도코사헥사에노믹, 에이코사펜타에노믹, 아라키돈산의 에폭시화된 대사산물의 효소 합성

요약

우리는 세균성 시토크롬을 사용하여 아라키돈산(AA), 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜테노산(EPA)의 특정 상악제 및 레지오이좀의 대규모 효소 합성 및 정제에 유용한 방법을 제시합니다. P450 효소 (BM3).

초록

다양한 불포화 지방산 (PUFAs)의 에폭시화 대사 산물은 에폭시 지방산이라고 불리우며 인간 생리학에서 광범위한 역할을 합니다. 이 대사 산물은 효소의 시토 크롬 P450 클래스에 의해 내인성으로 생산됩니다. 그들의 다양 하 고 강력한 생물학적 효과 때문에, 이러한 대사 산물 공부에 상당한 관심이 있다. 에폭시 지방산이 먼저 상당한 양과 높은 순도로 얻어져야하기 때문에 신체에서 이러한 대사 산물의 독특한 역할을 결정하는 것은 어려운 작업입니다. 천연 공급원으로부터 화합물을 얻는 것은 종종 노동 집약적이며 수용성 에폭사이드 하이드로 라제 (sEH)는 대사 산물을 빠르게 가수 분해합니다. 다른 한편으로는, 화학 반응을 통해 이러한 대사 산물을 얻는 것은 매우 비효율적입니다, 순수한 regioisomers 및 상체 물질을 얻기의 어려움으로 인해, 낮은 수율, 광범위한 (고가의) 정제. 여기에서, 우리는 BM3를 가진 에폭시를통해 DHA에서 19(S),20(R)-및 16(S),17(R)-에폭시도코펜타에노산(EDPs)의 효율적인 효소 합성을 제시합니다, 원래 바실러스에서 분리된 세균 CYP450 효소 megaterium (즉, 쉽게 대장균에표현된다). 순도의 특성화 및 측정은 핵 자기 공명 분광법 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 질량 분석법 (MS)으로 수행됩니다. 이 절차는 PUFA 에폭시 대사 산물의 효소 합성의 이점을 설명하고, 유사한 에폭시에이코사이코노레이노어를 생성하는 아라키돈산(AA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 포함한 다른 지방산의 에폭시화에 적용가능하다. 산 (EETs) 및 에폭시에이코에테라에노산(EEQs).

서문

고도 불포화 지방산 (특히 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산)이 인간 생물학에서 재생하는 역할에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 증가함에 따라, 연구자들은 자신의 대사 산물이 매력적인 혜택의 넓은 범위의 주의를 촬영하고있다 전시. 특히, 효소의 시토크롬 P450 클래스에 의해 생성된 에폭시 지방산 대사산물은 큰 초점포인트가 되어 왔다. 예를 들어, 에폭시에코사트리노산(EETs), 에폭시도코사펜타에노산(EDPs) 및 에폭시코사테라에노산(EEQs)을 포함한 많은 PUFA 에폭산화물은 혈압 및 염증조절에 중요한 역할을 합니다 1,^{2 , 3개 , 4개 , 5}. 흥미롭게도, AA 및 EPA 에폭사이드의 특정 상체및 레지오머는 혈관 수축에 다양한효과를 가지는 것으로 알려져 있다 6,⁷. EET및 EEQs의 상체및 레지오좀의 생리학적 효과는 문서화되었지만, DHA로부터 형성된 유사한 에폭시도코사펜타에노산(EDPs)의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. EPA와 DHA가 풍부한 피시 오일^8의광범위한 사용은 EDP^9에대한 관심을 불러 일으켰습니다. 이러한 보충제의 혜택은 부분적으로 다운스트림 DHA 대사 산물로 인해 것으로 추정된다 (16,17-EDP 와 19,20-EDP는 가장 풍부한 되는) EDP의 생체 내 수준은 다이어트에 DHA의 양과 아주 잘 조정하기 때문에^{10, 11}.

대사체학, 화학 생물학 및 기타 방법에 의한 이러한 에폭시 지방산의 메커니즘과 표적을 연구하는 것은 레지오-및 스테레오 이성물질의 혼합물로 존재하기 때문에 부분적으로 도전적인 것으로 입증되었으며, 순수한 양의 지방을 얻는 방법 적분자 및 레지아이좀이 필요합니다. 화학적으로 이러한 화합물을 합성 하기 위한 전통적인 수단 효과가 입증 되었습니다. 에폭시화를 위한 메타-클로로페록시벤조산과 같은 페록시산의 사용은 많은 단점, 특히 개별 레지오이좀제와 상각체의 고가의 고된 정제를 필요로 하는 에폭시화 선택성의 부족이 있다. DHA 및 EPA 대사산물의 총 합성이 가능하지만, 또한 높은 비용과 낮은 수율^12,13과같은 대규모 합성에 비실용적만드는 단점을 앓고 있다. 효소 반응이 레지오-및 스테레오셀렉티브(14)이기 때문에 효소합성으로 효율적인 전체 생산을 달성할 수 있다. 연구 결과에 따르면 AA와 EPA(BM3)의 효소 에피시형성은 재지오선택적 및 enantioselective^15,16,17,18,그러나 이 절차는 DHA로 시험되지 않았거나 큰 규모. 우리의 방법의 전반적인 목표는 그들의 개별 enantiomers로 순수한 에폭시 지방산의 상당한 양을 급속하게 생성하기 위하여 이 화학 요법 에폭시를 확장하고 낙관하는 것이었습니다. 여기에 제시 된 방법을 사용하여, 연구원은 EDP 및 기타 PUFA 에폭시 대사 산물의 합성을위한 간단하고 비용 효율적인 전략에 액세스 할 수 있습니다.

프로토콜

주의: 나열된 화학물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오.

1. 야생형 BM3의 식

1. 접종 pBS-BM3 DH5α 대장균 (박사 F. 앤 워커의 관대 한 기부) 5 mL의 멸균 LB 국물 0.5 mg의 암피실린을 20 mL 배양 튜브에 첨가했습니다.
2. 200 rpm에서 24 시간 동안 37 °C에서 셰이커에서 세포 배양을 배양합니다. 펀바흐 또는 에를렌마이어 플라스크에 밤새 스타터 배양(5 mL)과 암피실린 100 mg을 멸균 LB 국물 1L에 넣습니다. 200 rpm에서 6 시간 동안 37 °C에서 흔들어, 200 rpm에서 18 시간 동안 30 °C에서 흔들어.
3. 세포 배양을 4°C에서 10분 동안 1,000 x g에서수집하고 원심분리한다. 상온액을 버리고 효소 가정제될 때까지 세포 펠릿을 -78°C에서 저장한다.
   참고 : 상판은 표백제로 처리하여 화학적으로 살균되거나 오토 클레이브를 사용하여 살균 한 다음 배수구를 부어 줄 수 있습니다.

2. BM3의 정화.

1. 세포 라해스
   1. 얼음에 세포 펠릿을 해동하고 얼음 감기 (4 °C) 용해 완충제 (10 mM Tris, 0.01 mM 페닐메틸설포닐 불소 (PMSF;), 0.01 mM EDTA; pH 7.8)의 40 mL에서 다시 중단합니다.
      주의: PMSF는 접촉시 독성이 있습니다.
   2. 얼음 위에있는 동안 초음파 균질화 (출력 전력 설정 10, 의무 100 %)로 1 분 동안 세포를 초음파 처리한 다음 세포를 용해시키기 위해 얼음에 1 분 간 휴식을 취합니다. 이 절차를 6번 반복합니다. 세포를 4°C에서 30분 동안 11,000 x g에서 펠릿 세포 파편으로 용해시한다.
2. 선호도 크로마토그래피
   1. 4°C에서 완충A(10 mM Tris, pH 7.8)의 5개의 컬럼 부피(CV)로 세척하여 강한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(재료 표참조, 직경: 2.8 cm x 6 cm, 컬럼 부피: 37 mL)을 준비합니다.
   2. 세포가 평형 컬럼에 용해를 추가하고 차가운 버퍼 A. 차가운 버퍼 B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV)로 컬럼을 세척하여 BM3를 용이시성하는 3 CV로 컬럼을 세척합니다.
   3. 적갈색 용리액 분율을 수집합니다. 단백질을 즉시 사용하지 않는 경우, 글리세롤의 동일한 부피와 혼합하고 액체 질소와 플래시 동결. 냉동 용액을 -78 °C에 보관하십시오.

3. BM3에 의한 DHA의 에폭증

1. 18.8 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 DHA 0.308 g(0.940 mmol)을 첨가하여 2L의 교반 반응 완충액(0.12 M 칼륨인산염, 5 mM MgCl 2, pH 7.4)과 함께 해동된 BM3 효소의 20 nM을 첨가하여 반응을 준비한다. 상기 효소 농도는 일산화탄소/디티오네이트 스펙트럼 분석법^19에의해 결정될 수 있다.
2. 용액이 교반되는 동안, 반응 완충액에 용해된 NADPH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 감소, 테트라소듐 염, 0.808 g, 0.940 mmol)의 1동등한 를 첨가하여 반응을 시작한다. 주사기와 바늘에 부착된 공기 채워진 풍선으로 반응 혼합물을 통해 공기를 버블링하면서 30 분 동안 반응을 저어줍니다.
3. 분광광도계(재료 표참조)를 사용하여 340 nm에서 반응 혼합물의 흡광도를 확인하여 NADPH가 고갈되었는지 확인합니다. NADPH의 소비를 나타내는 남은 흡광도가 없는 경우, 반응이 완료됩니다.
   참고 : 일반적으로 반응은 30 분 후에 완료됩니다.
4. 용액의 pH가 4에 도달 할 때까지 1 M 옥살리산을 드롭 와이즈로 천천히 첨가하여 반응 혼합물을 담금질하십시오.

4. EDP 추출

1. 2 L의 디에틸 에테르 (무수, 과산화수소가없는)로 담금질 완충액을 3 회 추출합니다. 에테르층(6L)을 수집하고 무수 황산마그네슘(MgSO 4)으로 건조한다.
2. 용액으로부터 MgSO 4를 걸러내고 건조된 에테르 층을 로터리 증발기 위에 농축하여 조EDP 잔류물을 생성한다.
3. 플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화합니다(40 g 실리카 카트리지가 충분함). 헥산에서 10% 에틸 아세테이트(EtOAc)에서 시작하여 22분 이상 헥산에서 최대 60% EtOAc까지 램프합니다.
   참고 : 세 가지 주요 피크를 획득하고 수집, 1의 순서로 용리. 미반응 DHA; 2. EDP 이소미의 혼합물; 3. 디에폭사이드(일반 과산화 제품)(그림 1참조).
4. 분수를 결합하고 회전 증발기에 집중. 이 예에서, 0.074 g, (24%) 반응하지 않은 DHA, 0.151 g (47%) EDP 이소미, 0.076 g, (22%) 디에폭사이드를 얻었다.

5. EDP의 에스테르화, 16 (S),17 (R)- 및 19 (S), 20 (R)-EDP 및 에스테르의 사포화의 분리

주의: 트리메틸실릴디아조메탄(TMS-디아조메탄)은 접촉과 흡입 모두에 의해 매우 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비가있는 연기 후드에서만 사용하십시오.

1. 무수 탄올(MeOH) 및 무수 톨루엔 3 mL의 2 mL로 둥근 바닥 플라스크 또는 작은 바이알에 에폭신(0.151 g, 0.435 mmol)을 희석하고, 교반바를 추가하고, TMS-다이아조메탄(1.2 어금니골 등가물, 또는 0.26 ml의 2m) 아액에 넣은 다.
2. 10분 간 기다렸다가 옅은 노란색이 유지될 때까지 TMS-디아조메탄(0.050 mL)을 추가합니다.
3. 30 분 후, 조심스럽게 회전 증발기를 사용하여 혼합물을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 잔류 물을 정화한다. 헥산에 4% EtOAc(실리카 젤 컬럼 또는 카트리지 40g 사용)을 22분 동안 사용하여 용루합니다. 이 예에서, 19,20-EDP 메틸 에스테르 (0.116 g, 74%) 및 16,17-EDP 메틸 에스테르(0.029 g, 19%), 투명 오일(총 수율, 93%)으로 수득하였다.
4. 정제된 EDP 메틸 에스테르 레지아좀을 함유하는 분획물을 수집한다. 19(S),20(R)-EDP 메틸 에스테르를 먼저, 16(S),17(R)-EDP 메틸 에스테르가 뒤따른다.
5. 혼합 분획이 남아 있는 경우(이성물질을 모두 함유하고, 8:1 헥산/EtOAc에서 박층 크로마토그래피(TLC)로 평가할 수 있고, 과망간산 칼륨(KMnO 4)으로 염색됨)을 이전과 동일한 용매 시스템으로 다시 크로마토그래피합니다.
6. 개별 레지오이솜을 함유하는 분획을 집중시다.
   참고: 이 시점에서, 정체성 및 순도는 NMR에 의해 평가될 수 있다(CDCl 3을 용매로 사용; 도2에 대한 범례 참조).
7. 개별 EDP 메틸 에스테르 regioisomers를 그들의 산 형태로 변환하려면, THF에서 EDP 에스테르를 희석 : 물 (에스테르의 약 0.7 mL / 0.1 mmol). 수성 LiOH 2M(어금니 3개)을 넣고 밤새 저어줍니다.
   참고 : 반응의 완전성은 TLC에 의해 평가 될 수있다, 사용하여 3:1 헥산 / EtOAc, KMnO 염색_4; 제품의 유지율은 ~0.3입니다.
8. 혼합물의 pH가 3-4에 도달 할 때까지 포믹 산으로 천천히 반응을 담금질하십시오. 물과 에틸 아세테이트 (에스테르의 1-2 mL / 0.100 mmol)를 추가하고 층을 분리합니다. EtOAc (3 x 5 mL)로 물 층을 추출하고 포화 염수 (NaCl) 용액으로 씻고 무수황산 나트륨 (Na2 SO 4)을 통해 EtOAc 층을 건조시십시오.
9. 회전 증발기로 에틸 아세테이트 용액을 농축하고 헥산 (10 mL)을 추가하고 다시 농축하십시오. 잔류 포산을 제거하여 아제오열대지방으로 두 번 반복합니다. 15분 동안 10-30% EtOAc로 용출하여 플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화합니다.
10. 원하는 분획을 농축하고 정제산을 감당하기 위해 진공에서 건조시다.
    참고: 이 단계에서, 영항성 순도는 평가될 수 있다(키랄 HPLC에 의해, 도 3에 대한 범례 참조 - 열 및 조건에 대한 그림 4). 화학적 순도는 C18(chiral) HPLC에 의해 평가될 수 있다(재료 표 및 참조 14 참조 참조).

결과

효소 에폭시화로부터 원유 혼합물의 정제시 얻어진 플래시 컬럼 크로마토그램(아래와 같이 자동화된 플래시 정제 시스템을 사용하여 수행됨)은 도1에 나타내었다. 레지오이머의 에스테르화 및 분리에 이어,순수한 16(S),17(R)-EDP 및 19(S),20(R)-EDYl 에스테르를 수득하였다. 전형적으로, 이들은 대략 1:4 대 1:5 비율로 존재하며, 주?...

토론

우리는 DHA의 두 가지 가장 풍부한 에폭시 대사 산물을 준비하기위한 운영적으로 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시 - 19,20 및 16,17-EDP. 이러한 에폭시 지방산은 야생형 BM3 효소를 사용하여 고도로 에난티오퓨어(S,R-이솜) 형태로 제조될 수 있다. 문제 해결에 사용될 수 있는 몇 가지 중요한 점과 AA 및 EPA의 enantiopure 에폭시 대사 산물을 준비하는 우리의 방법의 확장은 아래에 설명되어 있습니...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer