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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.

Zusammenfassung

Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie ist eine innovative und potenziell revolutionäre neue Behandlungsoption für Krebs. Allerdings gibt es erhebliche Einschränkungen für seine weit verbreitete Verwendung bei der Behandlung von Krebs. Zu diesen Einschränkungen gehören die Entwicklung einzigartiger Toxizitäten wie Zytokin-Release-Syndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT) und begrenzte Expansion, Effektorfunktionen und Anti-Tumor-Aktivität bei soliden Tumoren. Eine Strategie zur Verbesserung der CAR-T-Wirksamkeit und/oder zur Kontrolle der Toxizität von CAR-T-Zellen besteht darin, das Genom der CAR-T-Zellen während der Herstellung von CAR-T-Zellen selbst zu bearbeiten. Hier beschreiben wir die Verwendung von CRISPR/Cas9 Gen-Editing in CAR-T-Zellen mittels Transduktion mit einem lentiviralen Konstrukt, das eine Führungs-RNA zum Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Cas9 enthält. Als Beispiel nennen wir CRISPR/Cas9 vermittelten Knockout von GM-CSF. Wir haben gezeigt, dass diese GM-CSFk/o CAR-T-Zellen effektiv weniger GM-CSF produzieren, während sie die kritische T-Zellfunktion beibehalten und zu einer verbesserten Anti-Tumor-Aktivität in vivo im Vergleich zu wilden CAR-T-Zellen führen.

Einleitung

Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie zeigt großes Versprechen in der Behandlung von Krebs. 1 , 2 Zwei CAR-T-Zelltherapien, die auf CD19 (CART19) abzielen, wurden kürzlich in den Vereinigten Staaten und in Europa für die Anwendung bei B-Zell-Malignitäten zugelassen, nachdem sie auffällige Ergebnisse in multizentrischen klinischen Studien nachgewiesen hatten. 3 , 4 , 5 Hindernisse für eine breitere Nutzung von CAR-T-Zellen sind begrenzte Aktivität bei soliden Tumoren und damit verbundenen Toxizitäten wie Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Um den therapeutischen Index der CAR-T-Zelltherapie zu verbessern, werden Genom-Engineering-Tools wie Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR eingesetzt, um CAR-T-Zellen weiter zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. 10 , 11

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zum Generieren von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen. Das spezifische Ziel dieser Methode ist es, CAR-T-Zellen während der HERSTELLUNG von CAR-T-Zellen über CRISPR/Cas9 genetisch zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Methodik basieren auf den Erkenntnissen aus klinischen Erfahrungen mit der CAR-T-Zelltherapie, die auf die dringende Notwendigkeit neuer Strategien hinweisen, um das therapeutische Fenster der CAR-T-Zelltherapie zu erhöhen und die Anwendung auf andere Tumoren und wird durch die jüngsten Fortschritte in der synthetischen Biologie unterstützt, die mehrere Modifikationen von CAR-T-Zellen ermöglichen, die begonnen haben, in die Klinik zu gelangen. Während mehrere Genom-Engineering-Tools entwickelt und in verschiedenen Umgebungen eingesetzt werden, wie Z.B. Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR, beschreibt unsere Methodik die CRISPR/Cas9-Modifikation von CAR-T-Zellen. 10 , 11 CRISPR/Cas9 ist ein RNA-basierter bakterieller Abwehrmechanismus, der entwickelt wurde, um fremde DNA zu eliminieren. CRISPR stützt sich auf Endonukleasen, um eine Zielsequenz zu spalten, die durch eine Guide-RNA (gRNA) identifiziert wurde. Die CRISPR-Bearbeitung von CAR-T-Zellen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-Engineering-Tools. Dazu gehören die Genauigkeit der gRNA-Sequenz, die Einfachheit bei der Entwicklung einer gRNA, die auf das Gen von Interesse abzielt, eine hohe Gen-Editing-Effizienz und die Fähigkeit, mehrere Gene anzusprechen, da mehrere gRNAs gleichzeitig verwendet werden können.

Insbesondere in den hier beschriebenen Methoden verwendeten wir eine Lentivirus-Codierung von CRISPR-Guide-RNA und Cas9, um ein Gen während der CAR-Transduktion von T-Zellen zu stören. Bei der Auswahl einer geeigneten Technik zur Bearbeitung von CAR-T-Zellen schlagen wir vor, dass die hier beschriebene Technik ein effizienter Mechanismus zur Erzeugung von CAR-T-Zellen der Forschungsstufe ist, aber da die langfristige Wirkung einer dauerhaften Integration von Cas9 in das Genom unbekannt ist, schlagen diese Methode vor, um den Nachweis der Konzeptforschung Car-T-Zellen zu entwickeln, aber nicht für die Herstellung guter Herstellungspraxis Grade CAR-T-Zellen.

Insbesondere beschreiben wir hier die Erzeugung von Granulozyten-Makrophagen-Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) Knockout CAR-T-Zellen, die auf menschliche CD19 abzielen. Diese CAR-T-Zellen wurden durch Transduktion mit lentiviralen Partikeln erzeugt, die eine Fürleitungs-RNA spezifisch für GM-CSF (Genname CSF2) und Cas9 kodieren. Wir haben zuvor festgestellt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 GM-CSFk/o CAR-T-Zellen ermöglichen die Hemmung von GM-CSF während des Herstellungsprozesses, wodurch die Produktion von GM-CSF effektiv reduziert wird und gleichzeitig die Antitumoraktivität und das Überleben von CAR-T-Zellen in vivo im Vergleich zu Wildtyp-CAR-T-Zellen verbessert werden. 12 Hier bieten wir daher eine Methodik zur Generierung von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB) und des Institutional Biosafety Committee (IBC) der Mayo Clinic.

1. CART19 Zellproduktion

  1. T-Zell-Isolierung, Stimulation und Ex-Vivo-Kultur
    1. Führen Sie alle Zellkulturarbeiten in einer Zellkulturhaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durch. Ernte peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) aus nicht identifizierten normalen Spenderblutkegeln, die während der Apherese gesammelt wurden, da diese bekanntermaßen eine lebensfähige Quelle von PBMCs sind.13
    2. Um PBMCs zu isolieren, fügen Sie 15 ml eines Dichtegradientenmediums zu einem 50 ml Dichtegradiententrennrohr hinzu. Verdünnen Sie das Spenderblut mit einem gleichen Volumen an phosphatgepufferter Saline (PBS), die 2% fetales Rinderserum (FBS) enthält, um Zellabfangen zu vermeiden.
      1. Fügen Sie das verdünnte Spenderblut aus dem Kegel in das Trennrohr, achten Sie darauf, nicht die Schnittstelle zwischen dem Blut und der Dichte Gradient medium stören. Zentrifuge bei 1.200 x g für 10 min bei RT.
      2. Den Überstand in ein neues 50 ml konisches Dekanat dekantieren, mit PBS + 2% FBS waschen, indem man bis zu 40 ml, Zentrifuge bei 300 x g für 8 min bei RT, Aspirat-Überstand, in 40 ml Puffer wieder aufsetzen und Zellen zählen.
    3. Isolieren Sie T-Zellen von PBMCs über ein magnetisches Perlenset mit negativer Auswahl mit einem vollautomatischen Zellabscheider gemäß dem Herstellerprotokoll.
    4. Um die isolierten T-Zellen zu kultiieren, bereiten Sie T-Zellmedium (TCM) vor, das aus 10% humanem AB-Serum (v/v), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin (v/v) und serumfreiem hämatopoetischem Zellmedium besteht. Sterilisieren Sie das Medium durch Filterung durch einen 0,45 m sterilen Vakuumfilter und dann mit einem 0,22 m sterilen Vakuumfilter.
    5. Am Tag 0 (dem Tag der T-Zellstimulation) CD3/CD28-Perlen vor der Stimulation von T-Zellen waschen. Zum Waschen das erforderliche Volumen der Perlen (verwenden Sie genügend CD3/CD28 Perlen für ein Verhältnis von 3:1 Perlen: T-Zellen; beachten Sie, dass die Konzentration der Perlen variabel sein kann) in einem sterilen 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und resuspendieren in 1 ml TCM.
    6. Mit einem Magneten in Kontakt setzen.
    7. Nach 1 min, saugen Sie die TCM und resuspend in 1 ml frische TCM, um die Perlen zu waschen.
    8. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Wähbe.
    9. Nach der dritten Wäsche, setzen Sie die Perlen in 1 ml TCM.
    10. Zählen Sie die T-Zellen.
    11. Übertragen Sie Perlen in die T-Zellen im Verhältnis 3:1-Perlen:Zellen.
    12. Verdünnung der Zellen bis zu einer Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml.
    13. Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für 24 h.
  2. T-Zell-Transfektion und Transduktion
    1. Durchführung von lentiviralen Arbeiten mit BSL-2+-Vorkehrungen, einschließlich Zellkulturhauben, persönlicher Schutzausrüstung und Desinfektion von gebrauchten Materialien mit Bleichmittel vor der Entsorgung.
    2. Erwerben Sie ein CART19-Konstrukt in einem lentiviralen Vektor.
      HINWEIS: Das cart19-Konstrukt, das hier verwendet wird, wurde entworfen und dann mit einem handelsüblichen Hersteller von Proteinsynthese synthetisiert. Das CAR-Konstrukt wurde anschließend unter der Kontrolle eines EF-1-Promotors in ein Lentivirus der dritten Generation geklont. Das Fragment der einzelnen Kette variabler Bereichswird wird vom FMC63-Klon abgeleitet und erkennt menschliche CD19. Das CAR19-Konstrukt verfügt über eine 4-1BB-Kostendomäne der zweiten Generation und CD3-Stimulation (FMC63-41BBz). 12
    3. Führen Sie die lentivirale Produktion wie zuvor beschrieben durch. 12
      1. Kurz gesagt, um Lentivirus zu produzieren, nutzen 293T Zellen, die 70-90% Konfluenz erreicht haben.
      2. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur von Transfektionsreagenzien, einschließlich 15 g des lentiviralen Plasmids von Interesse, 18 g eines Gag/Pol/Tat/rev-Verpackungsvektors, 7 g eines VSV-G-Hüllkurvenvektors, 111 Transfektionsreagenz und 9,0 ml des Transfektionsmediums vor Zugabe zu den 293T-Zellen. Dann kulturieren Sie die transfizierten Zellenbei 37 °C, 5% CO2 .
      3. Ernte, Zentrifuge (900 x g für 10 min), Filter (0,45 m Nylonfilter) und Konzentrat über Standarbeit bei 24 und 48 h durch Ultrazentrifugation bei 13.028 x g für 18 h oder 112.700 x g für 2 h.
      4. Bei -80 °C für die zukünftige Verwendung einfrieren.
    4. An Tag 1 die T-Zellen vorsichtig wieder aufsetzen, um die Rosetten von T-Zellen aufzubrechen, die an Tag 0 mit 1 x 106/ml stimuliert worden waren.
    5. Unter geeigneten BSL-2+-Vorkehrungen für alle lentiviralen Arbeiten fügen Sie den stimulierten T-Zellen frische oder gefrorene geerntete Viren bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 3,0 hinzu.
  3. CAR-T Zellerweiterung
    1. Während der Expansionsphase die transduzierten T-Zellen bei 37 °C, 5%CO2weiter inkubieren. Zählen Sie CAR-T-Zellen an den Tagen 3 und 5 und fügen Sie der Kultur frische, vorgewärmte TCM hinzu, um eine CAR-T-Zellkonzentration von 1 x 106/ml aufrechtzuerhalten.
    2. Entfernen Sie Perlen aus den transduced T-Zellen 6 Tage nach der Stimulation (Tag 6) mit einem Magneten. Ernte, Resuspend und Legen T-Zellen in 50 ml konischen Rohren in einem Magneten für 1 min. Dann sammeln Sie den Überstand (enthält die CAR-T-Zellen), und entsorgen Sie die Perlen.
    3. Stellen Sie die gesammelten CAR-T-Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml wieder in Kultur, um die Expansion wieder aufzunehmen.
    4. Bewerten Sie am 6. Tag die Oberflächenexpression der CAR durch Durchflusszytometrie.
      HINWEIS: Es können mehrere Methoden verwendet werden, um die Oberflächenexpression von CAR zu erkennen, wie z. B. die Färbung mit einem Ziegenanti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierten Sekundärantikörper oder durch Färbung mit einem CD19-spezifischen Peptid, konjugiert mit einem Fluorchrom. Hier nehmen Sie ein Aliquot (ca. 100.000 T-Zellen) aus der Kultur und waschen Sie mit Strömungspuffer, der mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzsäure, 2% fetalem Rinderserum und 1% Natriumazid zubereitet wird. Die Zellen mit dem Anti-CAR-Antikörper beflecken und zweimal waschen. Färben Sie die Zellen mit lebendem/totem Fleck und CD3 monoklonalen Antikörpern (OKT3). Waschen Sie die Zellen, und setzen Sie sie im Strömungspuffer wieder auf. Erwerben Sie auf einem Zytometer, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen.
  4. CAR-T-Zell-Kryokonservierung
    1. Um CAR-T-Zellen 8 Tage nach der Stimulation (Tag 8 der T-Zellexpansion) zu ernten und zu kryoservieren, ernten Sie die Zellen aus der Kultur.
    2. Spin down für 5 min bei 300 x g.
    3. Resuspend ieren im Gefriermedium bei 10 Millionen Zellen pro ml pro Durchstechflasche im Gefriermedium, bestehend aus 10% Dimethylsulfoxid und 90% fetalem Rinderserum.
    4. In einem Gefrierbehälter einfrieren, um eine Abkühlrate von -1 °C/min in einem Gefrierschrank von -80 °C zu erreichen, und dann nach 48 h in flüssigen Stickstoff geben.
    5. Vor ihrer Verwendung für In-vitro- oder In-vivo-Experimente, tauen CAR-T-Zellen in warmen TCM.
    6. Waschen Sie die Zellen, um das Dimethylsulfoxid zu verdünnen und zu entfernen und auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml in warmem TCM wieder aufzusetzen. Über Nacht bei 37 °C, 5% CO2ruhen.

2. GM-CSF k/o CART19 Produktion

  1. Um GM-CSF zu stören, verwenden Sie eine Guide-RNA (gRNA), die auf Exon 3 des humanen GM-CSF (CSF2) abzielt, das über Screening-gRNAs ausgewählt wurde, die zuvor eine hohe Effizienz für das CSF2-Gen haben sollen, das für das menschliche Cytokin GM-CSF kodiert. 14
    HINWEIS: Es wurde ein kommerziell synthetisiertes Forschungskonstruum Cas9 der dritten Generation verwendet, das diese gRNA (unter einem U6-Promotor) enthält. Das Konstrukt enthält ein Puromycin-Resistenzgen. Die Sequenz der gRNA ist GACCTGCCTACAGACCCGCC. 12
  2. Um Lentivirus zu produzieren, verwenden Sie 293T-Zellen, die 70-90% Konfluenz erreicht haben.
  3. Erlauben Sie 15 g des lentiviralen Plasmids von Interesse, 18 g eines Knebel-/Pol/Tat/rev-Verpackungsvektors, 7 g eines VSV-G-Hüllkurvenvektors, 111 l des vorkomplexenden Reagenzes, 129 l des Transfektionsreagenzes und 9,0 ml des Transfektionsmediums, um 30 min in Raum te Mperatur.
  4. Fügen Sie den 293T-Zellen Transfektionsreagenzien hinzu. Dann Kultur bei 37 °C, 5% CO2.
  5. Ernte, Zentrifuge (900 x g für 10 min), Filter (0,45 m Nylonfilter) und Konzentratüberstand bei 24 und 48 h durch Ultrazentrifugation bei 13.028 x g für 18 h oder 112.700 x g für 2 h und Einfrieren bei -80 °C für den späteren Einsatz.
  6. An Tag 1 die T-Zellen vorsichtig wieder aussetzen, um Rosetten aufzubrechen.
  7. In einem Von BSL-2+ zugelassenen Labor fügen Sie den stimulierten T-Zellen gefroreneoder oder frisch geerntete Viren hinzu, um CAR-T-Zellen zu erzeugen. Transduce T-Zellen mit dem CAR19 Lentivirus und GM-CSF, die auf das CRISPR-Lentivirus abzielen. Car19 lentivirus bei einem MOI von 3 hinzufügen. Da die Titration des CRISPR-Lentivirus nicht möglich war, verwenden Sie Viruspartikel, die aus einem 15-ug-Plasmidpräparat erzeugt wurden, um 10 x 106 T-Zellen zu transducieren.
  8. Sehen Sie sich die verbleibenden Schritte der T-Zellstimulation, -Dehnung und -Kryokonservierung an, wie in Schritt 1 erläutert.
  9. Für lentiCRISPR-bearbeitete T-Zellen mit Puromycinresistenz, behandeln Sie Zellen mit Puromycin-Dihydrochlorid in einer Konzentration von 1 g Puromycin pro 1 ml an Tag 3 und Tag 5 .

3. GM-CSF Störungeffizienz und funktionelle Bewertung von GM-CSF k/o CART19

  1. GM-CSF Disruption Efficiency: Tracking von Indels durch Zersetzung (TIDE) Sequenzierung und Analyse
    1. Um das Interesse am GEN-CSF-Gen zu sequenzieren, verwenden Sie die folgenden Primer. Verwenden Sie eine Vorwärtsprimersequenz für GM-CSF (CSF2) von TGACTACAGAGAGGCACAGA und eine Reverse Primer-Sequenz von TCACCTCTGACCTCATTAACC.
    2. Extrahieren Sie DNA aus bis zu 5 Millionen CAR-T-Zellen mit einem genomischen Extraktionskit. Für die PCR-Reaktion verwenden Sie 25 L eines Taq-Mastermix pro Reaktion mit einer Endkonzentration jedes Primers in der PCR-Reaktion von M, 0,1-0,5 g Vorlagen-DNA und einem Gesamtvolumen der PCR-Reaktion, die bis zu 50 l mit nukleasefreiem Wasser erreicht wird.
    3. Siehe die in Tabelle 1beschriebenen PCR-Zyklusbedingungen .
    4. Führen Sie PCR-Proben auf einem 1-2% Agarose-Gel bei 100 V für 30 min und extrahieren Sie mit einem Gel-Extraktions-Kit.
    5. Sequenz PCR-Amplicons. Berechnen Sie die Häufigkeit der Allelmodifikation, indem Sie Rohdaten in eine entsprechende TIDE-Software hochladen. 15
  2. GM-CSF Produktion und funktionelle Bewertung von GM-CSFk/o CART19
    1. Zur Bestimmung der Zytokinproduktion von CAR-T-Zellen, inkubieren Wildtyp CART19 Zellen und GM-CSFk/o CART19 mit dem CD19 exemitenkt akute lymphatolastische Leukämie-Zelllinie NALM6 im Verhältnis 1:5 für 4 h bei 37 °C, 5%CO2 in Gegenwart von Monensin Anti-Human CD49d, Anti-Human CD28 und Anti-Human CD107a.
    2. Ernten Sie Zellen aus der Kultur für Diedurchflusszytometrie. Waschen Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriepuffer. Färben Sie die Zellen mit einem lebenden/toten Färbeset. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min. Fixieren Sie die Zellen mit einem Fixierungsmedium und inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min.
    3. Nach dem Waschen die Zellen intrazellulär mit Permeabilisationsmedium in Kombination mit antihumanem, monoklonalen IFN-Antikörper, antihumanem GM-CSF, antihumanem MIP-1, Anti-Human IL-2 und Anti-Human-CD3 färben und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min. Waschen und setzen Sie die Proben wieder aus. Erfassen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer und analysiert auf den Prozentsatz der intrazellulären GM-CSF-Expression.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Reduktion von GM-CSF in GM-CSFk/o CART19-Zellen. Um zu überprüfen, ob das Genom der T-Zellen in Knockout GM-CSF verändert wurde, wurde tide Sequenzierung in den GM-CSFk/o CART19-Zellen verwendet (Abbildung 1A). Car-T-Zelloberflächenfärbung bestätigt, dass die T-Zellen den CAR-Oberflächenrezeptor erfolgreich in vitro exprimieren, indem sie auf lebende CD3+-Zellen gezerstäuben (

Diskussion

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methodik zur Nutzung der CRISPR/Cas9-Technologie, um sekundäre Modifikationen in CAR-T-Zellen zu induzieren. Insbesondere wird dies mit hilfe einer lentiviralen Transduktion mit einem viralen Vektor demonstriert, der gRNA enthält, die auf das Gen von Interesse und Cas9 zur Erzeugung von GM-CSFk/o CART19-Zellen abzielt. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 Wie bereits beschrie...

Offenlegungen

SSK ist ein Erfinder auf dem Gebiet der CAR T-Zell-Therapie, die an Novartis lizenziert sind (im Rahmen einer Vereinbarung zwischen Mayo Clinic, University of Pennsylvania und Novartis). Diese Studien wurden zum Teil durch ein Stipendium von Humanigen (SSK) finanziert. RMS, MJC, RS und SSK sind Erfinder von Patenten im Zusammenhang mit dieser Arbeit. Das Labor (SSK) wird von Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys und Actinium gefördert.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien von K12CA090628 (SSK), dem National Comprehensive Cancer Network (SSK), dem Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), der Predolin Foundation (SSK), dem Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) und das Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscienceInvitrogen17-0038-42
Choice Taq Blue MastermixDenville ScientificC775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2Beckman CoulterC10343flow cytometer
dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144 
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a BD Pharmingen555800
Fixation Medium (Medium A)InvitrogenGAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2
CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector:
pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number:
High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free
of charge)		GenScriptN/Acustom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
https://tide.nki.nl.Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; USCorning35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscienceInvitrogen47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Monensin Solution, 1000XBioLegend420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2BD Pharmingen559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10BD Pharmingen561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7BD Pharmingen560687
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Scientific5100-0001
NALM6, clone G5 ATCCCRL-3273acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free WaterPromegaP119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterileGenesee Scientific25-227
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uMThermo Scientific Nalgene450-0045
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), LiquidGibco31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2BD Horizon562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), LiquidGibco10378-016
Permeabilization Medium (Medium B)InvitrogenGAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182001
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421BD Horizon562930
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

Referenzen

  1. Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
  2. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
  6. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  7. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  8. Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  9. Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
  10. Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
  11. Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
  12. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
  13. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  14. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  15. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).

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