Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقة مفيدة للتوليف الأنزيمي على نطاق واسع وتنقية enantiomers محددة وregioisomers من ايبوكسيدات حمض الأراشيدونيك (AA)، وحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA)، وحمض eicosapentaenoic (EPA) مع استخدام السيتوكروم البكتيرية P450 انزيم (BM3).

Abstract

الأيض epoxidized من مختلف الأحماض الدهنية غير المشبعة (PUFAs)، يطلق عليها الأحماض الدهنية الايبوكسي، لديها مجموعة واسعة من الأدوار في علم وظائف الأعضاء البشرية. يتم إنتاج هذه الأيض الذاتية من قبل فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات. بسبب آثارها البيولوجية المتنوعة والقوية، هناك اهتمام كبير في دراسة هذه الأيض. تحديد الأدوار الفريدة لهذه الأيض في الجسم مهمة صعبة, كما يجب أولاً الحصول على الأحماض الدهنية الايبوكسي بكميات كبيرة وعالية النقاء. الحصول على مركبات من المصادر الطبيعية غالباً ما تكون كثيفة العمالة، وثنائي أكسيد الذوبان (sEH) بسرعة hydrolyze الأيض. من ناحية أخرى، الحصول على هذه الأيض عن طريق التفاعلات الكيميائية غير فعالة للغاية، وذلك بسبب صعوبة الحصول على regioisomers النقي وenantiomers، وانخفاض الغلة، وواسعة النطاق (ومكلفة) تنقية. هنا، نقدم تخليق الأنزيمية كفاءةمن 19 (S)، 20 (R) - و 16 (S)، 17 (R) - الأحماض الايبوكسي (R)-الايبوكسيدوسابنتانويك (EDPs) من إدارة الشؤون الإنسانية عن طريق الايبكسيد مع BM3، وهو إنزيم CYP450 البكتيرية معزولة أصلا من عصية megaterium (التي يتم التعبير عنها بسهولة في القولونية الإشريكية). يتم إجراء التوصيف وتحديد النقاء باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، والقياس الطيفي الكتلي (MS). يوضح هذا الإجراء فوائد التوليف الأنزيمي للأيضات الايبوكسي PUFA، وينطبق على الايبوكسيال الايبوكسي الأحماض الدهنية الأخرى، بما في ذلك حمض الأراشيدونيك (AA) وحمض eicosapentaenoic (EPA) لإنتاج الايبوكسيكوساتينويك المماثل الأحماض (EETs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs)، على التوالي.

Introduction

كما نمت الاهتمام في الدور الذي الأحماض الدهنية غير المشبعة (وخاصة أوميغا 3 وأوميغا 6 الأحماض الدهنية غير المشبعة) في البيولوجيا البشرية في السنوات الأخيرة، وقد أحاط الباحثون علما مجموعة واسعة من الفوائد الجذابة التي الأيض بهم المعرض. على وجه الخصوص، الأيض الأحماض الدهنية الايبوكسي التي تنتجها فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات كانت نقطة تركيز كبيرة. على سبيل المثال، تلعب العديد من الايبوكسيات الايبوكسية ، بما في ذلك الأحماض الايبوكسيكوساترينيويك (EETs) ، الأحماض الايبوكسيدوسابنتينويك (EDPs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs) ، دورا حاسما في تنظيم ضغط الدم والتهاب1،2 , 3 , 4 , 5. ومن المثير للاهتمام، ومن المعروف أن enantiomers محددة وregioisomers من أأ وإيبوكسيدات وكالة حماية البيئة أن لها آثار متفاوتة على مضيق الأوعية6،7. في حين تم توثيق الآثار الفسيولوجية للأنانتيومرات وregioisomers من EETs وEEJs، لا يعرف سوى القليل عن تأثير الأحماض الايبوكسي الايبوكسية المماثلة (EDPs) التي تشكلت من إدارة الشؤون الإنسانية. الاستخدام الواسع النطاق لزيت السمك8، وهو غني في كل من وكالة حماية البيئة وإدارة الشؤون الإنسانية ، كما أثار الاهتمام في EDPs9. ويعتقد أن فوائد هذه المكملات الغذائية جزئيا بسبب نواتج الأيض DHA المصب (16,17-EDP و 19,20-EDP كونها الأكثر وفرة) لأنه في مستويات الجسم الحي من EDPs تنسيق جيد جدا مع كمية من إدارة الشؤون الإنسانية في النظام الغذائي10, 11.

وقد ثبت دراسة آليات وأهداف هذه الأحماض الدهنية الايبوكسي من قبل الميتابولوميك، البيولوجيا الكيميائية، وغيرها من الأساليب تحديا، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها موجودة كخليط من regio- وستيريو الايزومرات، وطريقة للحصول على كميات نقية من مطلوب انانتيومرات وregioisomers. وقد ثبت أن الوسائل التقليدية لتوليف هذه المركبات كيميائيا غير فعالة. استخدام peroxyacids مثل حمض ميتاكلوروبروكسي بنزويك للإبكسيدات له العديد من العيوب، ولا سيما عدم الانتقائية إبكسيدون، مما يتطلب تنقية مكلفة ومضنية من regioisomers الفردية وenantiomers. التوليف الكلي للإدارة ووكالة حماية البيئة المستقلات ممكن, ولكن يعاني أيضا من العيوب التي تجعل من غير العملي لتركيب على نطاق واسع مثل ارتفاع التكاليف وانخفاض الغلة12,13. يمكن تحقيق كفاءة الإنتاج العام مع التوليف الأنزيمي، كما ردود الفعل الأنزيمية هي regio- وstereoselective14. تظهر الدراسات أن الايبكسيد الأنزيمي لAA وEPA (مع BM3) هو على حد سواء regioselective وenantioselective15،16،17،18، ولكن هذا الإجراء لم يتم اختباره مع إدارة الشؤون الإنسانية ، أو على كبير نطاق. وكان الهدف العام من أسلوبنا لتوسيع وتحسين هذا الايبوكسيد chemoenzymatic لإنتاج كميات كبيرة بسرعة من الأحماض الدهنية الايبوكسي النقية كما enantiomers الفردية الخاصة بهم. باستخدام الطريقة المعروضة هنا، والباحثين الوصول إلى استراتيجية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتركيب EDPs وغيرها من الأيض الايبوكسي بوفا.

Protocol

تحذير: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.

1. التعبير عن البرية من نوع BM3

  1. التلقيح PBS-BM3 المصابة DH5α E. القولونية (تبرع سخي من الدكتور F. آن ووكر) في 5 مل من مرق LB معقمة مع 0.5 ملغ من الأمبيسلين وأضاف في أنبوب ثقافة 20 مل.
  2. احتضان ثقافة الخلية في شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. إضافة ثقافة بداية بين عشية وضحاها (5 مل) و 100 ملغ من الأمبليسلين إلى 1 لتر من مرق LB معقمة في قارورة فيرنباخ أو Erlenmeyer. هز عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة، ثم عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة.
  3. جمع والطرد المركزي للخلية في 4 ° C لمدة 10 دقيقة في 1000 x ز. تخلص من supernatant وتخزين بيليه الخلية في -78 درجة مئوية حتى تنقية الإنزيم.
    ملاحظة: يمكن تعقيم الـ supernatant كيميائياً عن طريق المعالجة بمادة التبييض أو تعقيمها باستخدام الأوتوكلاف ثم سكب هاوية.

2. تنقية BM3.

  1. خلية الليسة
    1. قم بذوبان كريات الخلية على الجليد وإعادة تعليقها في 40 مل من الباردة الجليد (4 درجة مئوية) الذوبان العازلة (10 m تريس، 0.01 m فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF;)، 0.01 m EDTA؛ درجة الحموضة 7.8).
      تحذير: PMSF سامة عن طريق الاتصال.
    2. بينما على الجليد، سونيكيت الخلايا لمدة 1 دقيقة مع المجانسب بالموجات فوق الصوتية (إخراج السلطة الإعداد 10، واجب 100٪)، تليها كسر 1 دقيقة على الجليد من أجل lyse الخلايا. كرر هذا الإجراء 6 مرات. جهاز طرد مركزي للخلية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 11000 x ز إلى الحطام خلية بيليه.
  2. اللوني
    1. إعداد عمود لوني تبادل أنيون قوي (انظر جدولالمواد؛ القطر: 2.8 سم x 6 سم، حجم العمود: 37 مل) عن طريق غسل مع 5 مجلدات العمود (CV) من العازلة A (10 mM تريس، ودرجة الحموضة 7.8) في 4 درجة مئوية.
    2. إضافة lysates الخلية إلى عمود مُحَقَدّة ويغسل العمود مع 3 CV من العازلة الباردة A. Elute the BM3 عن طريق غسل العمود مع العازلة الباردة B (10 m Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
    3. جمع جزء المحمر البني الإلوين. إذا لم يتم استخدام البروتين على الفور، ومزجه مع حجم متساو من الجلسرين وتجميد فلاش مع النيتروجين السائل. تخزين الحل المجمدة في -78 درجة مئوية.

3. الايبأكسد من إدارة الشؤون الإنسانية من BM3

  1. إعداد رد الفعل عن طريق إضافة 0.308 ز (0.940 مليمول) من إدارة الشؤون الإنسانية في 18.8 مل من ثنائي ميثيل سولفسيد (DMSO) إلى 2 لتر من التحريك العازلة رد فعل (0.12 M فوسفات البوتاسيوم، 5 mM MgCl2، ودرجة الحموضة 7.4) جنبا إلى جنب مع 20 طن من الإنزيم BM3 ذوبان. يمكن تحديد تركيز الإنزيم بواسطة أول أكسيد الكربون/طريقةالفحص الطيفي 19 .
  2. بينما الحل هو اثارة، تبدأ رد الفعل بإضافة 1 ما يعادل NADPH (نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد الفوسفات خفض، ملح رباعي الصوديوم، 0.808 ز، 0.940 مليمول) إذا حل في العازلة رد الفعل. حرك رد الفعل لمدة 30 دقيقة بينما يُسكب الهواء من خلال خليط التفاعل مع منطاد مملوء بالهواء موصول بحقنة وإبرة.
  3. باستخدام مطياف (انظر جدولالمواد)، تحقق من امتصاص خليط التفاعل في 340 نانومتر لتحديد ما إذا كان قد استنفد NADPH. إذا لم يكن هناك امتصاص المتبقية تشير إلى استهلاك NADPH، رد فعل كامل.
    ملاحظة: عادة، رد فعل كاملة بعد 30 دقيقة.
  4. تُقَدّر مزيج التفاعل بإضافة حمض الأكساليك 1 م ببطء، وينخفض، حتى يصل درجة الحموضة للمحلول إلى 4.

4. استخراج EDPs

  1. استخراج محلول العازلة مروي مع 2 لتر من الأثير ثنائي الإيثيل (لامائية، بيروكسيد خالية) 3 مرات. جمع طبقة الأثير (6 لتر) والجافة مع كبريتات المغنيسيوم اللامائية (MgSO4).
  2. قم بتصفية MSO4 من المحلول وتركيز طبقة الأثير المجفف على المبخر الدوار لينتج بقايا EDP الخام.
  3. تنقية بقايا بواسطة الكروماتوغرافيا عمود فلاش (خرطوشة السيليكا 40 غرام كافية). ابدأ في خلات الإيثيل بنسبة 10% (EtOAc) في الهكسان ونزيد من نسبة الإياتوا كست إلى 60% في الهكسان خلال 22 دقيقة.
    ملاحظة: يتم الحصول على ثلاث قمم رئيسية وجمعها، وeluting في ترتيب 1. غير رد فعل هيئة الصحة بدبي. 2. خليط من ايزوميرات EDP؛ و3. ثنائي الايبوكسيد (المنتجات العادية فوق الأكسدة (انظر الشكل1)).
  4. الجمع بين الكسور وتركيزها على المبخر الدوار. من هذا المثال، 0.074 غرام، (24%) من DHA غير مردّة، 0.151 غرام (47%) من الأيزومرات EDP، و 0.076 غرام، (22٪ من ثنائي ايبوكسيد تم الحصول عليها.

5. استراتيشن من EDPs،فصل 16 (S)، 17 (R) - و 19 (S)، 20 (R)-EDP، وتصبب من استرات

تحذير: ثلاثي ميثيل سيلديازوميثان (TMS-ديازوميثان) سام جداً عن طريق كل من الاتصال والاستنشاق. استخدم فقط في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

  1. تمييع الايبوكسيد (0.151 غرام، 0.435 مليمول) في قارورة مستديرة القاع أو قارورة صغيرة مع 2 مل من الميثانول اللامائي (MeOH) و 3 مل من التولوين اللامائية، إضافة شريط، وإضافة TMS-ديازوميثان (1.2 معادل الضرس، أو 0.26 مل من محلول 2 M في الأرجون) تحت الأرجون.
  2. انتظر 10 دقيقة وأضف المزيد من TMS-diazomethane (0.050 مل) حتى يبقى لون أصفر شاحب.
  3. بعد 30 دقيقة، ركز بعناية الخليط باستخدام المبخر الدوار وتنقية بقايا عن طريق الكروماتوغرافيا عمود فلاش. Elute مع 4٪ EtOAc في هيكسان (باستخدام 40 غرام هلام السيليكا العمود أو خرطوشة) لمدة 22 دقيقة. في هذا المثال، 19,20-EDP ميثيل استر (0.116 غرام, 74%) و 16,17-EDP-ميثيل إستر (0.029 غرام, 19%), تم الحصول على كزيوت واضحة (إجمالي الغلة, 93%).
  4. جمع الكسور التي تحتوي على REGIOISOMERS EDP استر الميثيل تنقية. 19(S)، 20 (R) - EDP ميثيل استر elutes أولا، تليها 16 (S)، 17 (R) - إدب استر الميثيل.
  5. إذا بقيت أي كسور مختلطة (تحتوي على كلا الأيزومرات؛ ويمكن تقييمها عن طريق الكروماتوغرافيا الرقيقة الطبقة (TLC) في8:1 الهكسان/EtOAc وملطخة ببرمنغنات البوتاسيوم (KMnO 4) )، إعادة كروماتوغراف لهم مع نفس نظام المذيبات كما كان من قبل.
  6. تركيز الكسور التي تحتوي على regioisomers الفردية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تقييم الهوية والنقاء بواسطة NMR (باستخدام CDCl3 كمذيب؛ انظر وسيلة الإيضاح للشكل2).
  7. لتحويل الجيويومرات إستر الميثيل EDP الفردية إلى أشكال حمضها، تمييع استر EDP في THF: المياه (حوالي 0.7 مل/0.1 مل مول من إستر). أضف 2 م ليوه مائي (3 مكافئات من الضرس) وحركبين بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يمكن تقييم اكتمال رد الفعل بواسطة TLC، باستخدام 3:1 هيكسان/EtOAc، تلطيخ مع KMnO4؛ المنتج لديه معامل استبقاء 0.3~ .
  8. تُروي ردّة الفعل ببطء بحمض الفورميك، حتى يصل درجة الحموضة في الخليط إلى 3-4. إضافة الماء وخلات الإيثيل (1-2 مل /0.100 مل مول من استر) وفصل الطبقات. استخراج طبقة المياه مع EtOAc (3 × 5 مل)، وغسل مع محلول ملحي مشبع (كلوريد الصوديوم) الحل، وتجفيف طبقة EtOAc على كبريتات الصوديوم اللامائية (نا2SO4).
  9. تركيز محلول خلات الإيثيل باستخدام المبخر الدوار، إضافة هيكسان (10 مل) والتركيز مرة أخرى. كرر مرتين لإزالة حمض الفورميك المتبقية. تنقية بقايا عن طريق الكروماتوغرافيا عمود فلاش، الاستخلاص مع 10-30٪ EtOAc أكثر من 15 دقيقة.
  10. تركيز الكسور المطلوبة وجافة في vacuo لتحمل حمض تنقية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تقييم نقاء الأنانتيوميري (بواسطة chiral HPLC، انظر أساطير الشكل 3 - الشكل 4 للعمود والشروط). ويمكن تقييم النقاء الكيميائي بواسطة C18 (achiral) HPLC (انظر جدول المواد والمرجع 14).

النتائج

ويرد في الشكل 1كروماتوغرام عمود الفلاش (الذي يتم تنفيذه باستخدام نظام تنقية الفلاش الآلي كما هو موضح أدناه) عند تنقية الخليط الخام من الأيبكسيد الأنزيمي . بعد استراتيشن وفصل regioisomers، نقية16 (S)، 17 (R)-EDP و 19 (S)، 20 (R) - EDP تم الحصول على استرات الميثيل....

Discussion

نحن نقدم هنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة من الناحية التشغيلية لإعداد اثنين من الأيض الايبوكسي الأكثر وفرة من إدارة الشؤون الإنسانية - 19،20 و 16،17-EDP. هذه الأحماض الدهنية الايبوكسي يمكن إعدادها في enantiopure للغاية (كما S، R-isomers) باستخدام الإنزيم BM3 من نوع البرية. ويرد أدناه وصف العديد من ...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

ويمول هذا العمل من قبل R00 ES024806 (المعاهد الوطنية للصحة)، DMS-1761320 (المؤسسة الوطنية للعلوم) وصناديق بدء التشغيل من جامعة ولاية ميشيغان. يرغب المؤلفون في شكر الدكتور جون يانغ (جامعة كاليفورنيا في ديفيس) ولاليتا كرشالا (جامعة ولاية ميتشيغان) على مساعدتهم في تحسين التفاعل الأنزيمي، والدكتور توني شيلميلر (مرفق قياس الطيف الكتلي وMetabolomics) للحصول على المساعدة في الحصول على بيانات إدارة الموارد البشرية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium BicarbonateSigma9830NA
AmpicillinGoldBioA30125NA
Anhydrous magnesium sulfateFisher ScientificM65-3NA
Anhydrous methanolSigma-Aldrich322515NA
Anhydrous sodium sulfateFisher ScientificS421-500NA
Anhydrous tolueneSigma-Aldrich244511NA
Arachidonic Acid (AA)Nu-Chek PrepU-71AAir-sensitive. 
Diethyl EtherSigma296082NA
DMSO (molecular biology grade)Sigma-AldrichD8418NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)Nu-Chek PrepU-84AAir-sensitive. 
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Invitrogen15576028NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)Nu-Chek Prep U-99AAir-sensitive. 
Ethyl acetateSigma 34858NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizesFisher Scientific145170203, 145154064, 5170200Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)J.T. Baker0128-01NA
GlycerolSigmaG7757NA
HexanesVWRBDH24575NA
LB BrothSigmaL3022NA
Lithium hydroxideSigma-Aldrich442410NA
Magnesium chlorideFisher Scientific2444-01NA
Methanol (HPLC grade)Sigma-Aldrich34860-41-RNA
NADPH Tetrasodium SaltSigma-Aldrich481973Air-sensitive. 
Oxalic acidSigma-Aldrich194131NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coliNANANA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)SigmaP7626Toxic!
Potassium PermanganateSigma-Aldrich223468For TLC staining. 
Potassium phosphate dibasicSigma795496NA
Potassium phosphate monobasicSigma795488NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)Fisher Scientific17-0515-01For anion exchange purification of enzyme
Sodium ChlorideSigma71376NA
Tetrahydrofuran, anhydrousSigma-Aldrich186562NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)Sigma-Aldrich362832Very toxic. 
Tris-HClGoldBioT-400NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detectorShimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer Thermo-Fisher Scientific
NMRNMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporatorBuchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizerCole-Parmer

References

  1. Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
  2. Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
  3. Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
  4. Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
  5. Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
  6. Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
  7. Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
  8. Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. . Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).
  9. Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
  10. Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
  11. Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
  12. Khan, M. A., Wood, P. L. . Method for the synthesis of DHA. , (2012).
  13. Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
  14. Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
  15. Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
  16. Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
  17. Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
  18. Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
  19. Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
  20. . Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019)
  21. Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148enantioselective3eicosanoids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved