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摘要

在这里,我们提出一个协议,通过CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行基因编辑。

摘要

奇美抗原受体T(CAR-T)细胞治疗是癌症的前沿和潜在的革命性新治疗选择。然而,在癌症治疗中广泛使用它存在重大限制。这些限制包括发展独特的毒性,如细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性 (NT) 和有限的扩张、 效应器功能和抗肿瘤活性在实体肿瘤.提高CAR-T效能和/或控制CAR-T细胞毒性的一个策略是在CAR-T细胞制造过程中编辑CAR-T细胞本身的基因组。在这里,我们描述了CRISPR/Cas9基因编辑在CAR-T细胞中通过转导与含有引导RNA的慢病毒结构,以颗粒细胞巨噬细胞菌群刺激因子(GM-CSF)和Cas9。例如,我们描述了CRISPR/Cas9对GM-CSF的介导淘汰。已经证明,与野生型CAR-T细胞相比,这些GM-CSFk/o CAR-T细胞在维持关键T细胞功能的同时,有效产生较少的GM-CSF,并增强体内抗肿瘤活性。

引言

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗在癌症治疗中显示出巨大的前景。1,2两种针对CD19(CART19)的CAR-T细胞疗法最近在美国和英国批准用于B细胞恶性肿瘤,在多中心临床试验中取得了显著成果。3,4,5 CAR-T细胞更广泛地使用的障碍是实体肿瘤和相关毒性(包括细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性(NT)中的活性有限。3,5,6,7,8,9为了提高CAR-T细胞治疗的治疗指标,利用锌指核酸酶、TALEN和CRISPR等基因组工程工具进一步修改CAR-T细胞,以产生毒性较低或更有效的CAR-T细胞。10,11

在本文中,我们将介绍一种生成 CRISPR/Cas9 编辑的 CAR-T 单元格的方法。该方法的具体目标是通过CRISPR/Cas9在CAR-T细胞制造过程中对CAR-T细胞进行基因改造,以产生毒性较低或更有效的CAR-T细胞。开发该方法的原理基于从CAR-T细胞治疗的临床经验中吸取的经验教训,这表明迫切需要新的策略来增加CAR-T细胞治疗的治疗窗口,并将应用扩展到其他肿瘤,并支持合成生物学的最新进展,允许CAR-T细胞的多次修改,已经开始进入诊所。当几种基因组工程工具正在开发并应用于不同的环境,如锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR 时,我们的方法描述了 CRISPR/Cas9 对 CAR-T 细胞的修饰。10,11 CRISPR/Cas9 是一种基于RNA的细菌防御机制,旨在消除外来DNA。CRISPR依靠内切酶来切出通过导引RNA(gRNA)识别的目标序列。与其他基因组工程工具的CRISPR编辑CAR-T细胞具有若干优势。其中包括gRNA序列的精确性、针对感兴趣的基因设计gRNA的简单性、高基因编辑效率,以及同时使用多个gRNA系统靶向多个基因的能力。

具体来说,在本文描述的方法中,我们使用一种慢病毒编码CRISPR指南RNA和Cas9在CAR转导T细胞过程中破坏基因。在选择适当的技术来编辑CAR-T细胞时,我们建议这里描述的技术是一种产生研究级CAR-T细胞的有效机制,但由于Cas9永久集成到基因组的长期影响是未知的,我们提出这种方法,以开发概念证明研究级CAR-T细胞,但不用于生产良好的制造实践级CAR-T细胞。

特别是,在这里,我们描述了以人类CD19为目标的粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)敲除CAR-T细胞的产生。这些CAR-T细胞是通过转导与慢病毒颗粒编码的指南RNA特定于GM-CSF(基因名称CSF2)和Cas9产生的。我们之前发现,GM-CSF 中和改善 CRS 和 NT 在异种移植模型中.12个 GM-CSFk/o CAR-T 细胞允许在制造过程中抑制 GM-CSF,有效减少 GM-CSF 的生产,同时提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性和在体内的存活率,与野生型 CAR-T 细胞相比。12因此,在这里,我们提供了一个生成 CRISPR/Cas9 编辑的 CAR-T 单元格的方法。

研究方案

该协议遵循梅奥诊所机构审查委员会(IRB)和机构生物安全委员会(IBC)的指导方针。

1. CART19细胞生产

  1. T细胞分离、刺激和前体培养
    1. 利用适当的个人防护设备,在细胞培养罩中执行所有细胞培养工作。从在阿汇期间收集的去识别的正常供体血锥中采集外周血单核细胞(PBMC),因为这些已知是PBMC的一个可行来源。
    2. 要分离 PBMC,将 15 mL 的密度梯度介质添加到 50 mL 密度梯度分离管中。用含有2%胎儿牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释供体血液,以避免细胞诱捕。
      1. 将锥体的稀释供血加入分离管中,小心不要干扰血液与密度梯度介质之间的界面。在 RT 下以 1,200 x g离心 10 分钟。
      2. 将上清液切成新的50 mL锥形,用PBS +2%FBS清洗,将300 x g的离心机在RT时8分钟,吸气上清,在40 mL的缓冲液中重新悬浮,并计数细胞。
    3. 根据制造商的协议,使用全自动电池分离器,通过负选择磁珠套件从 PBMC 中分离 T 细胞。
    4. 要培养分离的T细胞,制备由10%人AB血清(v/v)、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺(v/v)和无血清造血细胞培养基组成的T细胞培养基(TCM)。通过 0.45 μm 无菌真空过滤器过滤,然后用 0.22 μm 无菌真空过滤器对介质进行消毒。
    5. 在第0天(T细胞刺激日),在T细胞刺激之前清洗CD3/CD28珠。洗涤时,将所需的珠子体积(使用足够的CD3/CD28珠子,比例为3:1珠:T细胞;注意珠子的浓度可变化)放入无菌的1.5 mL微离心管中,并重新悬浮在1 mL的中药中。
    6. 与磁铁接触。
    7. 1分钟后,吸出中药,重新悬浮在1mL的新鲜中药洗珠。
    8. 重复此过程,共进行三次处理。
    9. 第三次洗涤后,将珠子重新悬浮在1mL的中药中。
    10. 计算 T 单元格。
    11. 将珠子以 3:1 珠子:细胞的比例传输到 T 细胞。
    12. 将细胞稀释至1 x 106细胞/mL的最终浓度。
    13. 在37°C下孵育,5%CO2孵育24小时。
  2. T细胞转染和转导
    1. 使用 BSL-2+ 预防措施进行慢病毒工作,包括细胞培养罩、个人防护设备,以及处理前用漂白剂对废旧材料进行消毒。
    2. 在慢病毒载体中获取 CART19 构造。
      注:此处使用的 CART19 构造是使用市售蛋白质合成供应商设计并合成的。在EF-1+启动子的控制下,CAR结构随后被克隆成第三代慢病毒。单链可变区域片段派生自 FMC63 克隆,可识别人类 CD19。CAR19结构拥有第二代4-1BB成本测量域和CD3-刺激(FMC63-41BBz)。12
    3. 执行前所述的慢病毒生产。12
      1. 简而言之,要产生慢病毒,利用293T细胞已经达到70-90%的汇合。
      2. 允许在转染试剂的室温下孵育30分钟,包括15微克感兴趣的慢病毒质粒、18微克的gag/pol/tat/rev包装载体、7μg的VSV-G包络载体、111μL的预复原试剂、129 μL的转染试剂,并在加入293T细胞之前,将转染介质的9.0 mL。然后在37°C,5%CO2培养转染细胞。
      3. 收集,离心机(900 x g 10 分钟),过滤器(0.45 μM 尼龙过滤器),并在 24 和 48 小时通过超离心化在 13,028 x g 18 h 或 112,700 x g 2 h 浓缩上清液。
      4. 冷冻在-80°C,以供将来使用。
    4. 在第1天,轻轻地重新悬浮T细胞,以分解T细胞的玫瑰花环,在第0天被刺激在1 x 106/mL。
    5. 在适当的BSL-2+预防措施下,对所有慢病毒工作,添加新鲜或冷冻收获的病毒到刺激的T细胞在3.0的多重感染(MOI)。
  3. CAR-T 细胞扩张
    1. 在扩张阶段,继续在37°C、5%CO2下孵育转导T细胞。在第3天和第5天计算CAR-T细胞,并在培养基中加入新鲜的预加热中药,以保持1 x 106/mL的CAR-T细胞浓度。
    2. 使用磁铁在刺激后 6 天(第 6 天)从转导 T 细胞中取出珠子。在磁铁中采集、重新悬浮并将 T 细胞放入 50 mL 锥形管中 1 分钟。然后收集上清液(包含 CAR-T 细胞),并丢弃珠子。
    3. 将收集的CAR-T细胞放回培养中,浓度为1 x 106细胞/mL,以恢复扩张。
    4. 在第6天,通过流式细胞测量评估CAR的表面表达。
      注:有几种方法可用于检测CAR的表面表现,例如用山羊抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附二级抗体染色,或通过与CD19特异性肽染色,与氟铬结合。在这里,从培养液中取一个等分(约100,000T细胞),用Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水、2%的胎儿牛血清和1%阿齐德钠制备的流动缓冲液洗涤。用抗CAR抗体染色细胞,洗涤两次。用活/死染色和CD3单克隆抗体(OKT3)染色细胞。清洗细胞并重新悬浮在流动缓冲液中。在细胞仪上采集以确定转导效率。
  4. CAR-T细胞冷冻保存
    1. 在刺激后8天(T细胞扩张的第8天),收获和冷冻保存CAR-T细胞,从培养中收获细胞。
    2. 在 300 x g下旋转 5 分钟。
    3. 在冷冻培养基中重新悬浮在冷冻培养基中,每瓶1000万个细胞,在冷冻培养基中,由10%二甲基硫酸盐和90%胎儿牛血清组成。
    4. 冷冻在冷冻容器中,在-80°C冷冻器中达到-1°C/min的冷却速度,然后在48小时后转移到液氮中。
    5. 在用于体外或体内实验之前,在温暖的中药中解冻CAR-T细胞。
    6. 清洗细胞以稀释和去除二甲基硫酸盐,并在热中药中重新悬浮至2 x 106细胞/mL的浓度。在37°C下过夜,5%CO2。

2. 通用-CSF k/o CART19 生产

  1. 为了破坏GM-CSF,利用一种针对人类GM-CSF(CSF2)的导引RNA(gRNA),通过筛选gRNA选择的人类GM-CSF(CSF2)具有高效率,该基因编码为人类细胞因子GM-CSF。14
    注:使用了商业合成的Cas9第三代慢病毒结构,该结构含有这种gRNA(U6启动子下)。该结构包含一个紫霉素抗性基因。gRNA的序列是GACCTGCCACACCCGCC。12
  2. 要产生慢病毒,利用已经达到70-90%汇合的293T细胞。
  3. 允许15μg感兴趣的慢病毒质粒,18μg的gag/pol/tat/rev包装载体,7μg的VSV-G包络载体,111μL的预复原试剂,129μL的转染试剂,9.0 mL的转染介质到孵育30分钟在房间te姆佩拉图。
  4. 向293T细胞添加转染试剂。然后在37°C培养,5%CO2。
  5. 收集,离心机(900 x g 10 分钟),过滤器(0.45 μM 尼龙过滤器)和浓缩上清液在 24 和 48 小时通过超离心在 13,028 x g 18 h 或 112,700 x g 2 h 和冻结在 -80 °C 供将来使用。
  6. 第1天,轻轻地重新悬挂T细胞,以分解玫瑰花环。
  7. 在BSL-2+认可的实验室中,将冷冻或新鲜收获的病毒添加到刺激的T细胞中,以产生CAR-T细胞。用CAR19慢病毒和GM-CSF转导T细胞,以CRISPR慢病毒为目标。在 MOI 为 3 处添加 CAR19 慢病毒。由于CRISPR扁病毒的滴定不可行,使用15微克质粒制剂产生的病毒颗粒转导10 x 106 T细胞。
  8. 如步骤1中所述,请参阅 T 细胞刺激、扩张和冷冻保存的剩余步骤。
  9. 对于具有抗紫霉素的经编辑的T细胞,在第3天和第5天以每1mL浓度1微克的二氯酸氯酸光酸处理细胞。

3. 全球机制-CSF中断效率和通用CSF k/o CART19的功能评估

  1. GM-CSF 中断效率:通过分解 (TIDE) 排序和分析跟踪 indel
    1. 要对GM-CSF基因感兴趣的外因进行测序,请使用以下引源。使用 TGACTAGAGAGCACAGA 的 GM-CSF (CSF2) 的正向引色序列,以及 TCACCTCTGACCAACC 的反向引色序列。
    2. 使用基因组提取试剂盒从多达 500 万个 CAR-T 细胞中提取 DNA。对于PCR反应,使用每反应25μL的Taq主混合物,在βM的PCR反应中,每个引基剂的最终浓度为0.1-0.5 μg的模板DNA,使用无核酸酶水,PCR反应的总体积可达50μL。
    3. 请参阅表 1中描述的 PCR 循环条件。
    4. 在100 V的1-2%甘蔗凝胶上运行PCR样品30分钟,并使用凝胶萃取试剂盒提取。
    5. 序列 PCR 放大剂。通过将原始数据上传到适当的 TIDE 软件来计算等位基因修改频率。15
  2. GM-CSF 生产与通用 CSFk/o CART19 的功能评估
    1. 为了确定CAR-T细胞的细胞因子生产,孵育野生型CART19细胞和GM-CSFk/o CART19与CD19表达急性淋巴细胞白血病细胞系NALM6在1:5的比例4小时在37°C,5%CO2存在莫尼辛溶液、反人类CD49d、反人类CD28和反人类CD107a。
    2. 从培养中收获细胞,用于流动细胞学。用流动细胞学缓冲液清洗细胞。用活/死染色套件染色细胞。在室温下在黑暗中孵育15分钟,用固定介质固定细胞,在室温下在黑暗中孵育15分钟。
    3. 洗涤后,用渗透介质在细胞内染色细胞,结合抗人IFN®单克隆抗体、抗人GM-CSF、抗人MIP-1+、抗人IL-2和反人类CD3,在室温下在黑暗中孵育30最小洗涤和重新悬浮样品。在流式细胞仪上采集样本,并分析细胞内GM-CSF表达的百分比。

结果

图1显示了GM-CSFk/o CART19单元中GM-CSF的减少。为了验证T细胞的基因组被改变为敲除GM-CSF,TIDE测序用于GM-CSFk/o CART19细胞(图1A)。CAR-T细胞表面染色验证T细胞是否通过在活CD3+细胞上浇注在体外成功表达CAR表面受体(图1B)。通过流动细胞测定对GM-CSF的细胞内染色,通过对活CD3+细胞的注控,证明GM-CSF在GM-...

讨论

在本报告中,我们描述了一种利用CRISPR/Cas9技术诱导CAR-T细胞二次修改的方法。具体来说,这证明使用慢病毒转导与病毒载体,含有gRNA靶向感兴趣的基因和Cas9生成GM-CSFk/o CART19细胞。我们之前已经表明,GM-CSF 中和在异种移植模型中可改善 CRS 和 NT。12如前所述,GM-CSFk/o CAR-T 电池允许在制造过程中抑制 GM-CSF,有效减少 GM-CSF 的生产,同时保持其他关键的 T 细胞功能,并增强体内...

披露声明

SSK 是 CAR T 细胞治疗领域的专利发明者,该专利授权给诺华(根据宾夕法尼亚大学梅奥诊所和诺华之间的协议)。这些研究部分由人类(SSK)的赠款资助。RMS、MJC、RS 和 SSK 是与本工作相关的专利的发明者。实验室 (SSK) 接受托莱罗、人类、风筝、伦蒂根、莫菲斯和Actinium的资助。

致谢

这项工作得到了K12CA090628(SSK)、国家综合癌症网络(SSK)、梅奥个性化医学诊所中心(SSK)、普雷多林基金会(SSK)、梅奥诊所执业翻译办公室(SSK)的资助。梅奥诊所医学科学家培训计划罗伯特·豪厄尔医生-科学家奖学金(RMS)。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscienceInvitrogen17-0038-42
Choice Taq Blue MastermixDenville ScientificC775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2Beckman CoulterC10343flow cytometer
dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144 
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a BD Pharmingen555800
Fixation Medium (Medium A)InvitrogenGAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2
CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector:
pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number:
High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free
of charge)		GenScriptN/Acustom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
https://tide.nki.nl.Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; USCorning35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscienceInvitrogen47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Monensin Solution, 1000XBioLegend420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2BD Pharmingen559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10BD Pharmingen561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7BD Pharmingen560687
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Scientific5100-0001
NALM6, clone G5 ATCCCRL-3273acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free WaterPromegaP119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterileGenesee Scientific25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uMThermo Scientific Nalgene450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), LiquidGibco31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2BD Horizon562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), LiquidGibco10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)InvitrogenGAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182001
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421BD Horizon562930
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

参考文献

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