Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T

Резюме

Здесь мы представляем протокол для генетического отсвагивая клетки CAR-T через систему CRISPR/Cas9.

Аннотация

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия является передний край и потенциально революционный новый вариант лечения рака. Тем не менее, существуют значительные ограничения на его широкое применение в лечении рака. Эти ограничения включают в себя развитие уникальных токсичностей, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT) и ограниченное расширение, функции эффектора и противоопухолевую активность в твердых опухолях. Одной из стратегий повышения эффективности CAR-T и/или контроля токсичности клеток CAR-T является редактирование генома самих клеток CAR-T во время производства клеток CAR-T. Здесь мы описываем использование редактирования генов CRISPR/Cas9 в клетках CAR-T с помощью трансдукции с лентивирусной конструкцией, содержащей направляющий РНК к гранулоцитной колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF) и Cas9. В качестве примера мы описываем CRISPR/Cas9 при посредничестве GM-CSF. Мы показали, что эти ГМ-CSF^{к / о} CAR-T клетки эффективно производят меньше ГМ-CSF при сохранении критической функции Т-клеток и привести к повышению противоопухолевой активности in vivo по сравнению с дикими клетками типа CAR-T.

Введение

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия демонстрирует большие перспективы в лечении рака. ^{1 , 2} Две CAR-T клеточной терапии ориентации CD19 (CART19) были недавно утверждены в Соединенных Заявленные и в Европе для использования в злокачественных новообразованиях клеток B после демонстрации поразительных результатов в многоцентровых клинических испытаний. ^{3 , 4 , 5} Барьерами для более широкого использования CAR-T-клеток являются ограниченная активность в твердых опухолях и связанных с ними токсичности, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT). ^{3 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9} Для повышения терапевтического индекса клеточной терапии CAR-T, инженерные инструменты генома, такие как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR используются для дальнейшего изменения car-T-клеток в попытке создать менее токсичные или более эффективные клетки CAR-T. ¹⁰ Лет ^{, 11 Год}

В этой статье мы описываем метод создания CRISPR/Cas9, отредактированных CAR-T-ячеек. Конкретная цель этого метода заключается в том, чтобы генетически модифицировать CAR-T-клетки во время производства клеток CAR-T через CRISPR/Cas9 для создания менее токсичных или более эффективных клеток CAR-T. Обоснование для разработки этой методологии основывается на уроках, извлеченных из клинического опыта клеточной терапии CAR-T, что указывает на настоятельную необходимость новых стратегий для увеличения терапевтического окна клеточной терапии CAR-T и расширения применения в других опухолей и поддерживается последние достижения в синтетической биологии позволяет несколько модификаций CAR-T клеток, которые начали поступать в клинику. В то время как несколько инженерных инструментов генома разрабатываются и применяются в различных условиях, таких как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR, наша методология описывает модификацию CRISPR/Cas9 клеток CAR-T. ¹⁰ Лет ^{, 11} CRISPR/Cas9 является РНК-механизм защиты от бактерий, который предназначен для устранения чужеродных ДНК. CRISPR полагается на эндонуклеазы, чтобы расщеплять целевую последовательность, идентифицированную через направляющий РНК (gRNA). CRISPR редактирования CAR-T клеток предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими инструментами инженерного генома. К ним относятся точность последовательности gRNA, простота для разработки gRNA ориентации гена интереса, высокая эффективность редактирования генов, и способность целевых нескольких генов, поскольку несколько гРНК могут быть использованы в то же время.

В частности, в методах, описанных здесь, мы использовали лентивирус, кодируя CRISPR руководство РНК и Cas9 нарушить ген во время трансдукции Т-клеток CAR. При выборе подходящей техники для редактирования CAR-T-клеток, мы предлагаем метод, описанный здесь является эффективным механизмом для создания исследований класса CAR-T клеток, а потому, что долгосрочный эффект постоянной интеграции Cas9 в геном неизвестен, мы предложить эту методологию для разработки доказательства концепции исследования класса CAR-T клеток, но не для производства хорошей производственной практике класса CAR-T клеток.

В частности, здесь мы описываем генерацию гранулоцитов макрофагов колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) нокаутОМ CAR-T клеток ориентации человека CD19. Эти клетки CAR-T были созданы путем трансдукции с лентивирными частицами, кодируя направляющую РНК, специфичную для GM-CSF (генное название CSF2) и Cas9. Ранее мы обнаружили, что нейтрализация GM-CSF упрощает CRS и NT в модели ксенотрансплантата. ¹² ГМ-CSF^k/o CAR-T-клетки позволяют ингибировать ГМ-CSF в процессе производства, эффективно снижая производство ГМ-CSF при одновременном повышении противоопухолевой активности CAR-T и выживания в vivo по сравнению с клетками WILDtype CAR-T. ¹² Таким образом, здесь мы предоставляем методологию для создания CRISPR/Cas9 отредактированные клетки CAR-T.

протокол

Этот протокол следует руководящим принципам Совета по институциональному обзору клиники Майо (IRB) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC).

1. производство клеток CART19

1. Изоляция Т-клеток, стимуляция и культура бывших виво
   1. Выполняйте всю работу клеточной культуры в капюшоне клеточной культуры с использованием соответствующего средства индивидуальной защиты. Урожай периферических клеток крови (ПБМК) из деидентифицированных нормальных конусов донорской крови, собранных во время афереза, поскольку они, как известно, являются жизнеспособным источником ПБМК.¹³
   2. Чтобы изолировать ПБМК, добавьте 15 мл среды градиента плотности к 50 мл градиентной трубки. Разбавить донорскую кровь с равным объемом фосфат-буферизированного соления (PBS), содержащего 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), чтобы избежать клеточного улавливания.
      1. Добавить разбавленную донорскую кровь из конуса в сепарящую трубку, стараясь не нарушить интерфейс между кровью и градиентной средой плотности. Центрифуга при 1200 х г в течение 10 мин на RT.
      2. Декант супернатант в новый 50 мл конический, мыть с PBS 2% FBS, в результате чего до 40 мл, центрифуга на 300 х г в течение 8 минут на RT, аспират супернатант, resuspend в 40 мл буфера, и рассчитывать ячейки.
   3. Изолировать Т-клетки от PBMCs через отрицательный набор магнитного бисера выбор с помощью полностью автоматизированного сепаратора ячейки в соответствии с протоколом производителя.
   4. Чтобы культура изолированных Т-клеток, подготовить Т-клеточной среды (TCM), которая состоит из 10% человека AB сыворотки (v/v), 1% пенициллилин-стрептомицин-глютамин (v/v), и сыворотки свободной гематопоитической клеточной среде. Стерилизовать среду путем фильтрации через 0,45 мкм стерильный вакуумный фильтр, а затем с 0,22 мкм стерильный вакуумный фильтр.
   5. На день 0 (день стимуляции Т-клеток) мыть шарики CD3/CD28 до стимуляции Т-клеток. Для мытья поместите необходимый объем бисера (используйте достаточное количество бисера CD3/CD28 для соотношения 3:1 бисера:T-клеток; обратите внимание, что концентрация бисера может быть переменной) в стерильной микроцентрифуговой трубке 1,5 мл и переприкоситесь в 1 мл ТКМ.
   6. Поместите в контакт с магнитом.
   7. Через 1 мин, аспирировать TCM и resuspend в 1 мл свежих TCM для мытья бисера.
   8. Повторите эту процедуру в общей сложности три стирания.
   9. После третьей стирки, resuspend бисера в 1 мл TCM.
   10. Посчитайте Т-клетки.
   11. Передача бисера в Т-клетки в соотношении 3:1 бусинки: клетки.
   12. Разбавить клетки до конечной концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл.
   13. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ на 24 ч.
2. Трансфекция и трансдукция Т-клеток
   1. Выполняйте лецивирные работы с использованием мер предосторожности BSL-2, включая вытяжки клеточной культуры, средства индивидуальной защиты и дезинфекцию использованных материалов с помощью отбеливателя перед удалением.
   2. Приобретите конструкцию CART19 в лентивирусном векторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: конструкция CART19, используемая здесь, была разработана, а затем синтезирована de novo с использованием коммерчески доступного поставщика синтеза белка. Конструкция ЦАР была впоследствии клонирована в третье поколение лентивирусподов под контролем промоутера EF-1. Фрагмент одной цепной переменной области получен от клона FMC63 и распознает CD19 человека. Конструкция CAR19 обладает вторым поколением 4-1BB costimulatory домена и CD3 "стимуляции (FMC63-41BBz). ^{12 Лет}
   3. Выполните лентивирусное производство, как описано ранее. ^{12 Лет}
      1. Короче говоря, для производства лентивирус, использовать 293T-клеток, которые достигли 70-90% confluency.
      2. Разрешить инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре трансфекционных реагентов, включая 15 мкг ленцивирусной плазмиды интереса, 18 мкг кляпа/поль/тат/рев упаковочного вектора, 7 мкг вектор конверта VSV-G, 111 л предварительно комплексного реагента, 129 трансфекционный реагент и 9,0 мл трансфекционного носителя перед добавлением в 293T-клетки. Затем культура транс-инфицированных клеток на 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
      3. Урожай, центрифуга (900 х г на 10 мин), фильтр (0,45 мм нейлонового фильтра) и концентрат супернатант на 24 и 48 ч при ультрацентрифугации при 13 028 х г на 18 ч или 112 700 х г для 2 ч.
      4. Заморозить при -80 градусов по Цельсию для использования в будущем.
   4. На 1 день, осторожно resuspend Т-клеток, чтобы разбить розетки Т-клеток, которые были стимулированы на 1 х 10⁶/мл на день 0.
   5. При соответствующих мерах предосторожности BSL-2 "для всех лецивирных работ, добавить свежий или замороженный собранный вирус в стимулированных Т-клеток при множественности инфекции (MOI) 3,0.
3. Расширение ячейки CAR-T
   1. Во время фазы расширения, продолжать инкубировать трансиндуцированных Т-клеток при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂. Подсчитайте клетки CAR-T в 3 и 5 дней и добавьте свежие, предварительно разогретыеТКМ в культуру для поддержания концентрации клеток CAR-T 1 х 10 6/мл.
   2. Удалить бисер из трансиндуцированных Т-клеток через 6 дней после стимуляции (День 6) с помощью магнита. Урожай, resuspend, и место Т-клеток в 50 мл конических труб в магнит в течение 1 мин. Затем соберите супернатант (содержит клетки CAR-T) и отбросьте бусины.
   3. Поместите собранные клетки CAR-T обратно в культуру в концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл, чтобы возобновить расширение.
   4. На 6-й день оцените поверхностное выражение ЦАР по цитометрии потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько методов могут быть использованы для обнаружения поверхности выражение ЦАР, таких как окрашивание с козой анти-мышь IgG (H'L) кросс-адсорбированных вторичного антитела или путем окрашивания с CD19 конкретный пептид, конъюгированный для фторхрома. Здесь возьмите аликот (около 100 000 Т-клеток) из культуры и смойте буфером потока, подготовленным с фосфатным солевым раствором Dulbecco, 2% сыворотки плода и 1% азид натрия. Попятнать клетки анти-CAR антитела и мыть дважды. Пятно клеток с живым / мертвым пятном и CD3 моноклональных антител (OKT3). Вымойте ячейки и повторно приостановите в буфере потока. Приобрести на цитометр для определения эффективности трансдукции.
4. Криоконсервация клеток CAR-T
   1. Для сбора урожая и криоконсервирования CAR-T-клеток через 8 дней после стимуляции (День 8 расширения Т-клеток), урожай клеток из культуры.
   2. Спин вниз в течение 5 мин на 300 х г.
   3. Resuspend в замораживании среды на 10 миллионов клеток на мл на флакон в замораживании среды, состоящей из 10% диметил сульфоксид и 90% плода крупного рогатого скота сыворотки.
   4. Заморозить в замораживающем контейнере для достижения скорости охлаждения -1 кв/мин в морозильной камере -80 градусов, а затем передать в жидкий азот после 48 ч.
   5. До их использования для экспериментов in vitro или in vivo, оттаивать клетки CAR-T в теплом ТКМ.
   6. Вымойте клетки, чтобы разбавить и удалить диметилсульфод и повторно до концентрации 2 х 10⁶ клеток / мл в теплой TCM. Отдых на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂.

2. Производство GM-CSF ^k/o CART19

1. Чтобы нарушить GM-CSF, используйте руководство РНК (gRNA) ориентации экзон 3 человека GM-CSF (CSF2), выбранных с помощью скрининга gRNAs ранее сообщалось, что высокая эффективность для гена CSF2, который кодирует для человека цитокина ГМ-CSF. ^{14 Год}
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески синтезированный исследовательский класс Cas9 третьего поколения лентивирусной конструкции, содержащей эту gRNA (под U6 промоутер) был использован. Конструкция содержит ген устойчивости к пуромицину. Последовательность gRNA является GACCTGCCTACACCACCCGCGCCCCCC. ^{12 Лет}
2. Для производства лентивирус, использовать 293T-клеток, которые достигли 70-90% confluency.
3. Разрешить 15 мкг лецивирусной плазмиды интереса, 18 мкг кляп / поль / тат / оборот упаковки вектор, 7 мкг вектор конверта VSV-G, 111 л докомплексного реагента, 129 л трансфекционного реагента, и 9,0 мл трансфекционного среднего инкубировать в течение 30 минут в комнате tefection te мпературы.
4. Добавьте трансфекционные реагенты в 293T-клетки. Затем культура при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂.
5. Урожай, центрифуга (900 х г на 10 мин), фильтр (0,45 мм нейлонового фильтра) и концентрат супернатант на 24 и 48 ч при ультрацентрифугации при 13 028 х г на 18 ч или 112 700 х г для 2 ч и заморозить при -80 градусов по Цельсию для будущего использования.
6. На 1-й день, осторожно resuspend Т-клеток, чтобы разбить розетки.
7. В одобренной лаборатории BSL-2 ' добавьте замороженный или свежесобранный вирус в стимулируемые Т-клетки для генерации клеток CAR-T. Преобразуйте Т-клетки как с лентивирусом CAR19, так и с ГМ-CSF, нацеленным на лентивирус CRISPR. Добавить лентивирус CAR19 в МВД 3. Поскольку титрование лецивируса CRISPR было неосуществимо, используйте вирусные частицы, генерируемые из 15-ug плазмидного препарата, чтобы преобразовать 10 х 10⁶ Т-клеток.
8. Ознакомьтесь с оставшимися шагами стимуляции Т-клеток, расширения и криоконсервации, которые обсуждаются в шаге 1.
9. Для lentiCRISPR-отредактированные Т-клетки, несущие устойчивость к пуромицину, лечить клетки с пуромицин дигидрохлоридом в концентрации 1 мкг пуромицина на 1 мл на 3 день и день 5 .

3. Эффективность сбоев ГМ-КСФ и функциональная оценка GM-CSF ^k/o CART19

1. Эффективность сбоев GM-CSF: отслеживание инделов путем секвенирования и анализа разложения (TIDE)
   1. Чтобы секвенировать экзон, представляющий интерес к гену GM-CSF, используйте следующие грунтовки. Используйте последовательность переднего грунта для GM-CSF (CSF2) TGACTAGAGAGGAGA, а также обратную последовательность грунтовки TCACCTCTGACCCATTAACC.
   2. Извлеките ДНК из до 5 миллионов клеток CAR-T с набором геномной экстракции. Для реакции ПЦР используйте 25 qL taq mastermix за реакцию с конечной концентрацией каждого грунтовки в реакции ПЦР в реакции ПЦР, 0,1-0,5 мкг ДНК шаблона, а общий объем реакции ПЦР доведен до 50 л с нуклеайозом свободной воды.
   3. Смотрите условия цикла PCR, описанные в таблице 1.
   4. Выполнить образцы ПЦР на 1-2% агарозный гель при 100 В в течение 30 минут и экстракт с помощью комплекта извлечения геля.
   5. Последовательность ампулконов ПЦР. Рассчитайте частоту изменений аллелей, загрузив необработанные данные в соответствующее программное обеспечение TIDE. ^{15 лет}
2. ГМ-CSF производства и функциональной оценки GM-CSF^{к / o} CART19
   1. Для определения производства цитокинов CAR-T-клеток, инкубировать дикий тип CART19 клеток и GM-CSF^{к / о} CART19 с CD19, выражающий острый лимфальный лейкоз клеточной линии NALM6 в 1:5 соотношение для 4 ч при 37 c, 5% CO₂ в присутствии монезина решение, анти-человеческий CD49d, анти-человек CD28, и анти-человек CD107a.
   2. Урожай ные клетки из культуры для потока цитометрии. Вымойте клетки с потоком цитометрии буфера. Пятно клетки с живой / мертвый комплект окрашивания. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Зафиксировать клетки с фиксацией среды и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.
   3. После мытья, пятно клеток внутриклеточного с пермяковской средой в сочетании с анти-человеческой IFN ' моноклонального антитела, анти-человеческого ГМ-CSF, анти-человека MIP-1, анти-человека IL-2, и анти-человека CD3 и инкубировать в темноте при комнатной температуре для 30 мин. Вымойте и повторно приостановите образцы. Приобретайте образцы на цитометр потока и анализируйте процент внутриклеточного выражения GM-CSF.

Результаты

На рисунке 1 показано сокращение ГМ-CSF в клетках GM-CSF^k/o CART19. Чтобы убедиться, что геном Т-клеток был изменен на нокаут ГМ-CSF, tide секвенирования был использован в GM-CSF^{к / о} CART19 клеток (Рисунок 1A). CAR-T клеточной поверхности окрашивани?...

Обсуждение

В этом отчете мы описываем методологию использования технологии CRISPR/Cas9 для индуцирования вторичных изменений в клетках CAR-T. В частности, это продемонстрировано с помощью лентивирусной трансдукции с вирусным вектором, который содержит gRNA ориентации гена интереса и Cas9 для создания ГМ-CSF...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17951	negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a	BD Pharmingen	555800
Fixation Medium (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge)	GenScript	N/A	custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	07851
Monensin Solution, 1000X	BioLegend	420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2	BD Pharmingen	559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10	BD Pharmingen	561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	CRL-3273	acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water	Promega	P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile	Genesee Scientific	25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM	Thermo Scientific Nalgene	450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid	Gibco	31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2	BD Horizon	562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid	Gibco	10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182001
Puromycin Dihydrochloride	MP Biomedicals, Inc.	0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421	BD Horizon	562930
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)	STEMCELL Technologies	85450
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q