Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para editar geneticamente as células CAR-T através de um sistema CRISPR/Cas9.

Resumo

A terapia de célula T (CAR-T) do receptor de antígeno quimérico é uma aresta de corte e uma nova opção de tratamento potencialmente revolucionária para câncer. No entanto, existem limitações significativas para o seu uso generalizado no tratamento do cancro. Estas limitações incluem o desenvolvimento de toxicidades originais tais como a síndrome da liberação do citocinas (CRS) e a neurotoxicidade (NT) e a expansão limitada, as funções efetoras, e a atividade antitumoral em tumores contínuos. Uma estratégia para melhorar a eficácia do CAR-T e/ou as toxicidades de controle das células CAR-t é editar o genoma das próprias células CAR-t durante a fabricação de células CAR-T. Aqui, nós descrevemos o uso da edição do gene de crispr/Cas9 em pilhas de Car-T através da transdução com uma construção lentivirais que contem um RNA do guia ao fator deestimulação da colônia do macrófago do granulocyte (GM-CSF) e Cas9. Como um exemplo, nós descrevemos o nocaute negociado CRISPR/Cas9 de GM-CSF. Nós mostramos que estas pilhas do carro-T do GM-CSF^k/o produzem eficazmente menos GM-CSF ao manter a função crítica da pilha de t e resultam na atividade antitumoral aumentada in vivo comparada às pilhas selvagens do tipo Car-t.

Introdução

O receptor quimérico T do antígeno (carro-T) a terapia da pilha exibe a grande promessa no tratamento do cancro. ^{1. º , 2} duas terapias da pilha do carro-T que alvejaram CD19 (CART19) foram aprovadas recentemente nos Estados Unidos indicados e em Europa para o uso em malignidades da pilha de B após ter provado resultados impressionantes em ensaios clínicos multicêntrico. ^{3. º , 4. º , 5} as barreiras ao uso mais difundido de pilhas de Car-T são atividade limitada em tumores contínuos e em toxicidades associadas que incluem a síndrome da liberação do citocinas (CRS) e o neurotoxicidade (NT). ^{3. º , 5. º , 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9} para realçar o índice terapêutico da terapia da pilha de Car-t, as ferramentas da engenharia do genoma tais como nucleases do dedo do zinco, Talens, e crispr são empregadas para modificar mais pilhas de Car-t em uma tentativa de gerar umas pilhas menos tóxicas ou mais eficazes de Car-t. ¹⁰ de ^{, 11} anos de

Neste artigo, descrevemos um método para gerar células CAR-T editadas CRISPR/Cas9. O objetivo específico deste método é modificar geneticamente as células CAR-T durante a fabricação de células Car-T via CRISPR/Cas9 para gerar células CAR-T menos tóxicas ou mais efetivas. A fundamentação para o desenvolvimento desta metodologia é construída sobre as lições aprendidas com a experiência clínica da terapia celular CAR-T, o que indica uma necessidade urgente de novas estratégias para aumentar a janela terapêutica da terapia celular CAR-T e estender a aplicação em outros tumores e é apoiado pelos recentes avanços na biologia sintética permitindo múltiplas modificações das células CAR-T que começaram a entrar na clínica. Enquanto várias ferramentas de engenharia do genoma estão sendo desenvolvidas e aplicadas em diferentes configurações, como nucleases de dedo de zinco, TALENs e CRISPR, nossa metodologia descreve a modificação de CRISPR/Cas9 de células CAR-T. ¹⁰ de ^{, 11} crispr/Cas9 é um mecanismo de defesa bacteriano baseado em RNA que é projetado para eliminar o DNA externo. O CRISPR baseia-se em endonucleases para Cleave uma sequência alvo identificada através de um RNA guia (gRNA). A edição CRISPR das células CAR-T oferece várias vantagens sobre outras ferramentas de engenharia do genoma. Estes incluem a precisão da sequência gRNA, simplicidade para projetar um gRNA visando o gene de interesse, alta eficiência de edição de genes, e a capacidade de segmentar vários genética, uma vez que vários gRNAs podem ser usados ao mesmo tempo.

Especificamente nos métodos descritos aqui, foi utilizado um Lentivirus codificação CRISPR guia RNA e Cas9 para interromper um gene durante a transdução do carro de células T. Ao selecionar uma técnica apropriada para editar células CAR-T, sugerimos que a técnica descrita aqui seja um mecanismo eficiente para gerar células CAR-T de grau de pesquisa, mas porque o efeito a longo prazo da integração permanente de Cas9 no genoma é desconhecido, nós propor esta metodologia para desenvolver a prova de conceito de pesquisa de grau de células CAR-T, mas não para a produção de boas práticas de fabrico grau CAR-T células.

Em particular, aqui nós descrevemos a geração de granulocyte macrófago colônia fator estimulante (GM-CSF) Knockout CAR-T células visando a CD19. Essas células CAR-T foram geradas por transdução com partículas lentivirais codificando um RNA guia específico para GM-CSF (Gene Name CSF2) e Cas9. Nós encontramos previamente que a neutralização do GM-CSF melhora CRS e NT em um modelo do xenograft. ¹² pilhas do GM-CSF^k/o Car-t permitem a inibição do GM-CSF durante o processo de manufactura, reduzindo eficazmente a produção de GM-CSF ao realçar a atividade do anti-tumor da pilha de Car-t e a sobrevivência in vivo comparado às pilhas do tipo selvagem Car-t. ¹² assim, aqui nós fornecemos uma metodologia para gerar crispr/Cas9 editado células Car-T.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de revisão institucional da clínica Mayo (IRB) e do Comitê de biossegurança institucional (IBC).

produção da pilha 1. CART19

1. Isolamento de células T, estimulação e cultura ex vivo
   1. Realize todo o trabalho da cultura de pilha em uma capa da cultura de pilha que utiliza o equipamento protetor pessoal apropriado. Colher células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de cones sanguíneos de doadores normais coletados durante a aférese, pois estes são conhecidos por serem uma fonte viável de PBMCs.¹³
   2. Para isolar PBMCs, adicione 15 mL de um meio de gradiente de densidade a um tubo de separação de gradiente de densidade de 50 mL. Diluir o sangue do doador com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) para evitar aprisionamento celular.
      1. Adicione o sangue do doador diluído do cone no tubo de separação, cuidado para não perturbar a interface entre o sangue e o meio de gradiente de densidade. Centrífuga a 1.200 x g por 10 min em RT.
      2. Decantar o sobrenadante em um novo 50 mL cônico, lave com PBS + 2% FBS trazendo até 40 mL, centrifugar a 300 x g por 8 min em RT, aspirar sobrenadante, ressuscite em 40 ml de tampão, e contagem de células.
   3. Isole células T de PBMCs através de um kit de talão magnético de seleção negativa usando um separador de células totalmente automatizado de acordo com o protocolo do fabricante.
   4. Para a cultura das células T isoladas, prepare o meio de célula T (TCM) que consiste em 10% de soro de AB humano (v/v), 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (v/v) e meio de células hematopoiéticas sem soro. Esterilize o meio filtrando através de um filtro de vácuo estéril de 0,45 μm e então com um filtro de vácuo estéril de 0,22 μm.
   5. No dia 0 (o dia da estimulação da célula T), lave os grânulos CD3/CD28 antes da estimulação de pilhas de T. Para lavar, coloc o volume exigido dos grânulos (use bastantes grânulos de CD3/CD28 para uma relação de 3:1 grânulos: pilhas de T; Note que a concentração de grânulos pode ser variável) em um tubo estéril do microcentrifugador de 1,5 mL e em um Ressuspender em 1 mL de TCM.
   6. Coloque em contato com um ímã.
   7. Após 1 min, aspirar o TCM e ressuscitem em 1 mL de TCM fresco para lavar as contas.
   8. Repita este procedimento para um total de três laves.
   9. Após a terceira lavagem, Ressuspender os grânulos em 1 mL de TCM.
   10. Conte as células T.
   11. Transfira grânulos às pilhas de T em uma relação de 3:1 grânulos: pilhas.
   12. Diluir as células para uma concentração final de 1 x 10⁶ células/ml.
   13. Incubar a 37 ° c, 5% CO₂ por 24 h.
2. Transfecção de células T
   1. Realize o trabalho lentivirais usando as precauções BSL-2 +, incluindo capas de cultura celular, equipamentos de proteção individual e desinfecção de materiais usados com lixívia antes da eliminação.
   2. Adquira uma construção CART19 em um vetor lentivirais.
      Nota: a construção CART19 utilizada aqui foi projetada e sintetizada de novo usando um fornecedor de síntese de proteínas comercialmente disponível. O constructo CAR foi posteriormente clonado em um Lentivirus de terceira geração controle de um promotor EF-1 α. O fragmento de região de variável de cadeia única é derivado do clone FMC63 e reconhece a CD19 humana. O constructo CAR19 possui um domínio costimulatório de segunda geração 4-1BB e estimulação CD3ζ (FMC63-41BBz). ^{12 anos} de
   3. Executar a produção de Lentivirus como descrito anteriormente. ^{12 anos} de
      1. Em resumo, para produzir Lentivirus, utilizar 293T células que atingiram 70-90% confluência.
      2. Permitir incubação por 30 min à temperatura ambiente de reagentes de transfecção, incluindo 15 μg do plasmídeo lentivirais de juros, 18 μg de um vetor de embalagem de GAG/pol/tat/Rev, 7 μg de um vetor de envelope VSV-G, 111 μl do reagente pré-complexante, 129 μl do Reagente de transfecção e 9,0 mL do meio de transfecção antes de adicionar às células 293T. Em seguida, a cultura das células transfected em 37 ° c, 5% CO₂.
      3. Colheita, centrifugador (900 x g por 10 min), filtro (filtro de nylon de 0,45 μm), e sobrenadante concentrado em 24 e 48 h por ultracentilgação em 13.028 x g para 18 h ou 112.700 x g para 2 h.
      4. Congelar em-80 ° c para uso futuro.
   4. No dia 1, reressuscite suavemente as células T para romper as rosetas das células T que foram estimuladas a 1 x 10⁶/ml no dia 0.
   5. apropriado BSL-2 + precauções para todo o trabalho lentivirais, adicionam o vírus colhido fresco ou congelado às pilhas de T estimuladas em um multiplicidade da infecção (moi) de 3,0.
3. Expansão celular CAR-T
   1. Durante a fase de expansão, continue a incubar as células T transinadas a 37 ° c, 5% CO₂. Conte as células CAR-T nos dias 3 e 5 e adicione TCM fresco e pré-aquecido à cultura para manter uma concentração de células CAR-T de 1 x 10⁶/ml.
   2. Retire os grânulos das células T transmóadas 6 dias após a estimulação (dia 6) com um íman. Colheita, ressuscitar e colocar células T em 50 mL de tubos cônicos em um ímã por 1 min. Em seguida, recolher o sobrenadante (contém as células CAR-T), e descartar as contas.
   3. Coloque as células CAR-T coletadas de volta na cultura em uma concentração de 1 x 10⁶ células/ml para retomar a expansão.
   4. No dia 6, avalie a expressão superficial do CAR por citometria de fluxo.
      Nota: diversos métodos podem ser usados para detectar a expressão de superfície do carro, tal como a mancha com um anticorpo secundário adsorto da IgG do anti-rato da cabra (H + L) ou manchando com um peptide específico CD19, conjugado a um fluorochrome. Tome uma alíquota (cerca de 100.000 células T) da cultura e lave com tampão de fluxo preparado com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco, soro bovino fetal a 2% e azida sódica a 1%. Manchar as células com o anticorpo anti-CAR e lave duas vezes. Manchar as células com mancha viva/morta e anticorpo monoclonal CD3 (OKT3). Lave as células e ressuscitem no tampão de fluxo. Adquira em um citômetro para determinar a eficiência da transdução.
4. Criopreservação de células CAR-T
   1. Para colher e cripreservar células CAR-T 8 dias após a estimulação (dia 8 de expansão da célula T), colher as células da cultura.
   2. Gire para baixo por 5 min em 300 x g.
   3. Ressuscitava em meio de congelação em 10 milhões células por mL por frasco em meio de congelação consistindo de 10% de sulfóxido de dimetil e 90% de soro bovino fetal.
   4. Congelar em um recipiente de congelamento para atingir uma taxa de resfriamento de-1 ° c/min em um-80 ° c freezer e depois transferir para nitrogênio líquido após 48 h.
   5. Antes do seu uso para experimentos in vitro ou in vivo, descongele as células CAR-T em TCM quente.
   6. Lave as células para diluir e remover o dimetil sulfóxido e ressuscitar para uma concentração de 2 x 10⁶ células/ml em TCM quente. Descanse durante a noite a 37 ° c, 5% CO₂.

2. GM-CSF ^k/o CART19 produção

1. Para interromper o GM-CSF, utilize um guia RNA (grna) visando exon 3 do GM-CSF humano (CSF2) selecionado através da seleção grnas relatado previamente para ter a eficiência elevada para o gene CSF2 que codifica para o GM-CSF humano do citocinas. ¹⁴ anos de
   Nota: utilizou-se um construto de pesquisa comercialmente sintetizado de grau Cas9 de terceira geração contendo este gRNA (sob um promotor U6). O construto contém um gene de resistência à puromicina. A sequência do gRNA é GACCTGCCTACAGACCCGCC. ^{12 anos} de
2. Para produzir Lentivirus, utilize células de 293T que atingiram 70-90% de confluência.
3. Permitir 15 μg do plasmídeo lentivirais de juros, 18 μg de um vetor de embalagem de GAG/pol/tat/Rev, 7 μg de um vetor de envelope VSV-G, 111 μl do reagente pré-complexante, 129 μl do reagente de transfecção e 9,0 ml do meio de transfecção para incubar por 30 min no quarto te rmal.
4. Adicionar reagentes de transfecção às células 293T. Então cultura em 37 ° c, 5% CO₂.
5. Colheita, centrifugação (900 x g por 10 min), filtro (filtro de nylon de 0,45 μM) e sobrenadante concentrado a 24 e 48 h por ultracentilgação a 13.028 x g durante 18 h ou 112.700 x g durante 2 h e congelar a-80 ° c para uso futuro.
6. No dia 1, resuspender suavemente as células T para quebrar Rosettes.
7. Em um laboratório aprovado BSL-2 +, adicione o vírus congelado ou recentemente colhido às pilhas de T estimuladas para gerar pilhas de CAR-T. Transduce células T com Lentivirus CAR19 e GM-CSF visando Lentivirus CRISPR. Adicionar CAR19 Lentivirus em um MOI de 3. Como a titulação do Lentivirus CRISPR não foi viável, o uso de partículas de vírus geradas a partir de uma preparação de 15 UG plasmídeo para transduce 10 x 10⁶ células T.
8. Veja as etapas restantes da estimulação, da expansão, e da criopreservação da célula T como discutido em etapa 1.
9. Para células T editadas por lentiCRISPR que transportam resistência à puromicina, trate as células com dicloridrato de puromicina numa concentração de 1 μg de puromicina por 1 mL no dia 3 e no dia 5.

eficiência do rompimento 3. GM-CSF e avaliação funcional do GM-CSF ^k/o CART19

1. Eficiência de ruptura GM-CSF: rastreamento de indels por sequenciamento e análise de decomposição (TIDE)
   1. Para sequenciar o exão de interesse no gene GM-CSF, use os seguintes primers. Use uma seqüência de primer para a frente para GM-CSF (CSF2) de TGACTACAGAGAGGCACAGA, e uma seqüência de primer reverso de TCACCTCTGACCTCATTAACC.
   2. Extraia o DNA de até 5 milhões células CAR-T com um kit de extração genômica. Para a reação do PCR, use 25 μL de um MasterMix de Taq por a reação com uma concentração final de cada primeira demão na reação do PCR do μM, 0.1-0.5 μg do ADN do molde, e um volume total da reação do PCR trazido até 50 μL com água livre do nuclease.
   3. Veja as condições de ciclagem da PCR descritas na tabela 1.
   4. Execute amostras de PCR em um gel de agarose de 1-2% a 100 V por 30 min e extraia usando um kit de extração de gel.
   5. Amplicons da PCR da seqüência. Calcule a frequência de modificação do alelo carregando dados brutos em um software TIDE apropriado. ^{15 anos} de
2. Produção de GM-CSF e avaliação funcional do GM-CSF^k/o CART19
   1. Para determinar a produção de citocinas de células CAR-T, incubar células selvagens do tipo CART19 e GM-CSF^k/o CART19 com o CD19 expressando linha celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 em uma proporção de 1:5 para 4 h a 37 ° c, 5% co₂ na presença de monensina solução, CD49d, anti-Human CD28, e CD107a anti-Human.
   2. Colha células da cultura para citometria de fluxo. Lave as células com tampão de citometria de fluxo. Manchar as células com um kit de coloração vivo/morto. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. fixar as células com um meio de fixação e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
   3. Após a lavagem, manchar as células intracelularmente com meio de permeabilização em combinação com anti-humanos IFNγ anticorpo monoclonal, anti-humano GM-CSF, anti-humano MIP-1 β, anti-humano Il-2, e anti-humano CD3 e incubar no escuro em temperatura ambiente para 30 min. Lave e ressuspender as amostras. Adquira amostras em um citômetro do fluxo e analisado para a porcentagem da expressão intracelular do GM-CSF.

Resultados

A Figura 1 mostra a redução do GM-CSF nas células GM-CSF^k/o CART19. Para verificar se o genoma das células T foi alterado para nocaute GM-CSF, o sequenciamento de TIDE foi utilizado nas células GM-CSF^k/o CART19 (Figura 1a). A mancha da superfície da pilha de CAR-T verifica que as pilhas de T expressam com sucesso o receptor de superfície do carro in vitro gating em pilhas CD3 + vivos (

Discussão

Neste relatório, nós descrevemos uma metodologia para utilizar a tecnologia de CRISPR/Cas9 para induzir modificações secundárias em pilhas de CAR-T. Especificamente, isso é demonstrado usando transdução lentivirais com um vetor viral que contém grna visando o gene de interesse e Cas9 para gerar células GM-CSF^k/o CART19. Nós tínhamos mostrado previamente que a neutralização de GM-CSF melhora CRS e NT em um modelo do xenograft. ¹² como descrito previamente, as pilhas do carr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17951	negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a	BD Pharmingen	555800
Fixation Medium (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge)	GenScript	N/A	custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	07851
Monensin Solution, 1000X	BioLegend	420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2	BD Pharmingen	559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10	BD Pharmingen	561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	CRL-3273	acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water	Promega	P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile	Genesee Scientific	25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM	Thermo Scientific Nalgene	450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid	Gibco	31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2	BD Horizon	562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid	Gibco	10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182001
Puromycin Dihydrochloride	MP Biomedicals, Inc.	0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421	BD Horizon	562930
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)	STEMCELL Technologies	85450
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q