1 μg של puromycin per 1 mL ביום 3 ויום 5.

3. GM-שדרתי שיבוש יעילות והערכה פונקציונלית של GM-שדרתי ^k/o CART19

1. בדיקות וניתוח מעקב אחר הפרעות ברצף
   1. כדי לסדר את הריבית בגנים של ג'נרל מוטורס, השתמש בצבעי היסוד הבאים. להשתמש ברצף פריימר קדימה עבור GM-שדרתי (CSF2) של TGACTACAGAGGCACAGA, ואת הרצף פריימר הפוכה של TCACCTCגנול ACCTCATTAACC.
   2. לחלץ DNA מ עד 5,000,000 מכונית-T תאים עם ערכת החילוץ גנומית. עבור התגובה PCR, השתמש 25 μl של מיקס מאסטר taq לכל תגובה עם ריכוז סופי של כל פריימר בתגובת ה-pcr של μm, 0.1-0.5 μg של DNA תבנית, וכמות כוללת של תגובת ה-PCR הביא עד 50 μl עם מים חינם נוקלאז.
   3. עיין בתנאי האופניים של ה-PCR המתוארים בטבלה 1.
   4. הפעל דגימות PCR על 1-2% agarose ג'ל ב 100 V עבור 30 דקות ולחלץ באמצעות ערכת החילוץ ג'ל.
   5. . רצף הגברה של הPCR חשב את תדירות השינוי של אלל על-ידי העלאת נתונים גולמיים לתוכנת גאות מתאימה. מיכל ^{בן 15}
2. GM-שדרתי הייצור והערכה פונקציונלית של GM-שדרתי CART19^k/o
   1. כדי לקבוע את הייצור ציטוקינים של מכונית-T תאים, דגירה סוג פראי CART19 תאים GM-שדרתי^k/o CART19 עם CD19 ביטוי חריפה לוקמיה לימפובלסטית קו NALM6 ביחס 1:5 עבור 4 h ב 37 ° צ', 5% CO₂ בנוכחות monensin הפתרון, האנטי-אנושי CD49d, CD28 אנטי-אנושי והCD107a האנטי-אנושי.
   2. הקציר תאים מהתרבות עבור cy, לזרום הציטונסה. לשטוף את התאים עם מאגר cy, הזרימה. כתם את התאים עם ערכת מכתים חי/מת. מודטה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. תקן את התאים עם מדיום קיבעון ו-דגירה בחושך בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
   3. לאחר כביסה, כתם את התאים הintracellularly עם בינוני החדירות בשילוב עם נוגדן אנטי אנושי IFNγ שבטיים, אנטי אדם GM-שדרתי, אנטי אדם MIP-1β, אנטי אדם IL-2, ו אנטי אדם CD3 ו דגירה בחושך בטמפרטורת החדר עבור 30 min. שטוף והשהה מחדש את הדגימות. לרכוש דגימות על cytometer זרימה מנותח עבור אחוז של הביטוי התאיים GM-שדרתי.

תוצאות

איור 1 מראה הפחתה של gm-שדרתי ב gm-שדרתי CART19 תאים^k/o . כדי לוודא כי הגנום של התאים T שונתה לנוקאאוט GM-שדרתי, רצף הגאות שימש בתאי GM^/o CART19 (איור 1a). רכב-T תא המשטח הצביעת מוודאת כי התאים T לבטא בהצלחה את קולטן פני השטח של המכונית בחוץ גופית ע...

Discussion

בדו ח זה, אנו מתארים מתודולוגיה לניצול CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה כדי לגרום שינויים משניים בתאי רכב-T. באופן ספציפי, זה מוצג באמצעות התמרה ויראלית עם וקטור ויראלי המכיל gRNA מיקוד הגן של עניין Cas9 לייצר GM-שדרתי התאים^k/o CART19. הצגנו בעבר כי הניטרול של GM-שדרתי נטרול קילה CRS ו-NT במודל מבע. ¹² ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17951	negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a	BD Pharmingen	555800
Fixation Medium (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge)	GenScript	N/A	custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	07851
Monensin Solution, 1000X	BioLegend	420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2	BD Pharmingen	559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10	BD Pharmingen	561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	CRL-3273	acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water	Promega	P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile	Genesee Scientific	25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM	Thermo Scientific Nalgene	450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid	Gibco	31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2	BD Horizon	562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid	Gibco	10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182001
Puromycin Dihydrochloride	MP Biomedicals, Inc.	0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421	BD Horizon	562930
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)	STEMCELL Technologies	85450
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q